应用卵丘细胞复合物优选精子的方法
【专利摘要】本发明公开了一种应用卵丘细胞复合物优选精子的方法：①取卵当日，部分卵丘细胞复合物，置于培养箱内备用；②ICSI患者精液经常规离心法洗涤后，置于培养箱内备用；③ICSI操作前1?2h，将留取的卵丘细胞复合物置于ICSI操作皿的b区，用拉制好的巴斯管将卵丘细胞铺满b区，在液滴边缘部分将卵丘细胞外延；将洗涤处理完毕的精子加入ICSI操作皿的a区；b区铺设卵丘细胞复合物必须达到以下要求：a区精子要到达C区的唯一路径，便是穿过b区的卵丘细胞复合物；④ICSI操作时，在C区进行精子制动。应用本发明能有效的筛选出优质精子，能显著提高ICSI患者的卵子受精率、囊胚形成率和卵子利用率，提高了胚胎的发育潜能。
【专利说明】
应用卵丘细胞复合物优选精子的方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种优选精子的方法，尤其是一种应用卵丘细胞复合物优选精子的方法。
【背景技术】
[0002]ICSI(Intracytoplasmic sperm inject1n)即卵胞楽内单精子显微注射技术，也就是第二代“试管婴儿”，该技术是借助显微操作系统将单一精子注射入卵子内使其受精。
[0003]ICSI的成功率很大程度上受精子质量准备和显微操作技术的影响。ICSI是男性不育症的有效治疗方法，活产率约为30-35%。自1996年第一对夫妇成功使用卵浆内单精子显微注射术诞下一女后，卵浆内单精子注射术受到了全世界的关注。目前，全国已有大约10万不孕不育夫妇通过胞浆内单精子注射术实现了拥有自己宝宝的梦想。
[0004]自从1992年ICSI技术的引入，彻底改变了因男性因素导致的不孕不育的治疗结局，尤其对于严重少、弱、畸精和无精症患者来说，是一项革命性的福利。然而，相比于常规体外受精(in vitro fertilizat1n，IVF)技术，ICSI技术规避了自然受精过程中精子与卵子结合的选择过程，因此有可能将不成熟、功能紊乱、染色体异常的精子用于授精，增加了遗传缺陷传给下一代的风险。
[0005]目前已有众多的研究表明:来源于ICSI的胚胎发育潜能比常规IVF差;ICSI来源的后代的遗传缺陷发生比率高于常规IVF来源的后代。研究表明这可能与父源因子-用于ICSI的精子缺陷有关。理论上，胚胎的发育受精子与卵子质量的影响。在早期胚胎的前2次分裂主要受母源基因调控，而当胚胎发育到4-8细胞后，胚胎基因组激活，父源基因组开始发挥作用。因此异常的精子可能降低后期胚胎发育潜能以及影响临床结局。已有许多研究报道精子质量与ART助孕妊娠结局相关。因此，提高ICSI助孕的安全性和有效性的关键是选择“优质”的精子用于受精。而如何选择“优质”精子则是首要解决的技术难题。
[0006]目前，国内外关于筛选优质精子的报道有透明质酸法筛选膜成熟精子、超高倍镜下(6000 X )形态选择法选择细胞形态和部分细胞器正常的精子、磁性活化细胞分选系统筛选无凋亡精子以及偏振光显微镜利用精子双折射特性筛选成熟精子等方法。但截至目前为止，对于这些筛选方法的有效性依然缺乏大样本的前瞻性随机对照研究且由于这些技术本身或筛选物质存在一定的安全隐患。因此这些方法对于提高临床结局的有效性和安全性仍存在争议。另外这些方法操作复杂、费时、需要特殊仪器和设备，这些也进一步阻碍了其在临床的应用。
[0007]因此，在ICSI技术应用越来越广泛的时候，为了提高辅助生殖助孕的有效性和安全性，建立操作简便、安全、有效的I CS I优质精子的选择方法迫在眉睫。
[0008]理论基础:
[0009]卵泡中排出的卵子外围包绕卵丘细胞复合物，因此卵丘细胞复合物是生理性的物质，安全。在正常受精过程中，精子必须穿过卵丘细胞复合物才有机会与透明带识别，从而进入卵子完成受精过程。卵丘细胞复合物形成失败会导致受精失败。因此，卵丘细胞复合物是精子与卵子接触的第一道屏障，在自然受精过程中发挥了精子优选的作用。故本发明拟通过模拟体内正常受精过程中精子被优选的过程来进行体外精子优选。已有体外研究报道:卵丘细胞复合物体外能影响精子功能;人类精子与卵丘细胞共培养能显著增加精子与无透明带的仓鼠卵子的结合能力;卵丘细胞复合物能增强精子穿过卵丘及与透明带结合的能力。此外透明质酸是卵丘细胞复合物中胞外基质的一个主要成分，在促黄体生成素(LH)峰后合成。体外，透明质酸能影响精子的活力和顶体反应。应用透明质酸优选成熟精子的效果已有文献报道。因此，本发明旨在建立一种操作简便、安全、有效的ICSI优质精子的选择方法。
【发明内容】
[0010]本发明的目的通过模拟体内正常受精过程中卵丘细胞复合物优选精子的过程，体外构建类似体内的卵丘细胞复合物优选精子的模型，建立一种操作简便、安全、有效的ICSI优质精子的选择方法。
[0011 ]为解决上述技术问题，本发明的技术方案是:
[0012]这种应用卵丘细胞复合物优选精子的方法，由以下步骤构成:
[0013]①取卵当日，割取ICSI患者的部分卵丘细胞复合物，置于培养箱内备用；
[0014]②ICSI患者精液经常规离心法洗涤后，置于培养箱内备用；
[0015]③ICSI操作前l_2h，将留取的卵丘细胞复合物置于ICSI操作皿的b区，用拉制好的巴斯管将卵丘细胞铺满b区，在液滴边缘部分将卵丘细胞外延;将洗涤处理完毕的精子加入ICSI操作皿的a区；b区铺设卵丘细胞复合物必须达到以下要求:a区精子要到达C区的唯一路径，便是穿过b区的卵丘细胞复合物；
[0016]④ICSI操作时，在C区进行精子制动。
[0017]这种应用卵丘细胞复合物优选精子的方法的应用:
[0018]利用建立的卵丘细胞复合物优选精子模型对常规IVF精子进行优选后的结果表明:穿过卵丘细胞复合物的精子形态正常率、DNA完整率、发生顶体反应的精子比率显著高于未穿过卵丘细胞复合物的精子。
[0019]这种应用卵丘细胞复合物优选精子的方法的应用:
[0020]利用建立的卵丘细胞复合物优选精子模型对36例ICSI患者的精子进行优选;通过随机自身对照试验，将患者卵子随机分成两组，分别用优选的精子和常规形态学法选择的精子进行ICSI; 36例患者共405个卵子进行了 ICSI受精；
[0021]结果表明:应用卵丘细胞复合物优选出的精子进行ICSI受精后，显著提高了卵子受精率、囊胚形成率和卵子利用率。
[0022]有益效果:
[0023]应用本发明能有效的筛选出优质精子，能显著提高ICSI患者的卵子受精率、囊胚形成率和卵子利用率，提高了胚胎的发育潜能。
[0024]由于该方法是模拟体内正常的受精过程，因此不存在优选方法的安全隐患。并且该方法操作简便省时，不需要额外的设备仪器以及试剂，既未增加实验室的额外工作量，也未增加患者的治疗费用。因此，本发明为ICSI患者优选精子提供了新思路和新方法，这在国内外尚未见报道。
【附图说明】
[0025]下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步的说明。
[0026]图1是本发明的组合结构示意图。
【具体实施方式】
[0027]实施例:
[0028]这种应用卵丘细胞复合物优选精子的方法，由以下步骤构成:
[0029]①取卵当日，割取ICSI患者的部分卵丘细胞复合物，置于培养箱内备用；
[0030]②ICSI患者精液经常规离心法洗涤后，置于培养箱内备用；
[0031]③ICSI操作前l_2h，将留取的卵丘细胞复合物置于ICSI操作皿的b区，用拉制好的巴斯管将卵丘细胞铺满b区，在液滴边缘部分将卵丘细胞外延;将洗涤处理完毕的精子加入ICSI操作皿的a区；b区铺设卵丘细胞复合物必须达到以下要求:a区精子要到达C区的唯一路径，便是穿过b区的卵丘细胞复合物；
[0032]④ICSI操作时，在C区进行精子制动。
[0033]这种应用卵丘细胞复合物优选精子的方法的应用:
[0034]利用建立的卵丘细胞复合物优选精子模型对常规IVF精子进行优选后的结果表明:穿过卵丘细胞复合物的精子形态正常率、DNA完整率、发生顶体反应的精子比率显著高于未穿过卵丘细胞复合物的精子。
[0035]这种应用卵丘细胞复合物优选精子的方法的应用:
[0036]利用建立的卵丘细胞复合物优选精子模型对36例ICSI患者的精子进行优选;通过随机自身对照试验，将患者卵子随机分成两组，分别用优选的精子和常规形态学法选择的精子进行ICSI; 36例患者共405个卵子进行了 ICSI受精；
[0037]结果表明:应用卵丘细胞复合物优选出的精子进行ICSI受精后，显著提高了卵子受精率、囊胚形成率和卵子利用率。
[0038]临床验证:
[0039]1、利用建立的卵丘细胞复合物优选精子模型对常规IVF精子进行优选后的结果表明:穿过卵丘细胞复合物的精子形态正常率、DNA完整性、发生顶体反应的精子比率显著高于未穿过卵丘细胞复合物的精子。
[0040]2、利用建立的卵丘细胞复合物优选精子模型对36例ICSI患者的精子进行优选。通过随机自身对照试验，将患者卵子随机分成两组，分别用优选的精子和常规形态学法选择的精子进行ICSI。36例患者共405个卵子进行了 ICSI受精，结果表明:应用卵丘细胞复合物优选出的精子进行ICSI受精后，显著提高了卵子受精率、囊胚形成率和卵子利用率。
【主权项】
1.一种应用卵丘细胞复合物优选精子的方法，其特征是:由以下步骤构成: ①取卵当日，割取ICSI患者的部分卵丘细胞复合物，置于培养箱内备用； ②ICSI患者精液经常规离心法洗涤后，置于培养箱内备用； ③ICSI操作前l-2h，将留取的卵丘细胞复合物置于ICSI操作皿的b区，用拉制好的巴斯管将卵丘细胞铺满b区，在液滴边缘部分将卵丘细胞外延;将洗涤处理完毕的精子加入ICSI操作皿的a区；b区铺设卵丘细胞复合物必须达到以下要求:a区精子要到达C区的唯一路径，便是穿过b区的卵丘细胞复合物； ④ICSI操作时，在C区进行精子制动。2.根据权利要求1所述的一种应用卵丘细胞复合物优选精子的方法的应用，其特征在于: 利用建立的卵丘细胞复合物优选精子模型对常规IVF精子进行优选后的结果表明:穿过卵丘细胞复合物的精子形态正常率、DNA完整率、发生顶体反应的精子比率显著高于未穿过卵丘细胞复合物的精子。3.根据权利要求1所述的一种应用卵丘细胞复合物优选精子的方法的应用，其特征在于: 利用建立的卵丘细胞复合物优选精子模型对36例ICSI患者的精子进行优选;通过随机自身对照试验，将患者卵子随机分成两组，分别用优选的精子和常规形态学法选择的精子进行ICSI; 36例患者共405个卵子进行了 ICSI受精； 结果表明:应用卵丘细胞复合物优选出的精子进行ICSI受精后，显著提高了卵子受精率、囊胚形成率和卵子利用率。
【文档编号】C12N5/076GK105936890SQ201610477609
【公开日】2016年9月14日
【申请日】2016年6月27日
【发明人】冯贵雪, 汪彩珠, 张波, 林若芸, 周红, 陈焕华, 舒金辉
【申请人】广西壮族自治区妇幼保健院, 冯贵雪