一种低分子量壳聚糖的制备方法
【专利摘要】本发明提供了一种低分子量壳聚糖的制备方法，包括降解高分子量壳聚糖的步骤，在降解高分子量壳聚糖之前引入保护基团对壳聚糖进行氨基保护，所述保护基团选自苄氧羰基、叔丁氧羰基、三甲基硅乙氧羰基和笏甲氧羰基中的一种。所述高分子量壳聚糖通过短时间超声和过氧化氢化学降解相结合的技术进行降解。本发明的方法制备的低分子量壳聚糖含有较高的活性氨基数量，其分子量低、分子量分布较窄且色泽纯白、收率高，极大地增加了应用价值；超声预处理与化学氧化相结合提高了降解效率及能源利用率，极大地降低了生产成本；工艺简单，操作方便，反应易控制且反应条件温和，适合大规模工业化生产。
【专利说明】
_种低分子量壳聚糖的制备方法
技术领域
[0001 ]本发明属于壳聚糖降解技术领域，具体地说，是关于一种低分子量壳聚糖的制备 方法。
【背景技术】
[0002] 甲壳素(Chitin)是类似于植物纤维的六碳聚合体，是存在于自然界中唯一的一种 能生物降解的带阳离子的高分子材料，广泛存在于虾、蟹等甲壳动物及昆虫、藻类和细菌 中，又称动物素、几丁质、甲壳质或壳多糖。甲壳素因其化学性质不活泼、溶解性能很差，带 至其直接应用非常有限。对甲壳素进行脱乙酰化处理后所得的壳聚糖(Chitosan)，因分子 结构中氨基活性基团的存在，其化学性质大为改变，是迄今为止发现的唯一天然碱性多糖， 具有许多独特的生物活性，同时还具有无毒、生物相容性好和易于降解等优点。但其分子内 外的氢键相互作用，形成有序的大分子结构，导致其分子量通常在几十万上百万，使其只溶 于稀盐酸、硝酸等无机酸和大多数有机酸，而不溶于水和碱性溶液，致使壳聚糖的应用受到 很大的限制。壳聚糖的分子量对其物理，化学和生物性质均有很大影响，若能够通过适当的 方法将高分子量壳聚糖降低为低分子量壳聚糖，特别是分子量小于10000的低分子量聚壳 聚糖，不仅溶于水，还能展现出独特优越的生理活性和物理化学性质。
[0003] 低分子量壳聚糖在医药、食品、化妆品、水处理等方面都有着广泛的应用，如具有 促进脾脏抗体生成，抑制肿瘤生长的生理功能;可有效降低肝脏和血清中的胆固醇;可强化 肝脏功能，防止痛风和胃溃。此外，它还可作为食品添加剂使用，可用于固定酶、蛋白质的提 纯，造纸工业及水处理工业等方面。目前，低分子量壳聚糖的制备方法主要有酶降解法、物 理降解法和氧化降解法。
[0004] 酶降解法是用专一性或非专一性酶对壳聚糖进行生物降解的方法，采用该方法能 够得到平均相对分子量较低的低聚糖和单糖。整个降解过程中无其它反应试剂加入，无其 它副反应发生，降解条件温和，降解过程及产物分子量分布较易控制。缺点是所使用的酶较 为特殊，酶的活力有限，同时成本高，生产周期长，很难用于工业化生产。
[0005] 物理降解法主要是利用微波、超声波和γ射线等物理方式来降解壳聚糖，常用的 是超声波降解法。超声波降解法操作简单，无三废产物，产物色泽良好，但95 %的超声能量 用于体系加热作用而非产物降解作用，因此降解效率较低，同时具有产物分子量分布较广， 分子量较尚的问题。
[0006] 氧化降解法是目前研究较多的方法，其中过氧化氢氧化法更有大量文献报道，但 氧化降解法的反应过程不易控制，产物容易发生褐变，同时降解过程中引入了各种反应试 剂，增加了控制降解副反应及降解产物分离纯化的难度，且产物结构易被修饰，导致活性氨 基含量降低。中国专利CN102321194B，提供了一种超声波辅助过氧化氢制备低分子量聚壳 聚糖的工艺方法，该方法以超声为反应源，通过分批加入过氧化氢解决了产物色泽较深、分 子量分布较广的问题，但其超声次数多，超声时间长，导致该方法的超声效率低，能量浪费 大，生产成本高。
[0007]低分子量壳聚糖的良好性能，除了依赖于低分子量，其很大一部分还依赖于其结 构上的较高的活性氨基含量及较窄的分子量分布，如:壳聚糖的在吸湿性和抑菌活性主要 与其分子上的氨基数量有关。国内外现有的降解方法通常只注重降低壳聚糖的分子量，而 忽视了低分子壳聚糖的活性氨基保持率和分子量分布等重要参数。因此，现有技术制备的 低分子量壳聚糖的活性较低，直接降低了低分子量壳聚糖的使用价值。
[0008 ]因此，研究一种低分子量壳聚糖的制备方法，不仅能够有效降低壳聚糖的分子量， 还能保证制备的低分子量壳聚糖具有较窄的分子量分布和较高的活性氨基含量，且降解效 率高，收率高，成本低就具有十分重要的意义。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的在于提供一种低分子量壳聚糖的制备方法，以克服现有技术在制备 低分子量壳聚糖时活性氨基含量低，收率不尚，分子量分布较广等问题，能够保证制备的低 分子量壳聚糖具有较高的活性氨基含量和较窄的分子量分布且降解效率高，收率高，成本 低。
[0010] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0011] -种低分子量壳聚糖的制备方法，包括降解高分子量壳聚糖的步骤，在降解高分 子量壳聚糖之前引入保护基团对壳聚糖进行氨基保护。
[0012] 所述保护基选自节氧羰基(Cbz)、叔丁氧羰基（t-Boc)、三甲基娃乙氧羰基(Teoc) 和窃甲氧羰基(Fmoc)中的一种。
[0013]所述保护基团的引入包括如下步骤：
[0014] 1)将一定量的壳聚糖溶于适量的有机酸水溶液中，控制反应液中的壳聚糖的质量 浓度为8~13%，调节体系至碱性，搅拌得到均匀的壳聚糖悬浊液；
[0015] 2)向步骤1)制备的壳聚糖悬浊液中加入与壳聚糖质量比为0.4~0.7:1的氨基保 护化合物，控制温度不超过15°C，反应两小时，然后加入有机酸调节体系至酸性，搅拌均匀， 得到完成了氨基保护的壳聚糖溶液。
[0016] 进一步地，所述步骤1)中的所述有机酸为冰醋酸、柠檬酸中的一种。
[0017] 进一步地，所述步骤1)中的所述有机酸水溶液的pH为3~5。
[0018] 进一步地，所述步骤1)中的碱性条件为pH值为8~10。
[0019] 进一步地，所述步骤2)中的酸性条件为pH值为3~5。
[0020] 进一步地，所述高分子量壳聚糖的脱乙酰度为75~90%。
[0021 ]所述降解高分子量壳聚糖的步骤包括如下步骤：
[0022] 1)向完成了氨基保护的壳聚糖溶液中加入适量的过氧化氢，所述过氧化氢的加入 量为总过氧化氢的60~80%，所述总过氧化氢与壳聚糖的质量比为0.3~0.65:1，搅拌均匀 后进行超声降解；
[0023] 2)补加剩余的过氧化氢，控制反应温度为55°C~65°C，反应1.5~2.0h，然后静置， 冷却，得到低分子量壳聚糖溶液。
[0024] 进一步地，所述步骤1)中的超声温度为常温，超声频率为30KHz~45KHz，超声功率 为25W~45W，超声时间为20min~40min。
[0025]进一步地，所述低分子量壳聚糖的制备方法还包括氨基保护基团的脱除步骤和分 离纯化步骤，其中：
[0026] 所述氨基保护基团的脱除步骤为：向所述低分子量壳聚糖溶液中加入适量HBr，所 述HBr与所述氨基保护化合物的质量比为1~2:1，常温反应1~2h，静止，分出水层；
[0027] 所述分离纯化步骤为:调节所述水层的pH值至8~9,然后经过过滤、浓缩、醇沉、洗 涤和烘干，得到低分子量壳聚糖。
[0028]进一步地，所述浓缩步骤将水层浓缩至壳聚糖质量浓度为25~30%。
[0029] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0030] 1)、本发明的制备方法制备的低分子量壳聚糖含有较高的活性氨基数量，其分子 量低、分子量分布较窄，同时收率高，色泽纯白，极大地增加了其应用价值；
[0031] 2)采用超声短时间预处理与化学氧化相结合的技术，有效的避免了单一手段的缺 点，提高了过氧化氢的活性，提高了降解效率和能源利用率，极大地降低了生产成本；
[0032] 3)工艺简单，操作方便，反应易控制且反应条件温和，适合大规模工业化生产。
【具体实施方式】
[0033] 以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本 发明而非用于限制本发明的范围。
[0034]本发明中的所有原料均为市售。
[0035] 凝胶渗透色谱(GPC)检测：
[0036] 色谱仪型号:安捷伦GPC-220高温凝胶色谱仪
[0037] 色谱柱型号：色谱柱TSKgel G4000PWXL
[0038] 检测器:示差折光检测器
[0039] 流动相：0.1m〇l/L CH3C00H-0.05mol/L CH3C00Na溶液
[0040] 流速：1.0ml/min
[0041] 柱温：30 °C
[0042] 样品检测浓度：lmg/ml。
[0043] 壳聚糖中氨基含量的检测：
[0044] 壳聚糖中氨基含量具体测定步骤如下：
[0045] 精密称取约0.5克试样置于250ml三角烧瓶中，加入0 . lmol/L盐酸溶液30ml，溶解 完全后，用0. lmol/L氢氧化钠溶液滴定过量的盐酸，以甲基橙作为指示剂。另取一份试样置 于105°C烘箱中，烘至恒重，测定水分。
[0046]计算方法如下：
[0047]
[0048]
[0049] &为盐酸标准溶液的浓度，mol/L;
[0050] C2为氢氧化钠准溶液的浓度，mol/L;
[00511 W为加入的盐酸标准溶液的体积，mL;
[0052] V2滴定耗用的氢氧化钠标准溶液的体积，mL;
[0053] G为样品质量，g;
[0054] W为样品的水分含量，％ ;
[0055] 0.016为与lmL浓度为lmol/L的盐酸溶液相当的氨基量，g。
[0056] 实施例1:
[0057] 将8g分子量为140万，脱乙酰度为75%的壳聚糖溶于100ml pH值为3.0的冰醋酸溶 液中，搅拌至溶解均匀后，使用碳酸氢钠调节pH值至9,得到均匀稳定的壳聚糖悬浊液;往上 述悬浊液中加入3.2g苄氧羰基氯，控制反应温度不超过15°C，反应两小时，然后补加冰醋酸 溶液调节体系的pH值至3.0,以使壳聚糖完全溶解，得到完成了氨基保护的壳聚糖溶液。 [0058]向上述完成了氨基保护的壳聚糖溶液中加入1.92g过氧化氢，在频率30KHz，功率 25W条件下，常温超声20min，然后转入水浴加热降解，控制反应温度为55°C，同时补加1.28g 过氧化氢，反应1.5小时。
[0059]反应完成后，加入4.8g的HBr，常温下反应1小时以脱除苄氧羰基，然后静置，分离 出水层。
[0060] 使用5~15%的氢氧化钠溶液调节上述水层的pH值至8.0，过滤，将水层浓缩至壳 聚糖质量浓度为25%，然后进行醇沉，并采用纯乙醇洗涤2~3次，于40°C下烘干，得到低分 子量壳聚糖。
[0061] 经观察，制备的壳聚糖色泽米白色，检测其分子量为1985,凝胶渗透色谱法测定其 分子量分布为1.25，氨基含量7.50 %，收率达92 %。
[0062] 实施例2:
[0063] 将10g分子量为150万，脱乙酰度为80%的壳聚糖溶于100ml pH值为4.5的柠檬酸 溶液中，搅拌溶解均匀后，使用碳酸氢钠调节pH值至8,得到均匀稳定的壳聚糖悬浊液;往上 述悬浊液中加入7.0g叔丁氧羰基氯，控制反应温度不超过15°C，反应两小时，然后补加柠檬 酸溶液调节体系的pH值至4.5,以使壳聚糖完全溶解，得到完成了氨基保护的壳聚糖溶液。 [0064]向上述完成了氨基保护的壳聚糖溶液中加入2.1 g过氧化氢，在频率30KHz，功率 35W下，常温超声30min，然后转入水浴加热降解，控制反应温度为60°C，并补加0.9g过氧化 氢，反应时间2小时。
[0065]反应完成后，加入7.0g的HBr，常温下反应1.5小时以脱除叔丁氧羰基，然后静置， 分离出水层。
[0066] 使用5~15%的氢氧化钠溶液调节上述水层的pH值至8.5,过滤，将水层浓缩至壳 聚糖质量浓度为28%，然后进行醇沉，并采用纯乙醇洗涤2~3次，于45°C下烘干，得到低分 子量壳聚糖。
[0067]经观察，制备的壳聚糖色泽米白色，检测其分子量为2020,凝胶渗透色谱法测定其 分子量分布为1.20，氨基含量8.03 %，收率达88.4 %。
[0068] 实施例3:
[0069] 将13g分子量为160万，脱乙酰度为90%的壳聚糖溶于pH值为5.0的柠檬酸100ml溶 液中，搅拌溶解均匀后，使用碳酸氢钠调节pH值至10,得到均匀稳定的壳聚糖悬浊液;往上 述悬浊液中加入7.8g三甲基硅乙氧羰基氯，反应两小时，控制反应温度在15°C以下，然后补 加柠檬酸溶液调节体系的pH值至5.0,以使壳聚糖完全溶解，得到完成了氨基保护的壳聚糖 溶液。
[0070]向上述完成了氨基保护的壳聚糖溶液加入5.2g过氧化氢，在频率40KHZ，功率40W 下，常温超声35min，然后转入水浴加热降解，控制反应温度60°C，并补加3.25g过氧化氢，反 应1.5小时。
[0071] 反应完成后，加入15.6g的HBr，常温下反应1小时以脱除三甲基硅乙氧羰基，然后 静置，分离出水层。
[0072] 使用5~15%的氢氧化钠溶液调节上述水层的pH值至9.0，过滤，将水层浓缩至壳 聚糖质量浓度为30%，然后进行醇沉，并采用纯乙醇洗涤2~3次，于50°C下烘干，得到低分 子量壳聚糖。
[0073] 经观察，制备的壳聚糖色泽米白色，检测其分子量为2100,凝胶渗透色谱法测定其 分子量分布为1.1，氨基含量8.97 %，收率达89.0 %。
[0074] 实施例4:
[0075] 将llg分子量为145万，脱乙酰度为85%的壳聚糖溶于100ml pH值为4.0的冰醋酸 溶液中，搅拌溶解均匀后，使用碳酸氢钠调节pH值至9.5,得到均匀稳定的壳聚糖悬浊液;往 上述悬浊液中加入5.5g笏甲氧羰基氯，控制反应温度不超过15°C，反应两小时，然后补加冰 醋酸溶液调节体系的pH值至4.0,以使壳聚糖完全溶解，得到完成了氨基保护的壳聚糖溶 液。
[0076]向上述完成了氨基保护的壳聚糖溶液中加入4.29g过氧化氢，在频率45KHz，功率 40W下，常温超声40min，然后转入水浴加热降解，控制反应温度65°C，并补加2.31g过氧化 氢，反应2.0小时。
[0077]反应完成后，加入9.3g的HBr，常温下反应2小时以脱除笏甲氧羰基，然后静置，分 尚出水层。
[0078] 使用5~5 %的氢氧化钠溶液调节上述水层的pH值至9.0,过滤，将水层浓缩至壳聚 糖质量浓度为30%，然后进行醇沉，并采用纯乙醇洗涤2~3次，于45°C下烘干，得到低分子 量壳聚糖。
[0079]经观察，制备的壳聚糖色泽米白色，检测其分子量为2070,凝胶渗透色谱法测定其 分子量分布为1.3，氨基含量8.97 %，收率达86.0 %。
[0080] 对比例1:
[00811 将8g分子量为140万，脱乙酰度为75%的壳聚糖溶于100ml pH值为3.0的冰醋酸溶 液中，搅拌溶解均匀后，向上述溶液中加入1.92g过氧化氢，在频率30KHz，功率25W下，常温 超声20min，然后转入水浴加热降解，控制反应温度55°C，并补加1.28g过氧化氢，反应1.5小 时。反应完成后调节pH至8.0,过滤，浓缩至壳聚糖质量浓度为25%，然后进行醇沉，并用纯 乙醇洗涤2~3次，于40°C下烘干，得到低分子量壳聚糖。
[0082]经观察，制备的壳聚糖色泽米白色，检测其分子量为2030,凝胶渗透色谱法测定其 分子量分布为1.25，氨基含量6.0 %，收率为87.2 %。
[0083] 由实施例1-4的结果可以看出，本发明的方法制备的低分子量壳聚糖氨基含量高， 分子量低，分子量分布窄，收率尚。与对比例1相比，经过氨基保护的实施例1 _4制备的低分 子量壳聚糖的有效氨基含量高，氨基含量提高了25~49.5%，极大地提高了低分子量壳聚 糖的工业应用范围。
[0084] 对比例2:
[0085] 模拟现有较佳技术进行低分子量壳聚糖制备，具体工艺如下：
[0086]将8g分子量为145万的壳聚糖固体溶于适量pH值为5.0的乙酸溶液中，控制壳聚糖 的质量浓度为22%，搅拌均匀，反应在超声反应釜中进行，超声反应釜通入循环冷凝水，控 制水温不超过50°C，超声0.8h，超声频率28kHz ;然后加入壳聚糖质量的18 %的过氧化氢，搅 拌均匀后超声1.2h，超声频率28kHz，然后再补加壳聚糖质量的50%的过氧化氢，搅拌均匀 后超声i . 5h，再将所得溶液过滤，滤液经过喷雾干燥制得粉末状固体。
[0087]经观察，制备的壳聚糖色泽米白色，检测其分子量为3530,凝胶渗透色谱法测定其 分子量分布为1.85，氨基含量5.60 %，收率为87 %。
[0088] 与实施例1-4相比，对比例2制备的低分子量壳聚糖的氨基含量低，其分子量较高， 分子量分布较广，限制了低分子量壳聚糖的应用。与对比例2相比，实施例1-4制备的低分子 量壳聚糖的氨基含量提高了33.9~60.2%。
[0089] 另外，对比例2超声次数多且超声时间长，大量的能量用于加热体系，又需要大量 循环冷凝水换热以维持超声反应温度小于50°C，因此浪费大量冷量，提高了生产成本。因 此，与对比例2相比，本发明的实施例1-4的制备方法超声效率高，能量利用率高，生产成本 低。
[0090] 以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制 于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对该发明进行的等同修改和替 代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修 改，都应涵盖在本发明的范围内。
【主权项】
1. 一种低分子量壳聚糖的制备方法，包括降解高分子量壳聚糖的步骤，其特征在于，在 降解高分子量壳聚糖之前引入保护基团对壳聚糖进行氨基保护。2. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述保护基团选自苄氧羰基、叔丁氧羰 基、三甲基硅乙氧羰基和笏甲氧羰基中的一种。3. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述保护基团的引入包括如下步骤： 1) 将一定量的壳聚糖溶于适量的有机酸水溶液中，控制反应液中的壳聚糖的质量浓度 为8~13%，调节体系至碱性，搅拌得到均匀的壳聚糖悬浊液； 2) 向步骤1)制备的壳聚糖悬浊液中加入与壳聚糖质量比为0.4~0.7 :1的氨基保护化 合物，控制温度不超过15°C，反应两小时，然后加入有机酸调节体系至酸性，搅拌均匀，得到 完成了氨基保护的壳聚糖溶液。4. 如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中的所述有机酸为冰醋酸、 朽1檬酸中的一种。5. 如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中的所述有机酸水溶液的pH 为3~5〇6. 如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中的碱性条件为pH值为8~ 10。7. 如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中的酸性条件为pH值为3~ 5〇8. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述高分子量壳聚糖的脱乙酰度为75~ 90% 〇9. 如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述降解高分子量壳聚糖的步骤包括如 下步骤： 1) 向完成了氨基保护的壳聚糖溶液中加入适量的过氧化氢，所述过氧化氢的加入量为 总过氧化氢的60~80%，所述总过氧化氢与壳聚糖的质量比为0.3~0.65:1，搅拌均匀后进 行超声降解； 2) 补加剩余的过氧化氢，控制反应温度为55°C~65°C，反应1.5~2.Oh，然后静置，冷 却，得到低分子量壳聚糖溶液。10. 如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中的超声温度为常温，超声 频率为30KHz~45KHz，超声功率为25W~45W，超声时间为20min~40min。11. 如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，还包括氨基保护基团的脱除步骤和分 离纯化步骤，其中： 所述氨基保护基团的脱除步骤为：向所述低分子量壳聚糖溶液中加入适量HBr，所述 HBr与所述氨基保护化合物的质量比为1~2:1，常温反应1~2h，静止，分出水层； 所述分离纯化步骤为：调节所述水层的pH值至8~9,然后经过过滤、浓缩、醇沉、洗涤和 烘干，得到低分子量壳聚糖。12. 如权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述浓缩步骤将水层浓缩至壳聚糖质 量浓度为25~30 %。
【文档编号】C08B37/08GK106008750SQ201610612867
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月29日
【发明人】王宇, 朱广东
【申请人】上海宇昂水性新材料科技股份有限公司