一种寇氏隐甲藻及其应用
【专利摘要】本发明涉及微生物发酵工程领域，具体涉及一种寇氏隐甲藻及利用其高密度发酵生产DHA的方法。寇氏隐甲藻，其分类命名为寇氏隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)SD401,已于2016年04月13日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，其保藏编号为CGMCC No：12239。本发明所得菌株生长速度快，利用该寇氏隐甲藻菌株发酵生产二十二碳六烯酸。在上述发酵条件下，90?120小时即能获得最大产量。经发酵后获得生物量为90?130g/L，DHA产量为23?35g/L。CGMCC No ：1223920160413
【专利说明】
-种寇氏隐甲藻及其应用
技术领域
[0001] 本发明设及微生物发酵工程领域，具体设及一种寇氏隐甲藻及利用其高密度发酵 生产DHA的方法。
【背景技术】
[0002] 二十二碳六締酸(DHA)是一种重要的ω-3多不饱和脂肪酸，具有促进脑细胞发育、 降血脂、保护视力、抗癌和提高免疫力等重要生理功能，广泛应用在婴幼儿食品及医药行 业。另外，DHA还是多种海水鱼类生长发育所需的必需脂肪酸，可W提高鱼苗的成活率和降 低白化病的得病率。
[0003] 生产DHA的传统原料主要为鱼油，但鱼油生产过程中存在资源有限，产量及质量不 稳定，环境污染，纯化工艺复杂且成本高等问题，逐渐被微生物发酵生产DHA所取代。近年 来，科学工作者开展了利用海洋微生物发酵生产DHA的研究，而寇氏隐甲藻是最具商业化生 产潜力的微生物之一。寇氏隐甲藻具备生长快、抗逆性强、脂类含量高等特点。此外，在它的 脂肪酸中(：14:0，(：16:0，〔22:6(0齡），占总脂肪酸含量的90%左右，具有很高的营养价值并 且相对容易分离。目前，限制其进一步推广的瓶颈是单位成本上的DHA产量较低。
[0004] 目前国内利用寇氏隐甲藻制备DHA油脂的专利主要分Ξ方面内容。第一、优良菌种 的选育。专利CN 101591617 B，CN 103468575 B，CN 102220307 A和CN 104293824 A等，运 些专利通过诱变、基因工程等手段，经过筛选、培养获得高生长速率和高DHA含量的寇氏隐 甲藻藻株，但尚未进行规模化的培养；第二、培养基配方及发酵条件的优化。如专利CN 1986822 A，CN 101386873 B，CN 101979623 B，CN 103882067 A，CN 103882068 A等采用简 单的培养方法和培养条件的优化，达到提高DHA产量的目的。第Ξ、寇氏隐甲藻油脂提取与 分离纯化技术。如专利CN 103864614 B，CN 101168501 B，CN 101307341 B，CN 101824363 B，CN 102559375 A,CN 104544135 A等，通过优化油脂提取工艺方式降低生产成本，提高产 物得率。综合上述专利，获得DHA的高产菌株，并结合优良的发酵工艺，获得较高的生物量和 油脂含量，是DHA的工业化推广的关键所在。
【发明内容】
[0005] 针对上述问题，本发明提供一种寇氏隐甲藻及其应用。
[0006] 为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
[0007] 一种寇氏隐甲藻，其分类命名为寇氏隐甲藻(吐ypthecodinium cohnii)，实验室 命名为寇氏隐甲藻SD401菌株，已于2016年04月13日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号 院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、（CGMCC)，其保藏编号为CGMCC No:12239。
[000引所述寇氏隐甲藻是从广东湛江红树林地区收集的腐叶上采用松花粉垂钓法分离 得到。通过培养，在光学显微镜下观察形态及结构发现（图1): SD401细胞为楠球形，直径在 8-20微米，胞内有明显的颗粒状物质，细胞主要采用分裂方式进行繁殖。
[0009] 通过培养，提取油脂进行脂肪酸成分检测。从结果中可w看出其主要的长链多不 饱和脂肪酸为二十二碳六締酸(DHA)，其中DHA总脂肪酸的含量在35-55%。饱和脂肪酸主要 为十四烧酸和十六烧酸。因此，该藻株脂肪酸组成简单，DHA含量高，具有很好的DHA生产能 力。
[0010] 寇氏隐甲藻化ypthecodinium cohnii SD401藻株最适溫度高、生长速度快。其最 适生长溫度为30°C-35°C，发酵100小时左右能获得最大的生物量与DHA产量。
[0011] -株寇氏隐甲藻的应用，具体为W所述寇氏隐甲藻为出发菌株，在发酵培养基中 高密度发酵获得制备DHA油脂。
[001^ 所述发酵溫度为30°C-35°C，发酵时间为90-120小时，发酵过程中，采用了补氮操 作，在发酵的30-80小时区间内流加50% (w/v)的玉米浆溶液。整个发酵过程中采用了补糖 操作，控制体系中葡萄糖浓度在20-60g/L之间，发酵结束时葡萄糖浓度不高于lOg/L。
[0013] 所述发酵培养基为葡萄糖30-80g/L，酵母提取物5-20g/L，玉米浆5-20g/L，憐酸二 氨钟 0.5-8g/L，硫酸儀 0.5-3g/L，巧樣酸钢 0.5-3g/L，海水晶 5-30g/L，维生素 B1 30-200mg/ L，维生素 B630-200mg/L，维生素 B12 5-50mg/L和生物素2-50mg/L，用水定容至1L。
[0014] -种制备生产二十二碳六締酸的方法，W所述寇氏隐甲藻为出发菌株，在发酵培 养基中高密度发酵获得制备DHA油脂。
[0015] 具体，是W所述寇氏隐甲藻为出发菌株经一级种子和二级种子发酵后，再接种至 发酵培养基中高密度(最终菌浓(生物量)大于lOOg/L)发酵获得制备DHA油脂。
[0016] 所述在发酵培养基中整个发酵过程的发酵溫度为30°C-35°C，发酵时间为90-120 小时，发酵过程中，采用了补氮操作，在发酵的30-80小时区间内流加50% (w/v)的玉米浆溶 液。整个发酵过程中采用了补糖操作，控制体系中葡萄糖浓度在20-60g/L之间，发酵结束时 葡萄糖浓度不高于lOg/L。
[0017] 所述发酵培养基为葡萄糖30-80g/L，酵母提取物5-20g/L，玉米浆5-20g/L，憐酸二 氨钟 0.5-8g/L，硫酸儀 0.5-3g/L，巧樣酸钢 0.5-3g/L，海水晶 5-30g/L，维生素 B1 30-200mg/ L，维生素 B6 30-200mg/L，维生素 B12 5-50mg/L和生物素2-50mg/L，用水定容至1L。
[0018] 本发明与已有技术相比有W下显著特点和积极效果：
[0019] 1.本发明筛选得到一株在较高溫度下高产DHA的寇氏隐甲藻藻株，该藻株能在30 °C-35°C条件下快速生长，并大量积累二十二碳六締酸。
[0020] 2.本发明所得藻株生长速度快，发酵时间短。利用寇氏隐甲藻菌株高密度发酵生 产二十二碳六締酸。在上述发酵条件下，90-120小时即能获得最大产量。经发酵后获得生物 量为90-130g/L，DHA 产量为 23-35g/L。
[0021] 3.本发明所得藻株从广东省湛江市红树林水域中筛选得到可高产二十二碳六締 酸的寇氏隐甲藻化ypthecodinium cohnii SD401藻株，具有很好的工业应用价值。所筛选 能高产DHA的寇氏隐甲藻，W及利用其高密度发酵生产DHA油脂的方法。
【附图说明】
[0022] 图1是寇氏隐甲藻SD401菌株在显微镜下的形态图。
【具体实施方式】
[0023] 实施例1:
[0024] 寇氏隐甲藻，其分类命名为寇氏隐甲藻(Crypthecodinium cohnii),实验室命名 为寇氏隐甲藻SD401菌株，已于2016年04月13日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3 号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、（CGMCC)，其保藏编号为CGMCC No: 12239ο
[0025] 所述寇氏隐甲藻是从广东电白水东湾红树林地区收集的腐叶上采用松花粉垂钓 法分离得到。通过培养，在光学显微镜下观察形态及结构发现（图1): SD401细胞为楠球形， 直径在8~20微米，胞内有明显的颗粒状物质，细胞主要采用分裂方式进行繁殖。
[0026] 通过培养，提取油脂进行脂肪酸成分检测。从结果中可W看出其主要的长链多不 饱和脂肪酸为二十二碳六締酸(DHA)，饱和脂肪酸主要为十四烧酸和十六烧酸。因此，该藻 株脂肪酸组成简单，DHA含量高，具有很好的DHA生产能力。
[0027] 表1发酵后寇氏隐甲藻SD401胞内脂肪酸组成情况
[002引
[0029]
[0030] 实施例2:
[0031] 不同碳源对寇氏隐甲藻SD401菌株生长和油脂积累的影响
[0032] 在250ml的Ξ角摇瓶中，配置50ml培养基，氮源为酵母提取物20g/L，盐度为15,分 别加入不同的碳源(甘油、葡萄糖、果糖、木糖、薦糖、麦芽糖和淀粉），浓度为60g/L，调抑值 为6.0,高压灭菌后，接入5ml预培养的菌种种子液，在空气浴振荡器上30°C振荡培养120小 时，振荡转速为20化pm。离屯、收集菌体，冷冻干燥至恒重，测其干重；取部分菌体，按常规的 氯仿-甲醇法提取油脂并甲脂化，通过GC-MS测定菌体中DHA的百分含量。结果见表2。
[0033] 表2不同碳源对寇氏隐甲藻SD401藻株生长和油脂积累的影响
[0034]
[0035] 由结果得出，葡萄糖、甘油和果糖是比较理想的碳源。当采用葡萄糖为碳源时，细 胞的生物量、油脂含量及DHA含量均达到最大，分别为29.25g/L，55.5%和54.6%。
[0036] 实施例3:
[0037] 不同氮源对寇氏隐甲藻SD401藻株生长和油脂积累的影响
[0038] 在250ml的Ξ角摇瓶中，配置50m培养基，采用葡萄糖为碳源，浓度60g/L，盐度为 15,分别加入浓度为20g/L的有机氮源(酵母提取物、蛋白腺和膜蛋白腺)和5g/L的无机氮源 (尿素、醋酸锭和硝酸钢），调节pH值为6.0,高压灭菌后，接入5ml预培养的藻种种子液，在空 气浴振荡器上35°C振荡培养90小时，振荡转速为18化pm。分析方法同上，实验结果见表3。
[0039] 表3不同氮源对寇氏隐甲藻SD401菌株生长和油脂积累的影响
[0040]
[0041] 由表3可知，酵母提取物和蛋白腺能较好的促进SD401藻株生长和油脂积累，并且 采用酵母提取物为氮源时，细胞内获得的DHA含量较高达到总脂肪酸的51.3%。
[0042] 实施例4:
[0043] 将保存在甘油管的藻株接入装有50ml种子培养基的250ml摇瓶中，在35Γ的摇床 中，W2(K)rpm的转速，培养24h，获得一级种子；将一级种子接入装有100ml种子培养基的 500ml摇瓶中，在35°C的摇床中，W20化pm的转速，培养30h，获得二级种子；向化生物反应器 中加入1.化发酵培养基，接入上述获得的二级种子液，于生物反应器发酵培养基内的发酵 过程中，溫度控制在35°C，并采用了补氮操作，发酵的30-80小时内流加50%(w/v)的玉米浆 溶液，同时自动添加2M NaOH或14 %巧樣酸使抑值保持在6.5，于生物反应器内共发酵120小 时。
[0044] 发酵结束后，化发酵罐获得寇氏隐甲藻的产量为90.25g/L，获得生物油脂43.6g/ L，DHA 产量为 25.7g/L。
[0045] 上述，种子培养基为葡萄糖30g/L，酵母提取物5g/L，玉米浆20g/L，憐酸二氨钟 0.5g/L，硫酸儀0.5g/L，巧樣酸钢3g/L，海水晶5g/L，维生素 Bi 30mg/L，维生素 B6 30mg/L，维 生素 Bi2 5mg/L和生物素2mg/L，用水定容至1L。
[0046] 发酵培养基为葡萄糖30g/L，酵母提取物5g/L，玉米浆5g/L，憐酸二氨钟0.5g/L，硫 酸儀0.5g/L，巧樣酸钢0.5g/L，海水晶5g/L，维生素 Bi 30mg/L，维生素 B6 30mg/L，维生素 Bi2 5mg/L和生物素2mg/L，用水定容至IL。
[0047] 实施例3
[004引将保存在甘油管的藻株接入装有50ml种子培养基的250ml摇瓶中，在32Γ的摇床 中，W20化pm的转速，培养24h，获得一级种子；将一级种子接入装有300ml种子培养基的 1000ml摇瓶中，在32°C的摇床中，W2(K)rpm的转速，培养30h，获得二级种子；向化生物反应 器中加入化发酵培养基，接入活化的二级种子液。发酵过程中，溫度控制在32°C。发酵过程 中，采用了补氮操作，发酵的30-80小时内流加50 % (w/v)的玉米浆溶液。自动添加2M NaOH 或14 %巧樣酸使pH值保持在6.5。发酵时间90小时。
[0049] 发酵结束后，化发酵罐获得寇氏隐甲藻的产量为132.86g/L，获得生物油脂69. Ig/ L，DHA 产量为 35.4g/L。
[0050] 上述，种子培养基为葡萄糖30g/L，酵母提取物15g/L，玉米浆5g/L，憐酸二氨钟3g/ L，硫酸儀3g/L，巧樣酸钢3g/L，海水晶30g/L，维生素 Bi 30mg/L，维生素 Bs 30mg/L，维生素 Bi2 5mg/L和生物素2mg/L，用水定容至IL。
[0051] 发酵培养基为葡萄糖80g/L，酵母提取物20g/L，玉米浆20g/L，憐酸二氨钟8g/L，硫 酸儀3g/L，巧樣酸钢3g/L，海水晶30g/L，维生素 Bi 200mg/L，维生素 B6 200mg/L，维生素 Bi2 50mg/L和生物素50mg/L，用水定容至IL。
【主权项】
1. 一种寇氏隐甲藻，其特征在于：寇氏隐甲藻，其分类命名为寇氏隐甲藻 (Crypthecodinium cohnii)SD401，已于2016年04月13日保藏于位于北京市朝阳区北辰西 路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，其保藏编号为 CGMCC No:12239。2. -种权利要求1所述的寇氏隐甲藻的应用，其特征在于:所述寇氏隐甲藻在制备二十 二碳六烯酸中的应用。3. 按权利要求2所述的寇氏隐甲藻的应用，其特征在于：以所述寇氏隐甲藻为出发菌 株，在发酵培养基中发酵获得DHA油脂。4. 按权利要求3所述的寇氏隐甲藻的应用，其特征在于:所述发酵温度为30°C-35°C，发 酵时间为90-120小时，发酵过程中，采用了补氮操作，在发酵的30-80小时区间内流加50% (w/v)的玉米楽;溶液。5. 按权利要求3所述的寇氏隐甲藻的应用，其特征在于:所述发酵培养基为葡萄糖30-80g/L，酵母提取物5-20g/L，玉米浆5-20g/L，磷酸二氢钾0 · 5-8g/L，硫酸镁0 · 5-3g/L，柠檬 酸钠0 · 5-3g/L，海水晶5-30g/L，维生素出 30-200mg/L，维生素 B630-200mg/L，维生素 B12 5-50mg/L 和生物素 2-50mg/L。6. -种生产DHA油脂的方法，其特征在于：以寇氏隐甲藻寇氏隐甲藻为出发菌株，在发 酵培养基中发酵获得DHA油脂；所述寇氏隐甲藻，其分类命名为寇氏隐甲藻 (Crypthecodinium cohnii)SD401，已于2016年04月13日保藏于位于北京市朝阳区北辰西 路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，其保藏编号为 CGMCC No:12239。7. 按权利要求6所述的生产DHA油脂的方法，其特征在于:所述发酵温度为30°C-35°C， 发酵时间为90-120小时，发酵过程中，采用了补氮操作，在发酵的30-80小时区间内流加 50% (w/v)的玉米浆溶液。8. 按权利要求6所述的生产DHA油脂的方法，其特征在于:所述发酵培养基为葡萄糖30-80g/L，酵母提取物5-20g/L，玉米浆5-20g/L，磷酸二氢钾0 · 5-8g/L，硫酸镁0 · 5-3g/L，柠檬 酸钠0 · 5-3g/L，海水晶5-30g/L，维生素出 30-200mg/L，维生素 B630-200mg/L，维生素 B12 5-50mg/L 和生物素 2-50mg/L。
【文档编号】C12P7/64GK106010970SQ201610547947
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月13日
【发明人】崔球, 宋晓金, 马增新, 崔古贞, 冯银刚
【申请人】中国科学院青岛生物能源与过程研究所