一种吞噬微囊藻的棕鞭毛虫的大规模培养方法
【专利摘要】本发明涉及一种吞噬微囊藻的棕鞭毛虫的大规模培养方法。该方法通过半连续添加外源有机碳，给予光照提供混合营养鞭毛虫种群生长，能够在较短时间内获得大量的该棕鞭毛虫。本发明技术优点在于通过混合营养培养的方法，短时间内收获大量的棕鞭毛虫，提供了吞噬微囊藻的棕鞭毛虫大规模培养的方法，获得的大量棕鞭毛虫可用于控藻，另外，这种依据捕食者摄食行为控藻，避免了化学方法对水体的二次污染，同时也可以将水体里藻毒素降解为无毒物质，从而起到控藻和净化水体的作用，具有重大的实践意义。
【专利说明】
一种吞噬微囊藻的棕鞭毛虫的大规模培养方法
技术领域
[0001]本发明属生态技术领域，具体说是一种吞噬微囊藻的棕鞭毛虫的大规模培养方法。
【背景技术】
[0002]近几十年来，全球气候变暖已成为一个严重的环境问题。气温升高，加速了生命体细胞代谢的速度，促进了细胞的扩增。同时，工业废水、生活污水排放导致水体富营养化，这都为藻类的大量繁殖提供了理想的条件。蓝藻比其他初级生产者在氮磷的利用上具有更强的竞争力，因此近年来蓝藻水华现象便频频出现。
[0003]在水华发生的水体里微囊藻是主要优势藻，它是一种有害藻类，主要体现在其大量生长形成水华的同时还会产生微囊藻毒素(MCs)。微囊藻藻毒素是一种具有生物活性的环状七肽化合物，它对大部分真核生物是有害的，且在自然条件下极难被降解。因此微囊藻及其毒素的是一个棘手且急需解决的严重环境问题。
[0004]在水域生态系统中，原生动物是食物链上能量流动的关键一环，将初级生产者固定的能量向下一营养级传递。近年来，研究发现某些原生动物，比如sp.、Collodictyon triciliatum^DiphylIeia rotans^Monas guttula^Poter10chromonassp.、CtArofficMas sp.可以很高效地牧食单细胞或小群体的微囊藻，并保持较高生长率。同时野外研究也发现鞭毛虫常常能够与微囊藻共存于一个水体。其中OcAroff1/jas属中的种类广泛分布在各类淡水水域中，可以成功地在自养、混合营养和异养条件下生存，其在代谢模式上的高度可塑性被认为是对多变的胁迫环境的适应。因此，这些原生动物具有应用于富营养化水体中早期控制微囊藻种群的可能。
[0005]鉴于蓝藻水华对我国水体环境影响重大，现有的物理化学治理方法单一且具有局限性，并且也会带来水体二次污染，同时现阶段吞噬微囊藻的原生生物大规模培养技术欠缺，因此考虑其他治理蓝藻水华的方法将具有重要的创新性和一定的生态意义。
[0006]目前国内外关于原生生物的大规模培养技术及微囊藻水华控制的方法，鉴于不同方法及院里，主要技术概述如下:
吞噬微囊藻的原生生物的培养:以微藻(微囊藻，小球藻，集胞藻，鱼腥藻)、奶粉、蛋黄、细菌及酵母为有机碳源，同时提供光照，鞭毛虫生长良好，种群增加。但在5天内种群数量仅达到15数量级，远不及控藻的要求，且鞭毛虫以奶粉、蛋黄、酵母为食物，成本较高，如果应用到实际控藻中，那么这种方法运用到规模化培养鞭毛虫中，将得不到较好的经济效益。
[0007]控制蓝藻水华的方法:
(I)治理水体富营养化:水体富营养化是蓝藻水华爆发的原因之一，为治理水体富营养化，去控制污染源，减少生活和工业污水的排放；同时以高等水生植物的生态修复能力，改造湖泊生态结构;疏浚湖泊底泥，降低水体营养盐的负荷，去除底部蓝藻。此方法成本较低，从源头解决蓝藻水华爆发的问题。
[0008](2)物理方法:机械混合(曝气)破坏水体温跃层，在湖底安装曝气装置，增加水底氧含量，增加表层混合层深度。此方法适用于小型水体环境;使用拦截和打捞的方法，在重要湖泊景点设置PVC围栏拦藻，然后将蓝藻聚集、吸藻器进行水藻分离、脱水为藻泥，作为有机肥料。此方法能在短期内对控藻有效;将絮凝剂投入水体，但此方法会造成二次污染问题;还有一些其他物理方法，如:超声波、放射线、电磁场、活性炭吸附等等。
[0009](3)化学方法:喷洒化学试剂(除草剂、杀藻剂，金属离子等等)，抑制藻类的正常代谢过程，金属离子的絮凝作用也能控制水华藻类的生长;光化学方法，通过添加矿物质让藻毒素能在可见光下分解；电化学方法，通过二次氧化分解过程，将藻毒素的Adda基团破坏，从而降低环境中藻毒素含量。后两者方法在实际控藻并未普及。前者针对性的化学试剂喷洒方法能够专一性地控制住蓝藻，而对其他藻类没有影响。
[0010](4)生物方法:生物控藻主要原理是寄生、分解、竞争、释放化感物质及捕食等等。噬藻菌能够溶解吞噬蓝藻，且能够利用水体里的氮磷及有机污染物，在短期内能够很好控制藻类;高等水生植物除了竞争营养物质，还能分泌出化感物质，抑制浮游藻类的生长;浮游动物、底栖类动物及滤食性鱼类通过捕食调控改变生物群落的结构，有些原生生物可以通过摄食作用将蓝藻消化，并将藻毒素降解，从而降低水体中的蓝藻数量和藻毒素含量。
[0011]综合以上对吞噬微囊藻的原生生物的培养方法及控制蓝藻水华的方法，奶粉和蛋黄喂食鞭毛虫成本较高且获得鞭毛虫数量较少，经济成本高，时间成本大，因此在吞噬微囊藻的鞭毛虫培养上还需要优化改进。而物理和化学方法中，有的方法只适用于小水体，化学试剂喷洒又会造成水体二次污染，还会导致蓝藻细胞裂解释放出大量的藻毒素到环境中，危害更严重，这种方法也不能彻底解决藻毒素的问题。而生物调控的方法在蓝藻水华治理上具有长期效果，较低成本投入，能够解决藻毒素降解的巨大优势，已被越来越重视，而浮游动物及滤食性鱼类常受制于藻毒素的毒害而效果受限，因此如何去发现挖掘更多的具有较好生物调控的生物和这类生物的大规模培养技术尤其重要，这将会为生物治理方法提供更多的可能，创造出更大的生态和经济效益。
【发明内容】
[0012]为解决上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种吞噬微囊藻的鞭毛虫大规模培养的方法。
[0013]本发明通过半连续添加外源有机碳，给予光照提供混合营养鞭毛虫种群生长来实现上述目的，本发明的具体技术方案如下:
(1)配制培养基，在培养基中添加外源性有机碳；
(2)将棕鞭毛虫接种至培养基培养，每隔一段时间补充外源性有机碳，保证体系中有机碳充足；
本发明所述的混合营养型棕鞭毛虫OcAroffiCMas doeopara培养方式，包括以下步骤:培养基:配制藻类BG-1l培养基，每升含有 1500mg NaNO3, 40mg K2HPO4, 75mg MgSO4.7H20，36mg CaCl2.2H20，6mg 柠檬酸，6mg 柠檬酸铁铵，Img EDTA，20 mg Na2CO3, ImL 微量兀素溶液(2.86mg H3BO3，1.8Img MnCl2.4H2O，0.222mg ZnSCU.7H2O，0.39mg NaMoCU.5H20，0.079mg CuSO4.5H20，0.0494mg Co(NO3)2.6H2O)，以及ImL 维生素Bi2。培养基需要经过121°C，30min高温灭菌待用。
[0014]所述外源性有机碳可为常用碳源，包括葡萄糖、麦芽糖等，优选葡萄糖。添加葡萄糖为外源性有机碳，葡萄糖溶液抽滤灭菌(过0.22μπι滤器)。
[0015]接种:将较低浓度的混合营养型棕鞭毛虫接种到上述中的BG-1l培养基中，提供持续2000 Iux左右的光照，25°C的培养环境，初始时可添加一定浓度的葡萄糖溶液，且每隔一段时间持续添加葡萄糖溶液，保证体系中有机碳充足。每天摇晃培养基4-5次，使得棕鞭毛虫与葡萄糖在培养基中均匀分布，保证棕鞭毛虫能够及时利用周边有机碳源。
[0016]每次添加葡萄糖，使培养液中葡萄糖的浓度达到100-150mg/L。每8-12小时添加一次葡萄糖，每天添加葡萄糖2-4次。
[0017]重复:鞭毛虫在上述培养条件下，大约5-6天，藻体颜色将呈棕色，种群将接近环境容纳量，当培养基中的棕鞭毛虫浓度达到环境容纳量或藻液颜色明显呈棕色，可重新将棕鞭毛虫接种到新的未饱和的培养基中，再按照上述步骤(2)接种培养，或直接投入使用。
[0018]当棕鞭毛虫种群接近环境容纳量，需要在2-3天内及时重新接种。
[0019]本发明中所说的添加到培养基的葡萄糖浓度不能过高，过高浓度的葡萄糖反而会抑制生长。
[0020]本发明中所提及的光照条件，不宜太强，自然界中棕鞭毛虫生活于较低光强的水层。
[0021]本发明中培养条件中也可以提供充气装置，但气流大小应适当，棕鞭毛虫本身也可游动获取食物，因此气流大小不宜过大而影响到棕鞭毛虫的正常生长。为避免其他原生动物带入培养环境，充气气管需要接入0.22μπι滤器，保证无菌气流进入培养基中。
[0022]本发明的培养条件不需要完全无菌，因为棕鞭毛虫可以摄食细菌。细菌可以较好利用培养基中的有机碳，因此棕鞭毛虫可以通过摄食细菌间接利用到提供的有机碳。自然界中棕鞭毛虫主要依靠混合营养方式利用光能且摄食颗粒性有机碳食物。
[0023]本发明中配制的BG-1I培养基pH值为7.3。
[0024]本发明技术优点:
本发明中获得了一种可以有效吞噬微囊藻降解藻毒素的鞭毛虫，并掌握了这种原生生物大规模的培养方法，缩短了获得大量原生生物的培养时间，为原生生物控藻提供了必要的前提。即通过通过添加外源有机碳且提供光照，在混合营养模式下短时间内获得大量的吞噬微囊藻的鞭毛虫，收集的大量原生生物可用于控藻，另外，这种依据捕食者摄食行为控藻，避免了化学方法对水体的二次污染，同时也可以将水体里藻毒素降解为无毒物质，从而起到控藻和净化水体的作用，具有重大的生态意义。
[0025]本发明基于混合营养的鞭毛虫能够同时利用光能和外源有机碳生长的基础，通过半连续提供有机碳，给予光照，促进混合营养鞭毛虫的种群扩增，进而在短时间内获得大量的棕鞭毛虫，降低时间成本，为利用鞭毛虫控藻提供前提。
[0026]本发明针对一次性获取大量的吞噬微囊藻的鞭毛虫耗时较久，成本较高的问题，以混合营养的鞭毛虫能够同时利用光能和外源有机碳生长为基础，通过半连续培养提供有机碳，给予光照，促进混合营养鞭毛虫的种群扩增，进而在短时间内获得大量的棕鞭毛虫，降低时间成本，为利用鞭毛虫控藻提供前提。另外，这种依据捕食者摄食行为控藻，避免了化学方法对水体的二次污染，同时也可以将水体里藻毒素降解为无毒物质，从而起到控藻和净化水体的作用，具有重大的生态意义。
【附图说明】
[0027]图1是在光学显微镜下观察鞭毛虫的形态特征。
[0028]图2是对棕鞭毛虫的种群数及种群增长率统计。
【具体实施方式】
[0029]实施例1有机碳添加方式对棕鞭毛虫种群生长的影响
本实施例采用的棕鞭毛虫g^oeoparai;命名为Strain YZl)为混合营养型原生生物，由采取的太湖水样分离得出，保种采用BG-1l培养基于恒温光照培养箱内培养。
[0030]本实施例所述吞噬微囊藻的鞭毛虫分离鉴定方法具体如下:
分离:采集太湖梅梁湾水样，用实验室培养的对数期的微囊藻(PCC 7806)富集培养鞭毛虫，待微囊藻被摄食完后，吸取上清，将获得的鞭毛虫在光照20001uX，光暗比12:12，温度250C，采用灭菌的大麦水进行扩增培养。
[0031]分子及形态鉴定:
形态鉴定，在光学显微镜下观察鞭毛虫的形态特征，其形态特征如图1所示；
分子鉴定，提取单克隆鞭毛虫的DNA。具体过程为:4°C高速离心后，倒掉上清液。加入600 yL裂解液(40 mmol L—1 EDTA，400 mmol L —1 NaCl ,50 mmol L—1 Tris-hydrochloride，pH 9.0)，37°C水浴30min，每隔1min轻轻颠倒离心管数次，取出离心管加入蛋白酶K (100 yg mL-O和SDS (2%)，50°C水浴2?3h，每隔30min颠倒离心管数次。水浴后取出离心管冷却至室温，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25:24:1体积比)抽提，13000 rmin—1离心lOmin，将上清液转移至一新离心管中，加入等体积氯仿/异戊醇(24:1，体积比)，抽提2次，12000 r min-Ι离心15 min，转移水相到新灭菌离心管中，加入2倍体积4°C预冷无水乙醇和0.1倍体积10 mo I L—1醋酸铵溶液，-20°C放置过夜。13000 r min—1离心15min沉淀DNA，倾掉上清液，用70%乙醇洗涤2次，室温自然晾干，加入100 yL灭菌超纯水溶解DNA -20°(:保存备用。用原生生物18S rRNA通用引物进行PCR扩增并测序，对该鞭毛虫的种属关系进行鉴定(正向引物5 ’ -GACGGGCGGTGTGTACA-3 ’，反向引物5 ’ -CTGGTTGATCCTGCCAG-3 ’)。鉴定得出该种鞭毛虫为0cAro?o/3as g_/oeOjOara，将其命名为strain YZl。
[0032]棕鞭毛虫YZl的大规模培养:
配制BG-1l培养基，每升含有 1500mg NaNO3, 40mg K2HPO4, 75mg MgSO4.7H20，36mgCaCl2.2H20，6mg 柠檬酸，6mg 柠檬酸铁铵，Img EDTA，20 mg Na2CO3, ImL 微量元素溶液(2.86mg H3BO3，1.81mg MnCl 2.4H2O，0.222mg ZnSCU.7H2O，0.39mg NaMoCU.5H20，0.079mg CuSO4.5H20，0.0494mg Co(NO3)2.6H2O)，以及ImL 维生素Bi2。培养基需要经过121°C，30min高温灭菌待用。培养基pH值为7.3。采用葡萄糖溶液抽滤灭菌。以纯光合自养，单次添加和多次添加有机碳的方式为实验处理。
[0033]取对数期纯自养生长的棕鞭毛虫YZl，以相同浓度接种到BG-1l培养基，实验容器为15011^锥形瓶，温度为25°(:，光照200011?，光暗比12:12，实验设置3个处理组，不添加葡萄糖组;一次添加组:添加一次葡萄糖使培养液中葡萄糖的浓度达到150mg/L;多次添加组:每8-12小时添加葡萄糖，使培养液中葡萄糖的浓度达到100-150mg/L。每天摇瓶3-4次，对棕鞭毛虫的种群数及种群增长率统计，如图2所示。
[0034]结果表明:
(I)纯自养、添加一次葡萄糖和多次添加葡萄糖，鞭毛虫种群到达环境容纳量的时间分别为第6天，第3天，第6天。但多次添加组在第三天种群数量就已经超过前两组。
[0035](2)多次添加组在第6天，种群数量就已经达到17数量级，这是纯自养组和一次添加组的233倍和1倍。
[0036]相对纯自养组和一次添加组，多次添加组在种群增长率和最大种群数量具有绝对的综合优势。这就意味着半连续地添加有机碳培养混合营养的棕鞭毛虫方法，能够在较短时间内快速获得较高的种群数量。这大大地缩短了鞭毛虫培养的时间，为控藻应用奠定了基础。
[0037]实施例2
通过实施例1的分离鉴定方法，以微囊藻为食物，从南师大采月湖分离出一种原生生物经鉴定该原生生物为棕鞭毛虫sp.。
[0038]配制BG-1l培养基，每升含有1500mg NaNO3, 40mg K2HPO4, 75mg MgSO4.7H20，36mg CaCl2.2H20，6mg 柠檬酸，6mg 柠檬酸铁铵，Img EDTA，20 mg Na2CO3, ImL 微量兀素溶液(2.86mg H3BO3，1.8Img MnCl2.4H2O，0.222mg ZnSCU.7H2O，0.39mg NaMoCU.5H20，0.079mg CuSO4.5H20，0.0494mg Co(NO3)2.6H2O)，以及ImL 维生素Bi2。培养基需要经过121°C，30min高温灭菌待用。培养基pH值为7.3。
[0039]取对数期纯自养生长的棕鞭毛虫0cAro?o/3assp.，以相同浓度接种到BG-1l培养基，实验容器为IL锥形瓶，温度为25°C，光照20001ux，光暗比12:12，每8-12小时添加60°(:灭菌的大麦水溶液，每天摇瓶3-4次。
[0040]对本实施例的棕鞭毛虫的种群数及种群增长率统计，结果表明:在第7天，种群数量达到17数量级。
[0041 ] 实施例3
通过实施例1的分离鉴定方法，以微囊藻为食物，从太湖分离出一种原生生物，经鉴定该原生生物为棕鞭毛虫sp.。
[0042]配制BG-1l培养基，每升含有1500mg NaNO3, 40mg K2HPO4, 75mg MgSO4.7H20，36mg CaCl2.2H20，6mg 柠檬酸，6mg 柠檬酸铁铵，Img EDTA，20 mg Na2CO3, ImL 微量兀素溶液(2.86mg H3BO3，1.8Img MnCl2.4H2O，0.222mg ZnSCU.7H2O，0.39mg NaMoCU.5H20，0.079mg CuSO4.5H20，0.0494mg Co(NO3)2.6H2O)，以及ImL 维生素Bi2。培养基需要经过121°C，30min高温灭菌待用。培养基pH值为7.3。采用葡萄糖溶液抽滤灭菌。取对数期纯自养生长的棕鞭毛虫0cAro?o/3as sp.，以相同浓度接种到BG-11培养基，实验容器为500mL锥形瓶，温度为25°C，光照20001ux，光暗比12:12，每8_12小时添加葡萄糖溶液，使培养液中葡萄糖的浓度达到100-150mg/L，采用充气装置控制棕鞭毛虫与葡萄糖在培养基中的均匀分布;充气气管接入0.22μπι滤器，保证无菌气流进入培养基中。
[0043]对本实施例的棕鞭毛虫的种群数及种群增长率统计，结果表明:在第5天，种群数量达到17数量级。
【主权项】
1.一种吞噬微囊藻的棕鞭毛虫的大规模培养方法，其特征在于，通过半连续添加外源有机碳，给予光照提供混合营养鞭毛虫种群生长，具体包括如下步骤: (1)配制培养基，在培养基中添加外源性有机碳； (2)将棕鞭毛虫接种至培养基培养，每隔一段时间补充外源性有机碳，保证体系中有机碳充足。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(I)中，培养基为BG-1I培养基，培养基配方为: 每升含有 1500mg NaNO3, 40mg K2HPO4, 75mg MgSO4.7H20，36mg CaCl2.2H20，6mg柠檬酸，6mg柠檬酸铁铵，Img EDTA，20 mg NaKO3, ImL微量元素溶液(2.86mgH3BO3，1.8Img MnCl2.4H2O，0.222mg ZnSCU.7H2O，0.39mg NaMoCU.5H2O，0.079mgCuSO4.5H20，0.0494mg Co(NO3)2.6H20)，以及ImL维生素B12;所述培养基采用高温灭菌。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述培养基pH值为7.3。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，棕鞭毛虫在25°C，光照200011?、光暗比12:12的条件下培养。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，添加葡萄糖作为外源性有机碳。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，添加葡萄糖溶液，葡萄糖溶液通过0.22ym滤器抽提灭菌。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，添加葡萄糖溶液，使培养液中葡萄糖的浓度达到100-150mg/L，每8-12小时添加一次葡萄糖溶液，每天添加葡萄糖2-4次。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，每天摇晃培养基4-5次，使棕鞭毛虫与葡萄糖在培养基中分布均匀。9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，采用充气装置控制棕鞭毛虫与葡萄糖在培养基中的均匀分布;充气气管接入0.22μπι滤器，保证无菌气流进入培养基中。10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在培养基中的棕鞭毛虫浓度达到环境容纳量或藻液颜色明显呈棕色时，将棕鞭毛虫接种到新的未饱和的培养基中，重复步骤(2)，或直接投入使用；当棕鞭毛虫种群接近环境容纳量，在2-3天内重新接种。
【文档编号】C12N1/10GK106010969SQ201610513317
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月30日
【发明人】杨州, 张露, 王骏, 朱雪霞
【申请人】南京师范大学