用于鉴别野牡丹属种的issr专用引物和方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于鉴别野牡丹属种的ISSR专用引物和方法，分子标记包括如下两条引物：1)UBC857，其序列为ACA CAC ACA CAC ACA CYG；2)UBC811，其序列为GAG AGA GAG AGA GAG AC。方法为先建立野牡丹ISSR指纹图谱，再将扩增产物凝胶电泳和指纹图谱进行比较。它具有如下优点：利用引物UBC811可以鉴别出38份野牡丹属种质资源，利用引物UBC851可以鉴别出42份野牡丹属种质资源，而采用引物UBC811和UBC857组合可以鉴别出供试的44份野牡丹种质资源。
【专利说明】
用于鉴别野壮丹属种的ISSR专用引物和方法
技术领域
[0001] 本发明设及分子技术领域，具体设及用于鉴别野牡丹属种的ISSR专用引物和方 法。
【背景技术】
[0002] 野牡丹科（Melastomaceae)植物全世界约240个属，共3000余个种。野牡丹属 (Melastoma)属于野牡丹科，大约有100个种，分布中屯、处于东南亚一带，我国有9个种和1个 变种，主要分布带处于长江W南各个省区。野牡丹属植物花色有白色系、粉色系、紫色系，花 期长、花量大，株型从地被、灌木到小乔木均有分布，具备良好的观赏性状;此外，该属植物 的药用价值近来也有陆续的深入研究，发展前景广泛。目前，绝大多数的野牡丹属植物仍未 被人工开发利用，已在野牡丹属种质资源的收集及评价、栽培技术、脱毒育苗、传粉特性W 及种子发育等方面进行研究。
[0003] 目前，针对野牡丹属的分类研究主要集中于宏观形态学、细胞遗传学、抱粉学、细 胞学、表型多样性等方面，利用分子标记对野牡丹种质资源的遗传性进行研究还比较少。
【发明内容】
[0004] 本发明提供了一种用于鉴别野牡丹属种的ISSR专用引物和方法。
[0005] 本发明解决其技术问题的所采用的技术方案是：
[0006] 一种用于鉴别野牡丹属种的ISSRQnter-simple sequence repeat)专用引物，其 特征在于:它包括两条引物：
[0007] 1)UBC857,其序列为ACA CAC ACA CAC ACA CYG
[000引 2)UBC811，其序列为GAG AGA GAG AGA GAG AC
[0009] -种用于鉴别野牡丹属种的方法，包括如下步骤：
[0010] 1)根据前述的UBC857和UBC811引物，建立野牡丹ISSR指纹图谱
[00川 2)提取野牡丹基因组DNA;
[001 ^ 3)提供所述的UBC857和UBC811引物，进行PCR扩增；
[001引4)扩增产物凝胶电泳，分析条带，并与野牡丹ISSR指纹图谱比对，确定野牡丹属 种。
[0014] 优选地，步骤3)在如下反应条件下进行：
[0015] 30ng/uLDNA模板0.7uL，10Xbuffer化L，10mMdNTP0.6uL，10uM引物0.8uL，抓/ uL Taq酶0. luL，d地2〇定容至20uL，反应程序：94°C预变性5min; 94°C变性Imin; 53°C退火 40sec;72°C 延伸 2min。
[0016] 步骤2)所述的基因组DM优选来自叶片，也可W来自其它部位。
[0017] 本技术方案与【背景技术】相比，它具有如下优点：
[001引利用引物UBC811可W鉴别出38份野牡丹属种质资源，利用引物UBC851可W鉴别出 42份野牡丹属种质资源，而采用引物UBC811和UBC857组合可W鉴别出待测的所有44份野牡 丹种质资源。
【附图说明】
[0019] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
[0020] 图1 UBC857引物对44份供试样品的ISSR图谱。M:分子量标记；1-44见表1。（后Ξ泳 道非供试样）。
[00別]图2基于引物UBC811和UBC857扩增结果的44份野牡丹属种质资源基因组DNA的 ISSR指纹图谱。
【具体实施方式】
[0022] 实施例1
[0023] 参见表1，本研究供试材料为野牡丹属野生种质资源共44份，来源于福建、广东、广 西、海南、云南五个省份。采集新鲜叶片冻于液氮，保存在-80°C。
[0024] 表1野牡丹属44份供试种质资源
[00巧]Table 1 44individuals of Melastoma
[0026]
[0027]
[0028] 实施例2
[0029] DNA 提取
[0030] 采用前期试验确定的改良CTAB法提取野牡丹基因组DM,主要步骤为：
[0031] (1)取约Ig新鲜嫩叶，放入预冷的研鉢中，在液氮中迅速研磨成粉末，转入预冷的 lOmL离屯、管中，加入4mL预热至65°C的CTAB抽提液，同时加入80化β-琉基乙醇，缓慢上下颠 倒混匀，65°C水浴60min(期间每lOmin颠倒混匀1次）。
[0032] (2)取出离屯、管冷却至室溫，加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)，混匀，放在水平摇 床上缓慢摇晃30min，静置后于4°C、7 500g离屯、5min，回收上(水)相。
[0033] (3)在回收的上层相中加入1/10体积的CTAB/NaCl溶液(65°C)，颠倒混匀。重复步 骤2。若上清混浊，将上清液转入另一只lOmL离屯、管中，再加等体积的氯仿/异戊醇(24:1)， 混匀，放在水平摇床上缓慢摇晃30min，静置后于4°C、7 500g离屯、5min。
[0034] (4)加入1倍体积的CTAB沉淀液，颠倒混匀。如果看不到沉淀，于65°C溫育30min。然 后于4°C、9 OOOg离屯、5min。用0.5mL高盐TE缓冲液重悬沉淀，如果沉淀难重悬，于65°C溫育 30min，重复，直至所有的或大部分沉淀溶解。
[0035] (5)加入0.6体积预冷异丙醇，混匀，静置后于4°C、7500g离屯、15min，弃上清得到白 色DNA，加入ImL 80%乙醇漂洗2次，再加入11^无水乙醇漂洗1次，风干0魁沉淀，加入0.11111 TE缓冲液，待DNA沉淀溶解后，于4 °C保存备用。
[0036] 通过1%琼脂糖凝胶电泳检测，并用分光光度法定量后，-20°C保存备用。
[0037] PCR 反应
[003引 ISSR反应体系：DNA模板（30ng/uL)0.7uL，10 X buf f er2uL，dNTP(1 OmM)0.6uL，引物 (1 OuM)0.8uL，Taq酶（5U/uL)0. luL，d地20定容20uL，
[0039]反应程序：94°C 预变性 5min;94°C 变性 lmin;53°C 退火 40sec;72°C 延伸 2min。
[0040] 引物筛选：从116条ISSR随机引物中筛选出11条多态性好、条带清晰的引物： UBC857、UBC848、UBC842、UBC841、UBC821、UBC820、UBC811、CW32506、CW32488、CW32451、 CW32447〇
[0041] 指纹图谱建立
[0042] 根据ISSR专用引物方法通过PCR反应扩增出的条带图片，对同一引物所扩增出迁 移率相同的条带计为一个位点，有条带的位置计为"Γ，无条带位置计为"0"，所得数据输入 Excel2003工作表建成原始"0/Γ数据矩阵，利用NTSl^聚类分析软件进行聚类分析。针对所 有供试品种，对11条ISSR引物扩增出的条带进行比对，选出鉴别能力较强的引物，然后对由 运些引物经PCR反应跑出的电泳条带进行形象化处理，同一位点上记为"Γ的电泳条带用黑 色方块表示，记为"0"的条带用白色方块表示，据此构建出供试的44份野牡丹属种质资源的 DNA指纹图谱。见图2。
[0043] 本实施例W前期试验筛选出的11条ISSR随机引物对供试的44份野牡丹属种质资 源进行DNA多态性检测，总共扩增出91条清晰度好，重复性高的谱带，其中多态性谱带有90 条，多态性条带比例为98.9% (见表2)。扩增结果表明，扩增位点最多的引物为UBC857、 UBC811和CW32506,位点数均为12个。其中引物UBC857对44份野牡丹属种质DNA的扩增图谱 见图1。
[0044] 由于ISSR引物的多态性，同一引物扩增出的44份野牡丹属种质资源的条带有明显 差异。比对结果表明：利用引物UBC811可W鉴别出38份野牡丹属种质资源，利用引物UBC851 可W鉴别出42份野牡丹属种质资源，而采用引物UBC811和UBC857组合可W鉴别出供试的44 份野牡丹种质资源。
[0045] 引物UBC811 和UBC857序列分别为GAG AGA GAG AGA GAG AC和ACA CAC ACA CAC ACA CTG。
【主权项】
1. 一种用于鉴别野牡丹属种的ISSR专用引物，其特征在于:它包括两条引物： 1. UBC857,其序列为ACA CAC ACA CAC ACA CYG; 2. UBC811，其序列为GAG AGA GAG AGA GAG AC。2. -种用于鉴别野牡丹属种的方法，包括如下步骤： 1) 根据权利要求1所述的UBC857和UBC811引物，建立野牡丹ISSR指纹图谱； 2) 提取野牡丹基因组DNA; 3) 提供权利要求1所述的UBC857和UBC811引物，进行PCR扩增； 4) 扩增产物凝胶电泳，分析条带，并与野牡丹ISSR指纹图谱比对，确定野牡丹属种。3. 如权利要求2所述的一种用于鉴别野牡丹属种的方法，其特征在于，步骤2)的基因组 DNA来自叶片。4. 如权利要求2所述的一种用于鉴别野牡丹属种的方法，其特征在于，步骤3)在如下反 应条件下进行： 30叫/乩0财模板0.7此，10\1311打6121^，10111]\1(1町？0.61^，10碰引物0.81^，51]/1^ Taq酶0 . luL，ddH20定容至20uL，反应程序：94°C预变性5min ; 94°C变性lmin ; 53 °C退火 40sec; 72°C 延伸 2min。5. -种野牡丹ISSR指纹图谱，其特征在于，根据权利要求1所述的UBC857和UBC811引物 建立。
【文档编号】C12Q1/68GK106011225SQ201610230069
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年4月14日
【发明人】郑涛, 陈振东, 何雪娇, 林秀香, 林艺华
【申请人】福建省热带作物科学研究所