一种新型(r)?羟基腈裂合酶的制作方法
【专利摘要】本发明的目的是提供一种比植物来源的羟基腈裂合酶稳定性更高、使用其基因可以异源表达的羟基腈裂合酶，编码该羟基腈裂合酶的基因以及该羟基腈裂合酶的制备方法。本发明涉及的羟基腈裂合酶，其特征在于，该羟基腈裂合酶具有序列编号3的氨基酸序列等特定的氨基酸序列。
【专利说明】
-种新型(R)-哲基腊裂合酶
技术领域
[0001] 本发明设及一种比植物来源的径基腊裂合酶稳定性更高，并且也可W使用其基因 异源表达的（R)-径基腊裂合酶，编码该径基腊裂合酶的基因，W及该径基腊裂合酶的制备 方法。
【背景技术】
[0002] 径基腊裂合酶是催化在氯化物供体的存在下将幾基化合物转换为氯醇（a-径基 腊)的反应的酶。氯醇由于可转换为a-径基酸、a-径基酬、0-氨基醇等各种化合物，是医药领 域和化学品领域等的重要中间体。因而，期待开发可W大量生产径基腊裂合酶的方法。
[0003] 径基腊裂合酶分为(S)选择性和(R)选择性两种。其中，（R)-径基腊裂合酶催化在 酸性条件下由酬或醒与氯化合物生成(R)-氯醇的反应。作为该反应的代表例，可W为由苯 甲醒和作为氯化合物的氯酸生成(R)-苯乙醇腊的反应。此外，（1〇-径基腊裂合酶可W用作 由低价的底物生产作为医药和化学制品中间体利用价值高的光学活性体的生物催化剂，在 多个领域中极其有用。
[0004] 为了在光学活性氯醇的工业生产中利用径基腊裂合酶，期待开发可大量生产每个 菌体或每个蛋白质的活性高的立体选择性高的径基腊裂合酶的方法。
[0005] 径基腊裂合酶公知主要在具有氯巧的植物中存在。例如，作为(R)-径基腊裂合酶 可知来源于扁桃(Primus amygdalus)等的菩薇科植物。此外，作为（S)-径基腊裂合酶可知 来源于高梁（Sorghum bicolor)等的稻科植物，或木馨（Manihot esculenta)、橡胶树 巧evea brasi 1 iensiS)、薇巧(Bal iospermum)等的大戟科植物。但是，仅能从W上的植物体 中提取微量的径基腊裂合酶。
[0006] 因此，为了大量得到径基腊裂合酶，尝试通过基因工程方法得到径基腊裂合酶(专 利文献1-9)。然而，使用转化株表达异源蛋白质时，存在不能直接应用根据同源蛋白质的研 究得到的表达量和生化活性等的结果的情况。即，使用转化株表达异源蛋白质时，不能容易 地预先预测转化株的行为、表达量、目标蛋白质的生化活性等。
[0007] 现有技术文献 [000引专利文献
[0009] 专利文献1:日本特表平11-508775号公报
[0010] 专利文献2:日本特开2000-189159号公报
[0011] 专利文献3:日本特开2000-189160号公报
[0012] 专利文献4:日本特开2000-245486号公报
[0013] 专利文献5:日本特开2002-330791号公报
[0014] 专利文献6:国际公开第01/48178号小册子
[0015] 专利文献7:日本特开2004-194550号公报
[0016] 专利文献8:日本特开2004-194551号公报
[0017] 专利文献9:日本特开2000-125886号公报
【发明内容】
[0018] 如上述，径基腊裂合酶是在产业上非常重要的酶，工业上的利用也需要稳定供给。 但是，将在具有氯巧的植物中发现的径基腊裂合酶从植物体中精制时，只能得到少量。另一 方面，径基腊裂合酶存在难W异源表达的问题。此外，用径基腊裂合酶生产光学活性化合物 时，酶需要暴露在苛刻的条件下，因此期待得到稳定性高的酶。
[0019] 由此本发明的目的在于提供一种比植物来源的径基腊裂合酶稳定性更高并且也 可W使用其基因异源表达的(R)-径基腊裂合酶，编码该径基腊裂合酶的基因，W及该径基 腊裂合酶的制备方法。
[0020] 本发明的发明人为了解决上述问题进行了深入研究。其结果发现，在特定的区域 周期性大量出现的马陆（个シパ瓜b哥力个乂尹)产生的(的-径基腊裂合酶具有极好的稳定 性，从而完成了本发明。
[0021] [1]具有下述(1)-(3)中的任意一项的氨基酸序列的(R)-径基腊裂合酶。
[0022] (1)序列编号3所示的氨基酸序列；
[0023] (2)上述（1)中规定的氨基酸序列中，1个或数个的氨基酸缺失、替换和/或插入的 氨基酸序列，并且与具有序列编号3所示的氨基酸序列的天然型(的-径基腊裂合酶相比较， 具有该氨基酸序列的（R)-径基腊裂合酶的径基腊裂合酶活性保持不变或者更高的氨基酸 序列；
[0024] (3)与上述(1)中规定的氨基酸序列具有至少30%的同源性的氨基酸序列，并且与 具有序列编号3所示的氨基酸序列的天然型(R)-径基腊裂合酶相比较，具有该氨基酸序列 的(R)-径基腊裂合酶的径基腊裂合酶活性保持不变或者更高的氨基酸序列。
[0025] [2]上述[1]所述的(R)-径基腊裂合酶，该(R)-径基腊裂合酶为具有上述（1)-(3) 中的任意一项的氨基酸序列的亚基的二聚体。
[0026] [3]上述[1]或[2]所述的（R)-径基腊裂合酶，该（1〇-径基腊裂合酶为马陆属 (Qiamber 1 inius)来源。
[0027] [ 4]上述[3]所述的（R)-径基腊裂合酶，该（R)-径基腊裂合酶为马陆 (Chamberlinius hu曰lienensis)来源。
[0028] [引具有下述(4)-(6)中任意一项的碱基序列的(R)-径基腊裂合酶基因。
[0029] (4)序列编号2所示的碱基序列；
[0030] (5)上述(4)中规定的碱基序列中，1个或数个的碱基缺失、替换和/或插入的碱基 序列，并且与序列编号2所示的碱基序列编码的天然型(R)-径基腊裂合酶相比较，该碱基序 列编码的(R)-径基腊裂合酶的径基腊裂合酶活性保持不变或者更高的碱基序列；
[0031] (6)与上述(4)中规定的碱基序列具有至少30%的同源性的碱基序列，并且与序列 编号2所示的碱基序列编码的天然型(R)-径基腊裂合酶相比较，该碱基序列编码的（1〇-径 基腊裂合酶的径基腊裂合酶活性保持不变或者更高的碱基序列。
[0032] [6]上述[5]所述的(R)-径基腊裂合酶基因，该(的-径基腊裂合酶基因具有序列编 号1所示的碱基序列。
[0033] [7] -种载体，其特征在于，该载体含有上述[引或[6]所述的(的-径基腊裂合酶基 因。
[0034] [引一种转化株，其特征在于，该转化株为通过上述[7]所述的载体转化的转化株。
[0035] [9]-种用于制备(R)-径基腊裂合酶的方法，其特征在于，该方法包括，培养上述 [引所述的转化株得到培养物的工序，W及从上述培养物中精制(的-径基腊裂合酶的工序。
[0036] 本发明的(R)-径基腊裂合酶在马陆个体中含有，但其含量很少。但是，由于马陆周 期性在局部地区大量出现，精制酶的原材料可W比较大量且容易地得到。即，本发明的(R)- 径基腊裂合酶的精制的困难度，能够通过作为原材料的马陆的量克服。此外，本发明的(R)- 径基腊裂合酶稳定性良好，例如，能够适用于作为重要合成中间体的氯醇的制备。从而本发 明的(R)-径基腊裂合酶在产业上非常有用。
【附图说明】
[0037] 图1是分离了本发明的酶的马陆（化amberlinius hualienensis)的照片。（A)为捕 获时比较大型的马陆的照片，（B)为比较小型的马陆的放大照片。
[0038] 图2是示出将从马陆精制的(的-径基腊裂合酶用SDS-PAGE分析的结果的凝胶的照 片。（A)是使用分子量标记物求出分子质量的凝胶的照片，（B)是为了确认糖链的有无而进 行了染色的凝胶的照片。
[0039] 图3(A)-(C)分别为从马陆精制的(R)-径基腊裂合酶的紫外?可见?近红外光谱、 红外光谱W及圆二色谱的测定结果。
[0040] 图4示出从马陆精制的（1〇-径基腊裂合酶的cDNA、推定氨基酸序列W及引物的退 火位点。
[0041] 图5(A)和(B)分别为示出从马陆精制的(的-径基腊裂合酶的反应抑与比活和残余 活性的关系的图表。
[0042] 图6(A)和(B)分别为示出从马陆精制的(1〇-径基腊裂合酶的反应溫度与比活和残 余活性的关系的图表。
[0043] 图7(A)和(B)分别为示出从马陆精制的(R)-径基腊裂合酶与重组(R)-径基腊裂合 酶的反应pH、反应溫度W及比活与残余活性的关系的图表。
【具体实施方式】
[0044] W下，首先对本发明设及的(R)-径基腊裂合酶进行说明。
[0045] <(R)-径基腊裂合酶〉
[0046] 本发明设及的(R)-径基腊裂合酶为上述(1)-(3)中的任意一种。
[0047] 上述（1〇-径基腊裂合酶中，"序列编号3所示的氨基酸序列"为马陆 (化amberlinius hualienensis)来源的天然型径基腊裂合酶的氨基酸序列。马陆特别是在 鹿儿岛县周期性灾害，不仅导致列车停止等，并且，在想要驱除时会放出含有氨氯酸的气 体，造成危害健康等问题。本发明的发明人注意到马陆产生氨氯酸，考虑到其具有径基腊裂 合酶，进行实验，从而成功分离精制了本发明设及的（R)-径基腊裂合酶。此外，由于本发明 设及的(R)-径基腊裂合酶，是从灾害但是没有确定驱除方法的马陆中分离精制的，因此，本 发明作为马陆处理方法的价值也很高。
[004引此外，与马陆在分类上同属带马陆目（Polydesmida)的Nedyopus tambanus tambanus (夕>"八7 力个乂尹）、口日'日;1!'0]11日1'1日 1:〇]1〇111；[]16日（；片、1^八八个乂尹）、 E；pane;rchodussp.(工パ幸/レ3テ'クス属）、E；pane;rchodusfulvus化ga(工パ幸/レ3テ'ク 乂7瓜炒乂）、化脚;1!'〇]11日1'1日 laminate armigera(年シ中个乂尹）、化1山13 gracilis(个少 个乂尹）、化7口1：0。0巧地3 3口.（才才幸个乂尹属）、化日]161'油0山13^'日口〇]1；[。日80日1'1(个7户才 亡、、个乂尹）、Riukiaria semi circular is semicircularis( 了7 t、、。个乂尹）、Nedyopus patrioticus pahioticus(个力个乂尹）也会作为防御物质产生氨氯酸或苯乙醇腊 等化uwahara等，J. Chem. Eco 1. , 37, PP. 232-238 (2011))。此外，本发明的发明人通过预备实 验石角认了，Parafontaria tonominea和Riukiaria semicircularis semicircularis的磨 碎物具有的从苯甲醒合成苯乙醇腊的（R)-径基腊裂合酶活性，分别为4.23U/mg和6.35U/ mg。因此，上述倍足纲动物也产生本发明设及的(R)-径基腊裂合酶，可W从上述倍足纲动物 中精制本发明设及的(R)-径基腊裂合酶。
[0049] 本发明中的"径基腊裂合酶活性"是指，催化由氯化合物和酬化合物或醒化合物生 成氯醇的反应的活性（W下称为"合成活性"），和催化上述反应的逆反应的活性（W下称为 "分解活性"）中的任意一种。本发明中，例如合成活性可W通过测定由苯甲醒生成(R)-苯乙 醇腊的生成量算出。苯乙醇腊的生成量，例如可通过HPLC定量。此外，分解活性可W通过测 定作为底物的苯乙醇腊生成苯甲醒的生成量算出。苯甲醒的生成量，例如可通过测定在巧 樣酸钢缓冲液中，加入径基腊裂合酶和消旋体苯乙醇腊时在波长28化m下的吸光值的增加 量而定量。
[0050] 本发明设及的（R)-径基腊裂合酶，特别地，具有在广泛的pH范围和溫度范围内维 持活性的高稳定性。
[0051] 本发明中酶"具有(特定的)氨基酸序列"是指，该酶的氨基酸序列含有特定的氨基 酸序列，并且可W维持该酶的功能。作为该酶中特定的氨基酸序列W外的序列，除了组氨酸 标签、用于固定化的接头序列之外，可举出二硫键等的交联结构等。此外，具有特定的氨基 酸序列时，也可具有糖链。
[0052] 本发明的上述氨基酸序列（2)中，"1个或数个的氨基酸缺失、替换和/或插入的氨 基酸序列"中的"1个到数个"的范围没有特别的限定，具有缺失等的(R)-径基腊裂合酶只要 具有与具有上述氨基酸序列（1)的天然型(的-径基腊裂合酶的天然型(的-径基腊裂合酶相 同或更好的径基腊裂合酶活性即可。上述"1个到数个"的范围，例如可W为1个W上且30个 W下，优选为1个W上且20个W下，更优选为1个W上且10个W下，进一步优选为1个W上且7 个W下，更进一步优选为1个W上且5个W下，特别优选为1个W上且3个W下、1个W上且2个 W下、1个左右。
[0053] 本发明的上述氨基酸序列（3)中，"与上述（1)中规定的氨基酸序列具有至少30% 同源性的氨基酸序列"中的"序列一致性"，只要是具有与该氨基酸序列同源性的（R)-径基 腊裂合酶，为与具有上述氨基酸序列3的天然型(1〇-径基腊裂合酶相同或更高的径基腊裂 合酶活性的酶就没有特别的限定。虽然与所述氨基酸序列同源性为30% W上就没有特别的 限定，但优选为30 % W上、40% W上、50 % W上、60% W上、70 W上或80 % W上，更优选为 90% W上、92% W上、94% W上或95% W上，进一步优选为96% W上、98% W上、99% W上或 99.5% W上，特别优选为99.8% W上。本发明中的"序列的同源性"运一用语，指的是2个W 上氨基酸序列相互的氨基酸的一致性程度。因而，两个氨基酸序列的一致性越高，他们的序 列一致性或类似性越高。巧巾氨基酸序列是否具有特定的同源性，可W通过序列的直接比较 分析，具体地，可w使用市售的序列分析软件等分析。
[0054] 并且，本发明的发明人使用Blastp检索，未发现与本发明的（1〇-径基腊裂合酶具 有同源性的已知的蛋白质。具体地，Blastp检索中检出的蛋白质仅5类，其中，相对于 BAD3083化ypothetical p;rotein[0ryza sativa Japonica Group]示出了最高的同源性。 但是，该同源性值只不过为44%。并且，该同源性值为与29个氨基酸残基组成的部分序列比 较的结果，与该蛋白质整体的氨基酸序列比较时，同源性值应该是更小的值。即，可W说本 发明的(R)-径基腊裂合酶是与至今已知的蛋白质完全不具有同源性的新型的酶。
[0055] 上述氨基酸序列（2)和(3)中，"与具有序列编号3所示的氨基酸序列的天然型(R)- 径基腊裂合酶相比较，（R)-径基腊裂合酶的径基腊裂合酶活性保持不变或者更高"是指，与 具有序列编号3所示的氨基酸序列的天然型(R)-径基腊裂合酶相比较，作为对象的蛋白质 的径基腊裂合酶活性相对地相同或更高。具体地，针对将要比较的巧巾W上的酶，在相同条 件下进行上述合成反应或分解反应，比较生成物的量，具有上述氨基酸序列（2)和(3)的酶 的活性比上述天然型酶高即可。
[0化6] <基因和载体>
[0057]本发明设及的基因为编码上述(R)-径基腊裂合酶的基因。
[005引上述基因（4)是从马陆（化amberlinius hualienensis)分离精制的编码天然型 (R)-径基腊裂合酶的基因。因而，上述基因（4)也可W用从马陆中制备的cDNA为模板通过 PCR等得到。
[0059] 本发明设及的基因的碱基序列(5)和(6)可W作为编码上述(R)-径基腊裂合酶(2) 或(3)的氨基酸序列的碱基序列进行设计。
[0060] 本发明的基因，例如可W为具有序列编号1或序列编号2的碱基序列的(R)-径基腊 裂合酶基因 DNA或其互补序列，或W上述的片段为探针，通过菌落杂交、Southern blot等公 知的杂交方法从cDNA文库中得到。此外，通过公知的方法合成基因，也可W合成具有序列编 号1或序列编号2的碱基序列的DNA。
[0061] 本发明中的"严格的条件"是指，杂交后的洗净时的条件为盐浓度300mMW上且 2000mM W下，溫度为40°C W上且75 °C W下，优选为盐浓度600mM W上且900mM W下，溫度为65 °C的条件。例如可举出2XSSC、5(TC等的条件。本领域技术人员在运样的缓冲液的盐浓度和 溫度等的条件的基础上，选择其它的探针浓度、探针长度、反应时间等的各个条件，可W设 定用于得到本发明的(的-径基腊裂合酶的条件。
[0062] 关于杂交法的详细的步骤，可W参考"Mole州lar Cloning,A Laboratoiy Manual 化d ed/'Cold Spring化rbor Laboratoiy Press(1989)等。作为杂交的核酸，例如可举出 含有相对于序列编号1或序列编号2的碱基序列，具有至少40% W上，优选为60% W上，更优 选为90% W上的同源性的碱基序列的核酸或其部分片段。
[0063] 本发明中，进行制备(R)-径基腊裂合酶基因的方法没有特别的限定，通常可W采 用公知的方法进行。例如可举出，W天然型(R)-径基腊裂合酶为基础，采用市售的试剂盒产 生位点特异的替换的方法，或将基因 DNA选择性地切开，接着除去或添加选择的寡核巧酸并 连接的方法。
[0064] 运些位点特异诱变法在"Molecular Cloning,A Laboratoir Manual 化d ed." Cold Spring Harbor Press( 1989)、('Current Protocols in Molecular Biology" John Wiley&Sons(1987-1997)、Kunkel'Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,卵.488-92(1985)、Kramer and Fritz Method.Enzymol.,154,pp.350-67(1987)、Kunkel.Method.Enzymol.,85, pp. 2763-6( 1988)等中记载。近年来，利用WKunkel法和Gapped dupler法为基础的定点突 变法的引入变异用的试剂盒，例如可使用QuAChangeTM Site-Directed Mu1:agenesis Kit (Stratagene社制）、GeneTailorTM Site-Directed Mutagenesis System(Invitrogen社 制）、TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System(Mutan-K,Mutan-Super Express Km等： TaKaRa Bio株式会社制）。
[0065] 此外，作为目标的变异引入位点，位于对象基因序列中消化和连接容易的限制酶 位点的附近时，使用引入目标变异的引物(合成寡DNA)并通过进行PCR，可W简单地得到引 入有目标变异的基因 DNA片段。进一步地，也可用将合成寡DNA组合的PCR法(assembly PCR) 进行延长，得到合成基因。
[0066] 此外，通过与径胺或亚硝酸等作为变异源的药剂进行接触作用的方法、紫外线照 射诱发变异的方法、使用PCR(聚合酶链式反应)随机引入变异的方法等的随机引入变异的 方法，也能够从天然型(的-径基腊裂合酶基因得到期望的变异型(R)-径基腊裂合酶基因。
[0067] 为了使通过上述的方法得到的本发明的(R)-径基腊裂合酶基因在宿主中表达，在 基因的上游插入转录启动子，下游插入终止子，构建表达组件，该组件可W插入到表达载体 中。或者，在导入该改良型径基腊裂合酶基因的表达载体中已经存在转录启动子和终止子 时，不需要构建表达组件，利用载体中的启动子和终止子，在启动子和终止子之间插入该变 异基因即可。为了在载体中插入该改良型径基腊裂合酶，可W采用使用限制酶的方法、使用 拓扑异构酶的方法等。此外，插入时必要的话，也可W加入适当的接头序列。并且，本发明 中，运样的重组操作可W在(R)-径基腊裂合酶基因的制备过程的同时进行。即，使用具有替 换成编码其它的氨基酸的碱基序列的碱基序列的引物，W克隆了天然型径基腊裂合酶基因 的重组载体为模板进行PCR，能够将得到的扩增产物重组入载体中。
[0068] 启动子的种类没有特别的限定，在宿主中可W适当地表达即可，例如可举出大肠 杆菌来源的色氨酸操纵子的化P启动子、乳糖操纵子的lac启动子、A隧菌体来源的化启动子 和PR启动子、或枯草芽抱杆菌来源的葡萄糖酸合成酶启动子（gnt)、碱性蛋白酶启动子 (apr)、中性蛋白酶启动子(吨r)，a-淀粉酶启动子(amy)等。此外，也可W使用tac启动子、 trc启动子运样的经改变、设计的序列。
[0069] 终止子不是必需的，其类型也没有特别的限定，例如可W为不依赖P因子的终止 子，例如可举出脂蛋白终止子、trp操纵子终止子、rrnB终止子等。
[0070] 此外，作为在翻译成氨基酸过程重要的碱基序列，已知SD序列和Kozak序列等的核 糖体结合序列，可W将运些序列插入变异基因的上游。使用原核生物作为宿主时，可W将SD 序列通过PCR法等插入，使用真核生物作为宿主时，可W将Kozak序列通过PCR法等插入。作 为SD序列没有特别限定，虽然可举出大肠杆菌来源或枯草芽抱杆菌来源的序列等，但只要 是在大肠杆菌或枯草芽抱杆菌等的需要的宿主内起作用的序列就没有特别的限定。例如， 与16S核糖体RNA的3'末端结构域互补的序列可W通过DNA合成制备4碱基W上连续的一致 序列进行利用。
[0071] -般地，载体中含有用于筛选目标转化株的因子(筛选标记）。作为筛选标记，可举 出耐药性基因或营养缺陷互补基因、赋予同化性基因（資化性付与遺伝子)等，可W根据目 标和宿主进行选择。例如大肠杆菌中作为筛选标记使用的耐药性基因，可举出氨节青霉素 抗性基因、卡那霉素基因、二氨叶酸还原酶基因、新霉素抗性基因等。
[0072] 本发明中使用的载体没有特别的限定，保持上述的变异基因即可，可W使用适应 各自的宿主的载体。作为载体，例如可举出质粒DNA、隧菌体DNA、反转录转座子DNA、人工染 色体DNA等。例如，W大肠杆菌为宿主时，可W使用具有大肠杆菌中可W自主复制的结构域 的 pTrc99A(Centraalbureau voor Sch imme 1 cu 1 tur e s ( CBS )，荷兰，h t tp ://www.cbs.knaw.nl/KpUCigO'aKaRa Bio株式会社，日本）、p邸233-2(Centraa化ureau voor Schimmelcultures(CBS)，荷兰，http: //www. cbs. knaw.nl/)、pET_12(Novagen社，德国）、 祀T-26b (Novagen社，德国）等。此外，可W根据需要使用上述载体经过变异的载体。此外，可 W使用表达效率高的载体，例如具有trc启动子、lac操纵子的表达载体pTrc99A或PKK233-2 等。
[0073] 上述的含有改良型径基腊裂合酶基因的重组载体包含在本发明的范围内。
[0074] <转化株>
[0075] 将本发明的重组载体转化或转导至宿主中，可W制备转化株。该转化株也包含在 本发明的范围内。
[0076] 本发明中使用的宿主没有特别的限定，导入上述的重组载体后，表达目标的（R)- 径基腊裂合酶即可。作为宿主，例如可举出大肠杆菌、枯草芽抱杆菌等的细菌，己斯德毕赤 酵母（Pichiapasto;ris)等的毕赤酵母属（Pichia)、酵母属（Saccha;romyces)、曲霉 (Aspergillus)等的真菌，皿K293细胞等的动物细胞，Sf9细胞、Sf21细胞、High Five(BTI- TN-5B1 -4)细胞等的昆虫细胞，植物细胞等。
[0077] <(R)-径基腊裂合酶的制备方法>
[0078] 本发明的(1〇-径基腊裂合酶可W通过培养上述转化株，通过从得到的培养物中精 制而制备。
[0079] 本发明中的"培养物"是指培养上清液、培养细胞、培养菌体，或者细胞或菌体的破 碎物中的任意一种。培养本发明的转化株得到的培养物包含在本发明的范围内。
[0080] 本发明的转化株的培养，可W按照宿主培养中使用的常规方法进行。目标的（R)- 径基腊裂合酶在上述培养物中蓄积。
[0081] 培养本发明的转化株的培养基含有宿主能够同化的碳源、氮源、无机盐类等，能够 有效地进行培养转化株的培养基即可，可使用天然培养基、合成培养基中的任意一种。作为 碳源，可举出葡萄糖、半乳糖、果糖、薦糖、棉子糖、淀粉等的碳水化合物，乙酸、丙酸等的有 机酸，乙醇、丙醇等的醇类。作为氮源，可举出氨、氯化锭、硫酸锭、乙酸锭、憐酸锭等的无机 酸或有机酸的锭盐或其它含氮化合物。除此之外，也可W使用蛋白腺、酵母提取物、肉提取 物、玉米浆、各种氨基酸等。作为无机物，可举出憐酸二氨钟、憐酸氨二钟、憐酸儀、硫酸儀、 氯化钢、硫酸亚铁、硫酸儘、硫酸锋、硫酸铜、碳酸巧等。此外，根据需要，培养中为了防止发 泡也可W加入消泡剂。此外，也可W根据需要适当添加维生素等。培养中根据需要可W在培 养基中添加氨节青霉素或四环素等的抗生素。
[0082] 培养中，为了防止载体和目标基因的消除，可W在具有筛选压力的状态下培养。 良P，筛选标记为耐药性基因时，可在培养基中添加相应的药剂，筛选标记为营养缺陷互补基 因时，可在培养基中去除相应的营养因子。此外，筛选标记为赋予同化性基因（資化性付与 遺伝子)时，可w根据需要添加相应的同化因子作为唯一的同化因子。例如，培养用含有氨 节青霉素抗性基因的载体转化的大肠杆菌时，培养基中可根据需要添加氨节青霉素。
[0083] 培养作为启动子使用诱导性启动子的表达载体转化的转化株时，根据需要可在培 养基中添加诱导剂。例如，培养具有可用异丙基-e-D-硫代半乳糖巧（IPTG)诱导的启动子的 表达载体转化的转化株时，可W在培养基中添加 IPTG等。此外，培养使用具有可用吗I噪乙酸 (IAA)诱导的trp启动子的表达载体转化的转化株时，可W在培养基中添加 IAA等。
[0084] 转化株的培养条件没有特别的限定，不影响目标的(R)-径基腊裂合酶的生产性和 宿主的增殖的条件即可，通常，培养溫度为l〇°CW上且45°CW下，优选为10°CW上且40°CW 下，更优选为15°CW上且40°CW下，进一步优选为20°CW上且37°CW下，根据需要也可W在 培养中改变溫度。培养时间可为5小时W上且120小时W下左右，优选为5小时W上且100小 时W下，更优选为10小时W上且100小时W下，进一步优选为15小时W上且80小时W下左 右。抑的调整可W使用无机或有机酸、碱溶液等进行，培养大肠杆菌时可调整为6W上且9W 下。作为培养方法，可举出固体培养、静置培养、振荡培养、通气揽拌培养等。
[0085] 用于培养的培养基的初始抑调整为7W上且9W下较为适宜。此外，培养在5°CW上 且40°C W下，优选为10°C W上且37 °C W下进行5小时W上且100小时W下。优选通过通气揽 拌深层培养、振荡培养、静置培养、流加培养等方式实施。
[0086] 本发明设及的（R)-径基腊裂合酶，从上述培养物精制而成，其精制程度没有特别 的限定。例如，可直接使用将上述培养物匀浆再通过过滤或离屯、等除去不溶物的溶液，也可 W使用进一步通过柱层析等精制得到粗酶液或酶液。
[0087] <酶反应>
[0088] (R)-径基腊裂合酶是催化在氯化物供体的存在下将幾基化合物转换为氯醇的反 应的酶，此外也是催化作为其逆反应的氯醇的分解反应的酶。
[0089] 本发明中，作为径基腊裂合酶活性的测定方法，例如可举出在氯化钟的存在下W 苯甲醒作为底物，通过HPLC测定苯乙醇腊的生成量的方法。或者，W消旋体苯乙醇腊为底 物，通过分光光度计在吸收波长280nm测定其分解而检出的方法。作为溶剂，从氯醇的稳定 性角度为中性到酸性，优选使用巧樣酸钢缓冲液。合成反应优选在抑4.0W上且4.2W下左 右进行，分解反应优选在P册W上且5.5 W下左右进行。
[0090] 本发明主张2014年3月4日申请的日本专利申请第2014-42181号为基础的优先权。 2014年3月4日申请的日本专利申请第2014-42181号的说明书的全部内容作为参考引入到 本申请。
[0091 ]实施例
[0092] W下，通过举出实施例对本发明进行具体说明，本发明不受下述实施例的限制，可 在适应上下文的宗旨范围内进行适当的变更实施，运些均包含在本发明的技术范围内。
[0093] 实施例1:天然型(R)-径基腊裂合酶的获得
[0094] (1) (R)-径基腊裂合酶的精制
[00巧]在鹿儿岛县在确认马陆（Qiamberlinius hualienensis)灾害发生的2010年11月、 2011年11月和2012年8月将其捕获。捕获的马陆在放入了干冰的容器中冷却，在-80°C保管 至使用时。图1为活着的马陆的照片。
[0096]冷冻保存的上述马陆(合计化g)在液氮中使用研鉢和研巧磨碎。在冰冷条件下，通 过将得到的微粒在20mM憐酸钟缓冲液(pH7.0)中揽拌3小时W上而悬浊。小屯、地将得到的悬 浊液通过多层重叠的棉纱布过滤，除去固形物。将得到的液体用从娃鱼精液中得到的硫酸 鱼精蛋白（NACALAI TESQ肥社制）处理30分钟后，在4°C、28500Xg条件下离屯、30分钟。从得 到的上清液中，通过W下所示的条件精制酶。并且，W下操作在〇-4°C下进行。
[0097]首先进行硫酸锭分级沉淀，接下来通过柱层析从上述上清液中精制(的-径基腊裂 合酶。柱层析使用DEAE树脂(TOSOH社制/'DEAE-T0Y0PEA化(注册商标)-650M")、疏水性树脂 (TOSOH社制，"Butyl-TOYOPEAEL(注册商标）-650M")、阴离子交换柱（GE Healthcare BioSciences社制，"Q-Sepharose FF")、强阴离子交换柱（GE Healthcare BioSciences社 制，"MonoQTM 5/50化"）W及凝胶过滤层析柱（GE Healthcare BioSciences社制， "Superdex 75"和"Superdex 200 10/300GL")。此外，每个精制工序中，酶的活性在W下所 示的条件下测定。W下将从马陆中精制的该(R)-径基腊裂合酶略记为"R-化HNL"。
[009引（2)酶活性的测定
[0099] 径基腊裂合酶的酶活性，W苯甲醒为底物，按W下的方法测定。即，在400nM巧樣酸 缓冲液(pH4.2，760化）中，将作为底物的苯甲醒1.25M的DMS0溶液(4化L)、适量的酶液(最大 10化L)混合。接下来加入1M KCN(l〇化L)开始合成反应，22°C反应5分钟。反应后，回收反应 液10化L，加入n-己烧:2-丙醇= 85:15的混合液剧烈揽拌，在4°C、16000Xg下离屯、分离3分 钟。回收有机层(500化）。
[0100] 将得到的有机层(5化)在下述条件下用HPLC分析。
[0101] 层析柱：CHIRAL CE化 0J-H柱(Daicel社制）
[0102] 洗脱液:11-己烧:2-丙醇=85:15
[0103] 流速：lmL/min
[0104] 柱加热溫度:30°C
[0105] 检出：254nm
[0106] 保持时间:苯甲醒一5.5分钟
[0107] (R)-苯乙醇腊一12分钟
[010引 （S)-苯乙醇腊一14分钟
[0109] 此外，作为底物的苯甲醒的消耗，通过测定280nm的吸光度进行监测。表1示出每个 精制工序中的酶数据。
[0110] [表 1]
[01111
[0112]此外，由消旋体苯乙醇腊向苯甲醒的分解反应的活性，用下述方法测定。在含有 2mM的消旋体苯乙醇腊的1 OOmM巧樣酸缓冲液(P册.0-5.5)中添加酶溶液，缓慢揽拌，22 °C反 应1-2分钟，苯甲醒的生成量用28化m的吸光度测定。作为苯甲醒的分子吸光系数，适用E280 =1.4mM^cnfi。精制酶的氯醇合成方向的活性，比氯醇分解方向的活性高2.6倍。
[0113] 实施例2:天然型(R)-径基腊裂合酶的结构分析
[0114] (1)分子量和四级结构的分析
[011日]上述实施例1中精制的R-化ML的单体亚基的大小通过使用分子量标记(B i 0-Rad 社制）的SDS-PAGE分析得到。分子量和四级结构，通过使用GE化althcare社制的Superdex 10/300GL的凝胶过滤柱层析求得。具体可参照Dadashipour等，Journal of Biotechnology, 153 ,pp. 100-110(2011) (W下将该文献略记为 "Dadashipour等（2011)")。 SDS-PAGE 的结果如图2(A)所示。图 2(A)中，1为从上开始 97.4kDA、66.2kDa、45KDa、31kDa、 21.5kDa和14.4kDa的分子量标记的泳道，2为精制R-化HMj勺泳道。
[0116] 从SDS-PAGE和凝胶过滤的结果可知，R-畑歷L的分子量为47.3kDa，是分子量为 24.8kDa的亚基的同源二聚体。
[0117] (2)糖链的有无
[0118] 糖链的有无使用Pierce Glycoprotein Seining kit(The;rmo Scientific社制） 进行确认。具体地，SDS-PAGE凝胶中，糖蛋白中含有的顺式二醇被高舰酸氧化为醒，生成的 醒基转化为希夫氏碱呈紫红色，从而可W确认糖链的有无。上述反应中确认R-化H化的糖链 的有无的结果，作为代表性的糖蛋白的辣根过氧化物酶的结果一同在图2(B)中示出。图2 (B)中，1为R-化勺泳道，2为辣根过氧化物酶的泳道。
[0119] (3)分光分析
[0120] 将R-畑H化在20mM憐酸钟缓冲液(PH7.0)中溶解，用紫外可见近红外分光光度计 (岛津制作所制/'UV260(T)在210-600nm的范围内测定，检出辅基。此外，将R-化歷L在室溫、 pH7.0下，通过分光计（Jasco社制，"720 Circular Dichroism Spechophotometer")在 170-30化m的范围内分析。进一步地，用红外分光光度计(Waltham社制，叩erkin-Elmer IR Spectrum 100")，推定精制酶的二级结构。测定R-化证化的紫外?可见?近红外光谱、红外 光谱W及圆二色谱。各自的结果如图3(A)-(C)所示。
[0121] 根据紫外?可见?近红外光谱的测定结果（图3(A))，R-^Hr化不含有辅酶FAD。此 夕h根据红外光谱的测定结果（图3(B))，从1645/cm的峰可知R-化ML是富含0亚基的蛋白 质。进一步地，根据圆二色谱的测定结果（图3(C))，从222皿的圆二色性可知R-化曲化不是富 含a亚基的蛋白质。
[0122] 实施例3:重组型(R)-径基腊裂合酶的制备
[0123] (1)编码R-ChH化的cDNA的克隆
[0124] 将马陆冰冷麻醉，用綴子收集其体节侧突。将取得的组织加入total RNA分离用试 剂（Invitrogen社製，"TRIzol Reagent")中，使用一次性匀浆器（Ni卵i社制，"BioMasher II")匀浆。根据说明书抽提RNA。用于5'/3'-RACE的cDNA使用Clontech Laboratories社制 的SMART RACE cDNA Amplification Kit和SMARTScribe Reverse Transcriptase合成，用 RNase H(TaKaRa Bio社制）处理。
[0125] (2)引物的设计
[01%]使用或不使用in-gel digestion法(APRO Life Science研究所），通过Edman降解 法确定精制的R-化HMJ勺氨基酸序列。W确定的氨基酸序列为基础，设计下述的简并引物。 [0127] PKAAINPI犯f:
[012 引 5'-CC(A/C/G/T)AA(A/G)GC(A/C/G/T)GC(A/C/G/T)AT(A/T/C)AA(C/T)CC(A/C/G/ T)AT(A/T/C)CA(A/G)GA-3'（序列编号4)
[0129] APTALDIKf1：
[0130] 5'-GC(A/C/G/T)CC(A/C/G/T)AC(A/C/G/T)GC(A/C/G/T)TT(A/G)GA(C/T)AT(A/C/ T)AA-3'（序列编号5)
[0131] APTALDIKf2：
[0132] 5'-GC(A/C/G/T)CC(A/C/G/T)AC(A/C/G/T)GC(A/C/G/T)CT(A/C/G/T)GA(C/T)AT (A/C/T)AA-3'（序列编号6)
[0133] APTALDIKrl：
[0134] 5'-TT(A/G/T)AT(A/G)TC(C/T)AA(A/C/G/T)GC(A/C/G/T)GT(A/C/G/T)GG(A/C/G/ T)GC-3'（序列编号7)
[0135] APTALDIKr2：
[0136] 5'-TT(A/G/T)AT(A/G)TC(A/C/G/T)AG(A/C/G/T)GC(A/C/G/T)GT(A/C/G/T)GG(A/ C/G/T)GC-3'（序列编号8)
[0137] AAINPI犯f:
[013 引 5'-GC(A/C/G/T)GC(A/C/G/T)AT(A/C/T)AA(C/T)CC(A/C/G/T)AT(A/C/T)CA(A/G) GA-3'（序列编号9)
[0139] ATINPI犯f:
[0140] 5'-GC(A/C/G/T)AC(A/C/G/T)AT(A/C/T)AA(C/T)CC(A/C/G/T)AT(A/C/T)CA(A/G) GA-3'（序列编号10)
[0141] LAINPI 犯n:
[0142] 5 '-TT(A/G)GC(A/C/G/T)AT(A/C/T)AA(C/T)CC(A/C/G/T)AT(A/C/T)CA(A/G)GA-3 ' (序列编号11)
[0143] LAINPI犯f2:
[0144] 5'-CT(A/C/G/T)GC(A/C/G/T)AT(A/C/T)AA(C/T)CC(A/C/G/T)AT(A/C/T)CA(A/G) GA-3'（序列编号12)
[0145] LTINPI 犯n:
[0146] 5 '-TT(A/G)AC(A/C/G/T)AT(A/C/T)AA(C/T)CC(A/C/G/T)AT(A/C/T)CA(A/G)GA-3 ' (序列编号13)
[0147] LTINPI犯f2:
[014 引 5'-CT(A/C/G/T)AC(A/C/G/T)AT(A/C/T)AA(C/T)CC(A/C/G/T)AT(A/C/T)CA(A/G) GA-3'（序列编号14)
[0149] AAINPI 犯r:
[0150] 5'-TC(C/T)TG(A/G/T)AT(A/C/G/T)GG(A/G)TT(A/G/T)AT(A/C/G/T)GC(A/C/G/T) GC-3'（序列编号15)
[0151] ATINPI犯r:
[0152] 5'-TC(C/T)TG(A/G/T)AT(A/C/G/T)GG(A/G)TT(A/G/T)AT(A/C/G/T)GT(A/C/G/T) GC-3'（序列编号16)
[0153] LAINPI犯rl:
[0154] 5 '-TC(C/T)TG(A/G/T)AT(A/C/G/T)GG(A/G)TT(A/G/T)AT(A/C/G/T)GC(C/T)AA-3 ' (序列编号17)
[01 巧]LAINPI 犯
[0156] 5'-TC(C/T)TG(A/G/T)AT(A/C/G/T)GG(A/G)TT(A/G/T)AT(A/C/G/T)GC(A/C/G/T) AG-3'（序列编号18)
[0157] LTINPI犯rl:
[0158] 5 '-TC(C/T)TG(A/G/T)AT(A/C/G/T)GG(A/G)TT(A/G/T)AT(A/C/G/T)GT(C/T)AA-3 ' (序列编号19)
[0159] LTINPI 犯曲
[0160] 5'-TC(C/T)TG(A/G/T)AT(A/C/G/T)GG(A/G)TT(A/G/T)AT(A/C/G/T)GT(A/C/G/T) AG-3'（序列编号20)
[0161] NCPET 服 CFA 阿：
[0162] 5 '-AA(C/T)TG(C/T)CC(A/C/G/T)GA(A/G)AC(A/C/G/T)CA(C/T)GG(A/C/G/T)TG(C/ T)TT(C/T)GC(A/C/G/T)TT-3'（序列编号21)
[0163] NCPET服CFAFr:
[0164] 5 '-AA(A/C/G/T)GC(A/G)AA(A/G)CA(A/C/G/T)CC(A/G)TG(A/C/G/T)GT(C/T)TC(A/ C/G/T)GG(A/G)CA(A/G)TT-3'（序列编号22)
[0165] 另外，序列前的记号表示设计简并引物时作为基础的氨基酸序列，最后的f和r表 不对应cDNA碱基序列的引物退火的方向。
[0166] (3)PCR
[0167] 使用上述简并引物和聚合酶（Thermo Fisher Scientific社制，"Dream hq DNA polymerase"和Clontech Laboratories制，"Advantage GC2 Polymerase Mix")，进行PCR。 反应为在94°C3分钟后，（i)94°Cl分钟，（ii)4(TCl分钟，（iii)72°Cl分钟的（i)-(iii)的循 环重复进行70次。接下来，使用凝胶（Promega社制，"Wizard SV PCR and Gel Clean-Up System")精制PCR产物，连接至载体（Agilent Technologies社制，"pBluescript II SK ( + )")的Eco RV识别部位。用基因分析仪（Applied Biosystems社制，"3500Genetic Analyzer")确定DM序列。将得到的序列拼接，使用序列拼接软件(Genetyx社制，"ATGC and Genetyx")进行解析。
[0168] W得到的DM序列为基础，设计W下的基因特异性引物。
[0169] R-ChHNL-1:5 '-CTGACTGAAACCTTCGAATGCACCACTCG-3 '（序列编号23)
[0170] R-ChHNL-2:5 ' -GGCATAATGAATCTTGTCGCCGTTTGGAAC-3 '（序列编号24)
[0171] R-ChHNk3:5 '-TTTGGTAGTGGACCAGCGAGCAGGTTGCAC-3 '（序列编号25)
[0172] R-ChHNL-4:5 '-ATAATCCCTTTAAAGTTCAGGTGCAATTAG-3 '（序列编号26)
[0173] R-ChHNL-5:5'-ATACCAACACATCAAACTTACCAAGCTTAG-3'（序列编号27)
[0174] R-ChHNL-6:5 '-ATTATGGCTTACGATTTCGTCGGTGGTCC-3 '（序列编号28)
[0175] 使用上述引物和DNA聚合酶（东洋纺社制/'K0D plus neo")，进行PCR。作为模板， 使用SMART RACE cDNA Amplification Kit制备的上述cDNA。反应为在94°C2分钟后，（i)98 °C 10秒钟W及（ii)68°Cl分钟的循环重复进行35次。PCR产物连接至载体（Agilent Technologies社制，"pBluescript II SK( + r )，确定序列。其它的操作与上述相同。为了避 免错误，全长cDNA序列使用18个独立的克隆进行测定。
[0176] 得到的cDNA的碱基序列和推定的氨基酸序列如图4所示。图4中，星号表示终止密 码子，信号肤W斜体表示，箭头表示引物退火位点，氨基酸残基的下划线表示确定的氨基酸 序列。如上述，克隆了编码马陆来源的（R)-径基腊裂合酶(R-化HNL)的cDNA。推定的氨基酸 序列，Blastp search中没有与任何蛋白质表现出同源性。
[0177] (4)酵母系表达载体的构建
[017引使用基因特异的引物ChHNk4和ChHNk5，W及DNA聚合酶(Agilent Technologies 社制，'申fu 叫tra II fusion HS DM polymerase")扩增cDNA全长。PCR为在95°C2分钟后， (i)95°C20秒钟，（ii)40°C20秒钟，（iii)72°C 1分钟的循环重复进行30次，最后在72°C反应3 分钟。反应液用限制酶(New化gland Biolabs社制/'Dpn r)在37°C下处理1小时。DNA片段 用凝胶精制，连接至载体(Stratagene社制，"pBluescript II SK( + r )，与上述相同地确定 序列。
[01巧]为了将编码成熟ChH化的cDNA片段插入质粒载体pPICZaA(Life technologies社） 中，设计下述的含有限制酶识别位点的引物。
[0180]趾 〇Ikex2-mChua 歴L:
[0181 ] 5 '-GCGCTCGAGAAAAGACTGACTTGTGATCAACTTCCC-3 '（序列编号29)
[0182] ChuaHNLstop-Xbal:
[0183] 5 '-CGCTCTAGATTAGTAAAAAGCAAAGCAACCGTGGGTTTC-3 '（序列编号30)
[0184] 使用上述引物与上述同样地进行PCR，将得到的PCR产物连接至载体(S化atagene 社制，"pBluescript II SK( + )")确认碱基序列后，将插入序列连接至质粒载体化ife Technologies社，"pPICZaA")的限制酶识别位点。
[01化](5)转化株的制备和重组型R-化曲化的精制
[0186] 将制备的质粒载体用限制酶SacI在37°C消化3-4小时。为了得到阳性的酵母克隆， 使用EasySelect Pichia E邱ression KitiXife technologies社）和GS115系统的己斯德 毕赤酵母(Pichia pastoris) ePichia感受态细胞制备方法按照Joan Lin-Cereghino等， BioTechniques，38，pp. 44-48(2005)的方法。将转化株用组氨酸添加最少的丙S醇培养基 培养后，为了诱导蛋白质的表达，进而在组氨酸添加最少的甲醇(0.5%)培养基化中，在30 °C下培养4天。
[0187] 将培养基用切线流过滤系统（夕シッ工シbフ才口一 ?フ小レbレ一シ3シシステ 厶）浓缩，加入阴离子交换柱(DEAE-T0Y0PEARL(注册商标)-650M，柱体积：25mL)。非吸附性 成分用疏水性相互作用层析（Butyl-TOYOPEA化（注册商标）-650M)分离，进而用Superdex 10/300化精制R-ChHNL
[018引实施例4: R-化歴L的底物
[0189] R-化ML的底物通过氯醇合成反应筛选。为了确定R-化ML的底物，使用强阴离子 交换柱组分(2化L，表1)2.抓作为酶样本，空白对照中使用重蒸馈水代替酶样本。将300曲1〇1 的巧樣酸钢缓冲液(pH4.2)、酶样品、50mM的幾基化合物W及1 OOmM的KCN混合(总量：ImL)， 25°C下反应5分钟。结果使用检出波长为254nm的0J-H手性柱的HPLC进行监测，通过检出反 应生成物从而确定活性的有无。
[0190] 但是，苯甲醒W外的芳香族待测化合物，作为50mM的DMS0溶液(4化)反应。用于待 测化合物4-漠苯甲醒的提取溶剂，使用n-己烧:2-丙醇= 19:1的混合溶液。待测化合物不在 水中溶解时，在30°C下W1000-150化pm揽拌。此外，为脂肪族的待测化合物时，反应时间为2 小时。反应后，在反应液40化L中加入二异丙酸60化L，剧烈揽拌，leOOOg下离屯、分离5分钟。 在上清液4(K)化中，加入无水乙酸20化、化晚10化、4-二甲氨基化晚2-3mg，37°C下反应一晚。 接下来，为了氯醇化合物和4-二甲氨基化晚的汽化，在60°C下反应2-4小时。接下来加入水 100化和乙酸乙醋400化，离屯、后，将上清液150化作为样品（参考Effenberger，Stelze;r， Tetrahedron : Asymmetry , 6 , pp . 283-286 (1995))。生成化合物的检出中，使用连接有 Supelcof3-Dex 325柱的气相色谱（Shimadzu社制"GC-20ir )，使用氮气作为载气。确认的活 性的化合物如表2所示。
[0191] [表 2]
[0192]
[0193] 如表2所示的结果一样，R-化歷L不仅可W用一般的天然H化作为底物的苯甲醒，还 可W用各种幾基化合物为底物。
[0194] 实施例5:3-化曲化的动力学分析
[01%]作为基质使用各种幾基化合物或苯乙醇腊的消旋体，在上述相同的条件下进行了 酶反应。但是，作为底物使用苯甲醒时，反应条件为抑5.2且为22°C，或者抑5.8且为35 °C。使 用各种浓度的苯甲醒作为底物，酶活性测定分别进行3次，算出其平均值制作底物饱和曲 线，求出Vmax、Km和kcat的值作出Hanes-Woolf曲线。结果如表3所示。并且，表3中的"S.A/'为 比活，相对比活是相对于作为基质使用苯甲醒在抑5.2、22°C反应时的比活。此外，作为基质 使用苯乙醇腊消旋体时，发生分解反应，不能算出比活。
[0196] [表 3]
[0197]
[019引如表3所示的结果一样，R-化歷L与目前已知的歴L相比，即使它不利用作为的辅酶 FAD，也显示出了最高的kcat/Km值。
[0199] 实施例6:相对于R-化HMi勺溫度和pH的稳定性
[0200] 关于上述实施例1得到的天然型R-化ML或上述实施例3得到的重组型R-化HNL，使 用最终浓度400mM的巧樣酸盐缓冲液W及作为底物的苯甲醒，通过与上述相同的酶反应条 件试验相对于溫度和pH的稳定性。根据溫度的稳定性通过在PH7.0的反应液中，在0-70°C的 溫度范围内反应1小时来测定。此外，将反应溫度设定为20°C、pH变更为3-11并进行了同样 的反应。运时，在抑3-8使用巧樣酸-憐酸缓冲液，在抑8-11使用甘氨酸-NaOH缓冲液。酶活性 按照化dasMpour等(2011)记载的方法测定。天然型R-化歴L的反应抑与比活和残余活性的 关系分别如图5(A)和图5(B)所示，反应溫度与比活和残余活性的关系分别如图6(A)和图6 (B)所示。此外，两种R-畑HNL的反应溫度和反应pH与残余活性的关系分别如图7(A)和图7 (B)所示。图7中，重组型R-ChH化表示为"rec-Pichia"。
[020。 如图5所示，天然来源的R-化ML在抑5.8下显示出的最大活性，pH4时，显示出最大 活性的约10%的活性。运一最适pH，比其它植物来源的ML的最适PH5.1更高。此外，如图5 (B)所示的一样，天然来源的R-化歴L在较宽的抑范围内具有稳定性。
[0202] 此外，如图6所示可知，天然来源的R-化ML在0-70°C的宽的溫度范围内表现出活 性，35°C为最适溫度，60°CW下表现出高活性。并且，已知的植物来源的ML中最稳定的为杏 仁来源的HNL，记载了其即使在60°C下1小时也是稳定的（Woke;r,R等，Methods Enzymol., 228,卵.584-590(1994);化1136]1,1.等，8;[016油]1〇1.4口口1.8;[0油6111.,15,口口.90-99(1992))。 但是，即使是最稳定的杏仁来源的HNL，在75°C下30分钟也会完全失活。相对于此，本发明设 及的R-化歷L的活性，如图6所示，可预测其即使在60°C下保持超过1小时也可维持活性，在 75 °C下保持1小时也可维持20 %的活性。因此，本发明设及的R-化H化与已知的ML相比稳定 性更高。
[0203] 进一步地，如图7所示，重组型R-化HNL，虽然不具有天然来源的R-化ML那样高的 相对于溫度的稳定性，但是相对于pH的稳定性与天然来源的R-化ML相同甚至更高，此外， 与一般的酶相比，显示出了非常高的稳定性。
[0204] 实施例7 :R-ChHNL活性抑制剂的研究
[0205] 针对R-化HNL，用每种活性抑制剂进行实验。在与上述相同的酶反应条件下，使用 实施例1中得到的天然来源的R-化HNL，在反应液中加入ImM或0.1 mM浓度的待测化合物，在 lOmM憐酸钟缓冲液(PH7.0)中，在20°C进行60分钟的反应。残余活性测定了立次。其平均值 如表4所示。
[0206] [表 4]
[0207]
[0208] 如表4所示的结果一样，试验的待测化合物中，只有少数化合物显示出了抑制活 性。例如，作为琉基试剂的舰乙酸和舰乙酷胺在浓度达到1 OmM时抑制R-化ML的活性。作为 著名的丝氨酸蛋白酶抑制剂的PMSF也显示出了同样的趋势。硫氯酸锭强烈抑制大戟科植物 的橡胶树^、°弓年7 厶）和斑巧属来源的S-H化的活性，但是不抑制本发明设及的R-化HNL 的活性。金属中，隶离子和银离子仅显示出30-40%的抑制活性。从W上的结果可知，本发明 设及的R-化HNL，即使在针对W往的酶的各种的活性抑制剂的存在下也显示稳定的活性。
【主权项】
1. 一种(R)-羟基腈裂合酶，其中，该(R)-羟基腈裂合酶具有下述（1)-(3)中的任意一项 的氨基酸序列； (1) 序列编号3所示的氨基酸序列； (2) 上述（1)中规定的氨基酸序列中，1个或数个的氨基酸缺失、替换和/或插入的氨基 酸序列，并且与具有序列编号3所示的氨基酸序列的天然型(R)-羟基腈裂合酶相比较，具有 该氨基酸序列的(R)-羟基腈裂合酶的羟基腈裂合酶活性保持不变或者更高的氨基酸序列； (3) 与上述（1)中规定的氨基酸序列具有至少30%的同源性的氨基酸序列，并且与具有 序列编号3所示的氨基酸序列的天然型（R)-羟基腈裂合酶相比较，具有该氨基酸序列的 (R)-羟基腈裂合酶的羟基腈裂合酶活性保持不变或者更高的氨基酸序列。2. 根据权利要求1所述的(R)_羟基腈裂合酶，其中，所述(R)_羟基腈裂合酶为具有上述 (1)-(3)中的任意一项的氨基酸序列的亚基的二聚体。3. 根据权利要求1或2所述的（R)-羟基腈裂合酶，其中，所述(R)-羟基腈裂合酶为马陆 属(Chamber linius)来源。4. 根据权利要求3所述的（R)_羟基腈裂合酶，其中，所述（R)_羟基腈裂合酶为马陆 (Chamberlinius hualienensis)来源。5. -种(R)_羟基腈裂合酶基因，其中，该(R)_羟基腈裂合酶基因具有下述(4)-(6)中任 意一项的喊基序列； (4) 序列编号2所不的喊基序列； (5) 上述(4)中规定的碱基序列中，1个或数个的碱基缺失、替换和/或插入的碱基序列， 并且与序列编号2所示的碱基序列编码的天然型(R)-羟基腈裂合酶相比较，该碱基序列编 码的(R)-羟基腈裂合酶的羟基腈裂合酶活性保持不变或者更高的碱基序列； (6) 与上述(4)中规定的碱基序列具有至少30%的同源性的碱基序列，并且与序列编号 2所示的碱基序列编码的天然型(R)_羟基腈裂合酶相比较，该碱基序列编码的（R)_羟基腈 裂合酶的羟基腈裂合酶活性保持不变或者更高的碱基序列。6. 根据权利要求5所述的(R)-羟基腈裂合酶基因，其中，所述(R)-羟基腈裂合酶基因具 有序列编号1所示的碱基序列。7. -种载体，其特征在于，该载体含有权利要求5或6所述的(R)-羟基腈裂合酶基因。8. -种转化株，其特征在于，该转化株为通过权利要求7所述的载体转化的转化株。9. 一种用于制备(R)_羟基腈裂合酶的方法，其特征在于，该方法包括，培养权利要求8 所述的转化株得到培养物的工序，以及从上述培养物中精制(R)-羟基腈裂合酶的工序。
【文档编号】C12N1/19GK106062191SQ201580011747
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2015年3月3日 公开号201580011747.X, CN 106062191 A, CN 106062191A, CN 201580011747, CN-A-106062191, CN106062191 A, CN106062191A, CN201580011747, CN201580011747.X, PCT/2015/56179, PCT/JP/15/056179, PCT/JP/15/56179, PCT/JP/2015/056179, PCT/JP/2015/56179, PCT/JP15/056179, PCT/JP15/56179, PCT/JP15056179, PCT/JP1556179, PCT/JP2015/056179, PCT/JP2015/56179, PCT/JP2015056179, PCT/JP201556179
【发明人】浅野泰久, M·D·拉克莫萨利, 石田裕幸
【申请人】公立大学法人富山县立大学