本发明涉及荧光染料领域，具体涉及一种新型蓝光电泳核酸染料及其制备方法和用途。
背景技术
荧光染料可用于检测和分析生物学样品。由于荧光染料具有很高的灵敏度，因此可以用来检测非常少量的样品。还可以使用荧光染料来对活细胞器或者组织样品成像，与放射性探针相比，荧光探针灵敏度高，毒性比较低且容易进行处理。
可用荧光染料检测核酸(包含dna和rna)及含核酸的生物学样品。核酸聚合物，例如dna和rna参与将遗传信息从一代传递至下一代，以及参与活体的常规机能。因此，核酸是非常令人感兴趣的研究目标。能特异性结合核酸并形成具有高度荧光复合物的荧光核酸是这种研究的有力工具。可利用这些染料检测各种介质，例如纯溶液、细胞提取物、电泳凝胶、微阵列芯片、活的或固定细胞、死细胞和环境样品中是否存在dna和rna及其含量。可用这些染料定量检测实时聚合酶链反应(qpcr)中的dna，实时荧光定量pcr技术通过检测pcr产物中荧光信号强度来达到定量的目的，该技术不仅实现了pcr从定性到定量的飞跃，而且与常规pcr相比，它具有特异性更强、有效解决pcr污染问题、自动化程度高等特点，目前已在动植物基因工程，微生物和医学领域中得到广泛应用。
在各种核酸检测方法中，核酸荧光染料由于简便和高灵敏度从而得到广泛应用，荧光核酸染料本身不具有荧光或者荧光非常弱，但是与核酸结合后则具有很强的荧光，因此在检测时信噪比比较高，而核酸染料与核酸的结合模式可以是插入两条核酸的碱基对中，也可以插入dna双链的小沟中，或者二者兼有模式。
在核酸应用过程中，特别在核酸电泳过程中，使用和处理核酸染料的人员对染料的安全性具有较高的要求，因为染料与dna有特异的结合能力，可能会干扰细胞内核酸的复制、转录和翻译。另一方面，在uv或者其它条件下，核酸染料可能会引起核酸的诱变。同时由于在核酸凝胶染色中在平时实验中需要使用大量的核酸染料溶液量，因此需要特别关注核酸的安全性。广泛使用的凝胶染料溴化乙锭，可以诱导致癌已广为人知。其它染料例如sybrsafe，已经被证实其诱变性比溴化乙锭要低。但是其在高浓度下仍然具有诱变性。
聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的凝胶，具有立体网状结构，并且密集度较高，具有分子筛效应、浓缩效应、电荷效应，对于小片段dna(5bp-500bp)具有良好的分离效果。但是，作为核酸凝胶染料的荧光染料，在染色分离核酸分子时很难渗透入中，从而导致核酸染色效果很差。
中国专利cn106008495a公开了用于聚丙烯酰胺凝胶电泳的新型核酸染料的制备方法，其所制备得到的产品化合物为
因此，核酸凝胶染料的安全性以及核酸染料在高密度聚丙烯酰胺凝胶染色中染料渗透难度，仍然是急需解决的难题。
技术实现要素：
本发明的目的是针对现有技术缺陷的问题，提供一种新型蓝光电泳核酸染料及其制备方法和用途，此种新型蓝光电泳核酸染料与核酸具有很高的特异结合能力，该染料对核酸的灵敏度高，而且不易渗透入活细胞，从而解决了染料的安全性问题，而且整体分子较小，从而更加容易渗透入聚丙烯酰胺凝胶中，从而提高核酸在聚丙烯酰胺凝胶中的染色效果。
为了实现上述目的本发明采取的技术方案是：
一种新型蓝光电泳核酸染料，其结构如式(i)所示：
式(i)中：
r为c2～c4烷基。
更具体的，式(i)中，r为正丙基，其结构如式(ii)所示：
本发明还提供了式(ii)的新型蓝光电泳核酸染料的制备方法，包括以下步骤：
步骤1)的反应方程式为：
其中：
步骤2)的反应方程式为：
其中：
步骤3)的反应方程式为：
其中：
步骤4)的反应方程式为：
其中：
优选的，步骤1)的反应操作如下：
在单口烧瓶中，加入4-甲基喹啉和乙腈，然后加入碘丙烷，室温搅拌反应2-3天，tlc跟踪反应，反应结束后，旋蒸除去乙腈，加入乙醚，有固体析出，过滤，乙醚洗涤，干燥得到中间体i；
中间体i的核磁氢谱数据如下：
1hnmr(cd3od)δ0.9(3h,m),1.42(2h,m),2.6(3h,s)，4.7(2h,t),7.8(1h,d),8.06(1h,m),8.24(1h,m),8.4(1h,d)8.6(1h,d)，8.90(1h,d)。
优选的，步骤2)的反应操作如下：
在装有磁力搅拌的单口烧瓶中，加入氯磺酸，缓慢分批加入2-甲硫基苯并噻唑，加入完毕后35℃反应过夜，冷却到室温，在搅拌下将反应混合物加入到冰中，继续搅拌，过滤得到白色固体；
将白色固体悬浮在水中，加入氢氧化钠溶液，室温下搅拌过夜，过滤得到固体，将固体重新放入甲醇中搅拌，过滤得到中间体ii；
中间体ii的核磁氢谱数据如下：
1hnmr(cd3od)δ2.81(3h,s),7.8(1h,d),8.06(1h,d),8.4(1h,s)。
优选地，氢氧化钠的质量百分数为5％-25％，将固体重新投入甲醇中搅拌时间为：6-10h。
优选地，所述步骤3)的反应操作如下：
将中间体ii和对甲苯磺酸甲酯加入dmf中，在100℃-160℃下反应1-4h，冷却降温到70-90℃，加入乙酸乙酯回流1-2h后过滤得到中间体iii；
中间体iii的核磁氢谱数据如下
1hnmr(cd3od)δ2.41(6h,s),4.4(3h,s)，7.8(2h,d),7.7(3h,m),7.9(1h,s)，8.2(1h,d)。
优选地，在120℃下反应2h，冷却降温到80℃，加入乙酸乙酯回流1h。
优选地，所述步骤4)的反应操作如下：
将中间体iii与中间体i溶解在dmf中，在室温下滴加三乙胺，滴加完毕后，室温搅拌过夜，倒入乙醚中，析出的固体过滤，乙醚洗涤，用水溶解，hplc制备得到产品蓝光电泳核酸染料；
产品蓝光电泳核酸染料的核磁氢谱数据如下
1hnmr(cd3od)δ0.93(3h,t),1.62(2h,m)，3.7(2h,t),4.9(3h,s)，5.5(1h,d),6.7(1h,s)，7.3(1h,d)，6.6(2h,m)，7.5(4h,m)，7.8(1h,d)。
新型蓝光电泳核酸染料的在聚丙烯酰胺凝胶电泳或琼脂糖凝胶电泳中的应用。
本发明在苯环上引入磺酸基是提高化合物水溶性的最佳手段，实施起来比较容易，并且苯环具有刚性结构从而使磺酸基团不容易发生弯曲扭动，从而更加不容易渗透进入活细胞，更加提高了本化合物的安全性；本发明因为整体分子结构较小，在应用过程中，在较为致密的聚丙烯酰胺中很容易与目标dna结合，并且在电泳过程中迁移顺利，不会发生拖尾或者条带形状不规则，达到很好的应用效果。
本发明有益效果在于：
1、本发明的新型蓝光电泳核酸染料，与核酸具有很高的特异结合能力，对核酸具有高灵敏度和高稳定性，而且有效改善了传统核酸染料具有高毒性的特性。
2.本发明的新型蓝光电泳核酸染料整体分子较小，从而更加容易渗透入聚丙烯酰胺凝胶中，可以用于琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶染色。
附图说明
图1为本发明的新型蓝光电泳核酸染料用于聚丙烯酰胺凝胶进行dna染色的效果图；
图2为本发明的新型蓝光电泳核酸染料与sybrsafe核酸染料用于核酸染色后的凝胶电泳效果图。
具体实施方式
为了使本技术领域的技术人员能更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图对其具体实施方式进行详细地说明：
一种新型蓝光电泳核酸染料，其结构如式(i)所示：
式(i)中：r为c2～c4烷基。
优选的，r为正丙基，新型蓝光电泳核酸染料结构如式(ii)所示：
式(ii)的新型蓝光电泳核酸染料的制备方法，共分为下列四步反应：
步骤1)的反应方程式为：
其中：
步骤1)的反应操作如下：
在100ml的单口烧瓶中，加入10g(69.8mmol)4-甲基喹啉和100ml乙腈，然后加入35.6g(209.4mmol)碘丙烷，室温搅拌反应2-3天，tlc跟踪反应，所用展开剂为体积比为5:1的甲醇/二氯甲烷溶液，反应结束后，旋蒸除去乙腈，加入200ml乙醚，有固体析出，过滤，乙醚洗涤，干燥得到17.5g中间体i，产率为80％。
中间体i的核磁氢谱数据如下：
1hnmr(cd3od)δ0.9(3h，m)，1.42(2h，m)，2.6(3h，s)，4.7(2h，t)，7.8(1h，d)，8.06(1h，m)，8.24(1h，m)，8.4(1h，d)8.6(1h，d)，8.90(1h，d)。
步骤2)的反应方程式为：
其中：
步骤2)的反应操作如下：
在装有磁力搅拌的100ml单口烧瓶中，加入50ml氯磺酸，缓慢分批加入10g2-甲硫基苯并噻唑，加入完毕后在35℃反应过夜，冷却到室温，在搅拌下将反应混合物加入到700g冰中，继续搅拌，过滤得到白色固体。
将白色固体悬浮在150ml水中，加入20ml10％的氢氧化钠溶液，室温下搅拌过夜，过滤得到固体，将固体重新放入100ml甲醇中搅拌8h，过滤得到4g中间体ii，产率为26％。
中间体ii的核磁氢谱数据如下：
1hnmr(cd3od)δ2.81(3h，s)，7.8(1h，d)，8.06(1h，d)，8.4(1h，s)。
步骤3)的反应方程式为：
其中：
步骤3)步骤的反应操作如下：
4g中间体ii和12.6g对甲苯磺酸甲酯加入30mldmf中，在120℃下反应2h后，冷却降温到80℃，加入150ml乙酸乙酯回流1h后过滤得到中间体iii，产率为80％。
中间体iii的核磁氢谱数据如下：
1hnmr(cd3od)δ2.41(6h，s)，4.4(3h，s)，7.8(2h，d)，7.7(3h，m)，7.9(1h，s)，8.2(1h，d)。
步骤4)的反应方程式为：
其中：
dmf为n，n-二甲基甲酰胺；
et3n为三乙胺；
步骤4)步骤的反应操作如下：
4.7g中间体iii与3.13g中间体i溶解在30mldmf中，在室温下滴加2.78ml三乙胺，滴加完毕后，室温搅拌过夜，倒入乙醚中，析出的固体过滤，乙醚洗涤，用水溶解，hplc制备得到产物2g，产率为57％。
产物的核磁氢谱数据如下：
1hnmr(cd3od)δ0.93(3h，t)，1.62(2h，m)，3.7(2h，t)，4.9(3h，s)，5.5(1h，d)，6.7(1h，s)，7.3(1h，d)，6.6(2h，m)，7.5(4h，m)，7.8(1h，d)。
制备的新型蓝光电泳核酸染料，可以用于琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶染色。
请参阅图1，使用hm-150蓝光电泳凝胶设备进行电泳实验，用10％丙烯酰胺tbe凝胶分离dnaladder和阳性参照品，用上述新型蓝光电泳凝胶染料以0.4um浓度对凝胶进行后染，染色时间大约30分钟，用sybr滤光片进行观测，最左侧为dnaladder，其它条带为不同阳性参考样本。从实验结果看出，条带分离清晰，灵敏度很高。
图2为本发明的新型蓝光电泳核酸染料与sybrsafe核酸染料用于核酸染色后的凝胶电泳效果图。从图2可以看出，本发明的新型蓝光电泳核酸染料比常规的sybrsafe核酸染料更灵敏，使用本发明的新型蓝光电泳核酸染料可以比常规的sybrsafe核酸染料获得更优异的染色效果。
综上所述，本发明的新型蓝光电泳核酸染料及其制备方法和用途，此种新型蓝光电泳核酸染料不仅具有比普通核酸染料的更高的灵敏度和稳定性，而且有效改善了传统核酸染料具有高毒性的特性，而且可以用于聚丙烯酰胺凝胶染色。
本技术领域中的普通技术人员应当认识到，以上的实施例仅是用来说明本发明，而并非用作为对本发明的限定，只要在本发明的实质创造构思范围内，对以上所述实施例的变化、变型都将落在本发明的权利要求书范围内。