本发明涉及一种可用于生物3d打印的高强度双网络生物墨水及其制备方法和应用。
背景技术：
生物墨水作为一种典型的软物质材料，通常是各类天然生物材料或者具有生物相容性的人工合成材料，多是透明质酸、明胶、藻酸盐、纤维素、壳聚糖等天然高分子及其衍生物。生物3d打印墨水材料中常含有活细胞或其它活性组分，这些生物或者人工合成材料为细胞或活性组分提供一定程度的保护、促进它们的生长，其他一些材料则扮演“骨骼”的角色，支撑起打印出的组织，防止其坍塌。由于打印时需要保证不破坏生物材料和细胞的生物学活性，打印条件极为苛刻，对生物3d打印用墨水材料的要求也极高。生物3d打印墨水要求材料具有良好的生物相容性、合适的黏度、足够的强度、营养通透性、结构稳定性、较高的打印保真度和温和的成型固化工艺。目前可用于生物3d打印的墨水材料种类极少，通用性不强，是生物3d打印技术应用的一大瓶颈，严重影响着3d打印产业的发展。理想的生物3d打印墨水材料在生物医疗卫生和组织工程等领域将发挥举足轻重的作用，具有很大的应用潜力。
生物3d打印墨水在生物医疗卫生和组织工程领域的应用成效与生物墨水的体系组成、固化成型工艺有着直接的联系。cn105504311a公开了一种壳聚糖衍生物水凝胶及其制备方法，这种水凝胶具有温度敏感性，低温下呈溶胶状态，高温下呈凝胶状态，这种凝胶随温度变化的溶胶-凝胶转变特性可使其作为生物墨水材料，但该凝胶体系包含化学溶剂和多种小分子化学物质，影响材料的生物相容性。cn105238132a公开了一种用于3d打印的生物墨水，该墨水体系由水溶性聚合物、水溶性天然高分子、生物活性组分、交联剂和溶剂等组成，但该体系组成的生物墨水需在紫外光条件下固化成型，可能会对体系中的活性组分造成一定的损伤。
现有的生物3d打印墨水材料通常是各类天然生物材料或者具有生物相容性的人工合成材料，通常生物3d打印墨水常用的生物3d打印方法一般先打印生物相容性好的高分子材料以提供支架，都存在打印过程较复杂、打印条件苛刻、力学性能不足、固化成型时间长、打印保真度不高、打印结构稳定性不好等问题。大多需要通过紫外光照射固化成型，紫外光照射对打印结构的生物活性造成很大的破坏、对操作工人员造成一定的安全威胁。另外，现有的生物3d打印墨水材料多存在生物相容性不好、力学性能不足的问题，导致打印结构保真度不高、结构稳定性欠佳的问题。现有的生物3d打印墨水在组织工程和再生医学领域的应用促进组织修复和创面愈合的效果均不太理想。
技术实现要素：
本发明的目的之一在于提供一种可用于生物3d打印的高强度双网络生物墨水，本发明的目的之二在于提供这种可用于生物3d打印的高强度双网络生物墨水的制备方法，本发明的目的之三在于提供这种可用于生物3d打印的高强度双网络生物墨水的应用，可用这种生物墨水用于制备生物3d打印的高强度双网络凝胶，该高强度双网络凝胶可作为一种组织创面修复剂。
本发明所采取的技术方案是：
一种可用于生物3d打印的高强度双网络生物墨水，是由a液和b液按体积比为1：(0.05～20)混合而成的；
a液是由以下质量百分比的原料组成：10％～30％甲基丙烯酸化的透明质酸，0.05％～1％可见光引发剂，余量为水；
b液是由以下质量百分比的原料组成：5％～20％海藻酸盐，0.5％～5％富血小板血浆，余量为磷酸盐缓冲溶液。
优选的，一种可用于生物3d打印的高强度双网络生物墨水，是由a液和b液按体积比为1:0.1混合而成的。
优选的，这种可用于生物3d打印的高强度双网络生物墨水的a液中，可见光引发剂为酰基磷氧化物、酰基膦酸盐、二茂钛、烷基苯酮、二苯甲酮类、苯偶酰衍生物、硫杂蒽酮光引发剂中的至少一种；进一步优选的，可见光引发剂为酰基磷氧化物、酰基膦酸盐、二茂钛、苯偶酰衍生物光引发剂中的至少一种；再进一步优选的，可见光引发剂为苯基双(2,4,6-三甲基苯甲酰基)氧化膦、苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂、双(1-(2,4-二氟苯基)-3-吡咯基)二茂钛、双2,6-二氟-3-吡咯苯基二茂钛、苯偶酰缩酮类可见光引发剂中的至少一种。
优选的，这种可用于生物3d打印的高强度双网络生物墨水的b液中，海藻酸盐为海藻酸钠。
优选的，这种可用于生物3d打印的高强度双网络生物墨水的b液中，富血小板血浆中血小板的浓度为1×108/ml～1×109/ml。
优选的，这种可用于生物3d打印的高强度双网络生物墨水的b液中，磷酸盐缓冲溶液的组成原料包括磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾和水，磷酸盐缓冲溶液的ph为6～8；磷酸盐缓冲溶液各组分的组成为本领域的常见技术，根据需要的ph范围调节各组分的含量即可。
这种可用于生物3d打印的高强度双网络生物墨水的制备方法，包括以下步骤：
1)a液的制备：将甲基丙烯酸化的透明质酸溶于水中，再加入可见光引发剂，在避光条件下混合均匀，得到a液；
2)b液的制备：将海藻酸盐溶于磷酸盐缓冲溶液中，再加入富血小板血浆，混合均匀，得到b液；
3)生物墨水的制备：在避光条件下，将a液和b液混合，得到可用于生物3d打印的高强度双网络生物墨水。
一种生物3d打印的高强度双网络凝胶制备方法，包括以下步骤：
1)在双通道生物3d打印机的挤出装置中，一个通道加入上述的高强度双网络生物墨水，另一个通道加入氯化钙溶液；
2)通过双通道生物3d打印机进行打印，打印过程中用可见光照射，使打印所得的生物墨水材料固化成型，得到高强度双网络凝胶。
优选的，这种生物3d打印的高强度双网络凝胶制备方法的步骤1)中，氯化钙溶液的质量浓度为0.5wt％～4wt％；进一步优选的，氯化钙溶液的质量浓度为1wt％～3wt％。
一种生物3d打印的高强度双网络凝胶，是由上述的制备方法制得。
这种生物3d打印的高强度双网络凝胶作为组织创面修复剂的应用。
本发明的有益效果是：
本发明的生物3d打印墨水材料是一种具有良好生物相容性的水凝胶材料，具有高效保湿性、能够释放大量的生长因子，该墨水材料无皮肤刺激性，具有促进创面愈合的显著功效，可用于组织修复和再生医学领域，在生物医疗和扩展生物3d打印技术在医疗卫生领域的应用范围方面具有很大的应用前景。
本发明采用生物相容性良好的天然多糖海藻酸钠和生物相容性良好的甲基丙烯酸化的透明质酸为原料，混合富含血小板的血浆成分，采用简便易操作的方法制备一种高强度可用于生物3d打印的生物墨水。该生物3d打印墨水是通过双重固化实现的高强度双网络的水凝胶材料，即可见光固化和离子交换凝胶化。在提高生物墨水强度的同时，避免了传统3d打印常用的紫外光作用下成型，最大程度的保护了打印的生物结构，同时减少了对操作人员的安全威胁，降低了打印成本。该发明的生物3d打印墨水含富含血小板的血浆，能够释放大量的生长因子，在组织工程和创面愈合方面具有独特的应用潜力。
与现有技术相比，本发明的优点具体如下：
(1)本发明的生物3d打印墨水是一种双网络的高强度水凝胶材料，双网络结构增强了材料的强度，提高了打印保真度和打印稳定性。
(2)本发明的生物墨水材料是双重固化机制，包括光固化和离子交换凝胶化固化。
(3)本发明的生物墨水的光固化采用可见光即可固化，避免了传统的紫外光固化对打印结构的影响，大大的保护了打印结构中的活性组分的活性。
(4)本发明的生物墨水材料含有富含血小板的血浆成分，可释放大量的生长因子，在促进创面愈合方面具有独特的优势。
(5)本发明的生物墨水材料制备过程简单、便捷，易于操作，固化成型速度快。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。实施例中所用的原料如无特殊说明，均可从常规商业途径得到。
实施例1～3中，所用的光引发剂为苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂。
实施例1
称取3g甲基丙烯酸化的透明质酸溶于30ml蒸馏水中配制成溶液，然后向该溶液中加入0.03g的光引发剂，避光条件下充分搅拌均匀得到混合液a。
称取1g海藻酸钠溶于10ml的ph为7.0的磷酸盐缓冲溶液中，向其中加入0.1g富血小板血浆(血小板浓度为2×108/ml)，得到混合液b。
避光条件下，将混合液a和b以10:1的体积比混合得混合液c。混合液c即实施例1得到的可用于生物3d打印的高强度双网络生物墨水。同时配制2wt％的cacl2溶液备用。
将上述配制的混合液c和cacl2溶液分别加入到双通道生物3d打印机的挤出装置中。设定好打印参数，打印过程中用可见光照射打印机的喷嘴处墨水材料立即固化成型，即可得到实施例1的高强度双网络凝胶样品。
经试验测定，打印出的实施例1凝胶样品拉伸强度为0.2mpa、抗压强度为4mpa。
实施例2
称取4.5g甲基丙烯酸化的透明质酸溶于30ml蒸馏水中配制成溶液，然后向该溶液中加入0.03g的光引发剂，避光条件下充分搅拌均匀得到混合液a。
称取1g海藻酸钠溶于10ml的ph为7.4的磷酸盐缓冲溶液中，向其中加入0.1g富血小板血浆(血小板浓度为2.5×108/ml)，得到混合液b。
避光条件下，将混合液a和b以10:1的体积比混合得混合液c。混合液c即实施例2得到的可用于生物3d打印的高强度双网络生物墨水。同时配制2wt％的cacl2溶液备用。
将上述配制的混合液c和cacl2溶液分别加入到双通道生物3d打印机的挤出装置中。设定好打印参数，打印过程中用可见光照射打印机的喷嘴处墨水材料立即固化成型，即可得到实施例2的高强度双网络凝胶样品。
经试验测定，打印出的实施例2凝胶样品拉伸强度为0.5mpa、抗压强度为5.2mpa。
实施例3
称取3g甲基丙烯酸化的透明质酸溶于30ml蒸馏水中配制成溶液，然后向该溶液中加入0.03g的光引发剂，避光条件下充分搅拌均匀得到混合液a。
称取2g海藻酸钠溶于15ml的ph为7.6的磷酸盐缓冲溶液中，向其中加入0.2g富血小板血浆(血小板浓度为3×108/ml)，得到混合液b。
避光条件下，将混合液a和b以10:1的体积比混合得混合液c。混合液c即实施例3得到的可用于生物3d打印的高强度双网络生物墨水。同时配制2wt％的cacl2溶液备用。
将上述配制的混合液c和cacl2溶液分别加入到双通道生物3d打印机的挤出装置中。设定好打印参数，打印过程中用可见光照射打印机的喷嘴处墨水材料立即固化成型，即可得到实施例3的高强度双网络凝胶样品。
经试验测定，打印出的实施例3凝胶样品拉伸强度为0.96mpa、抗压强度为8.6mpa。对比例
做一个不加入富血小板血浆的对比例，在对比例b液的制备中不加入富血小板血浆，其余与实施例1的相同。由此制得对比例的凝胶样品。
应用试验
为了验证本发明的生物墨水材料无皮肤刺激性，具有良好的促进组织创面愈合性能。取新西兰兔3只，试验前12小时，把3只新西兰兔背部脊柱两侧的兔毛去除干净(约10*15cm大小区域)，然后在此部位做创伤处理作为试验和观察部位。分别取实施例和对比例中打印出的凝胶样品片8*8cm，用缓冲溶液反复清洗去除小分子残留物，作为供试样品，分别贴敷在3只已处理好的新西兰兔的实验部位的一侧作为实验组；取8*8cm的无菌纱布在蒸馏水中浸湿，用同样方法贴敷固定在上述新西兰兔实验部位的另一侧作为对照组。分别于12、24、48、72小时观察试验结果，结果如表1所示。
表1试验结果
本发明的生物3d打印墨水采用可见光和离子交换凝胶化双重固化的成型机制，具有较高的固化成型效率，同时大大提高了墨水材料的力学强度(拉伸强度≥0.2mpa,抗压强度≥4mpa)，提高了打印保真度，打印结构具有较高的稳定性。本发明的生物墨水在可见光下即可固化，操作简便易行，且能避免现有的紫外光固化对墨水材料中活性成分的破坏，安全度高，成本低。另外，本发明的生物3d打印墨水采用的是天然高分子多糖及其衍生物，来源广泛易得，墨水材料选用的甲基丙烯酸化的透明质酸是透明质酸的衍生物，具有天然保湿因子之称，具有高效保湿性和良好的生物相容性；墨水材料中还有生物相容性良好的天然多糖海藻酸钠，同时添加了富含血小板的血浆，能够释放大量的生长因子，在组织修复和创面愈合领域应用在止血、促愈合方面具有显著的优势，在生物医用领域具有巨大的应用前景。