一种RNA荧光探针及其制备方法和应用与流程

本发明涉及一种检测rna存在与分布的荧光探针，属于有机小分子荧光探针领域。

背景技术：

在细胞内的各种生命物质中，核糖核酸(rna)是重要的生物大分子，在蛋白质合成过程中起着重要作用，其中转移rna（trna）携带和转移活化氨基酸；信使rna（mrna）是合成蛋白质的模板；核糖体rna（rrna），是细胞合成蛋白质的主要场所。另外其在催化生物反应、基因表达调控等生物学过程中扮演着极其重要的角色。rna主要存在于细胞核的核仁区和细胞质中，其定位、活动、多寡、形态等包含着重要的生命科学信息，这些信息与医学诊断和治疗息息相关。因此，核仁和细胞质中的rna成像对生物化学、生物医药、生命科学等具有十分重要的意义。

目前的荧光成像技术，在实时监测活细胞中生物分子的形态、多寡等方面得到了广泛应用。荧光成像技术具有高检测灵敏度、生物样品低损伤以及可以动态分析活的样品等优势，克服了其他检测方法价格昂贵，设备要求高，技术操作相对复杂等缺点，获得了生物、生命、医学等学科研究者们的青睐。为适应当前形势，各种能够成像活细胞内不同靶标的荧光探针已成为研究热点。

与众多的商业化探针(如dna探针)相比，rna探针非常少，因为现有核酸探针一般与双链dna有较大的亲和性，且小分子与rna的作用机理尚不清楚，所以rna探针的研究是比较困难的。目前只有分子探针公司(molecularprobesco.)提供了一个可用于rna成像的探针“sytorna-select”，但该探针的化学结构式仍未对外公布。目前rna可视探针的缺乏已经限制了病理学研究和药物的开发。所以，发展新型结构和功能的rna荧光探针迫在眉睫。

技术实现要素：

针对目前缺乏rna探针的问题，本发明提供一种检测rna的荧光探针，具有膜通透性好、细胞毒性小等优点。

本发明的另一目的是提供一种上述荧光探针的合成方法，原料易得，合成步骤简单，收率高。

本发明的再一目的是提供一种上述荧光探针在检测细胞中rna分布的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种检测rna的荧光探针，其化学名称为1-甲基-4-（（e）-3-（（e）-1,3,3-三甲基二氢吲哚-2-亚基）丙-1-烯-1-基）吡啶-1-碘盐，简称bhi，其化学结构式如式（i）所示：

式（i）。

上述荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

（1）4-甲基吡啶与碘甲烷在乙醇中加热反应，反应后分离得到1,4-二甲基-吡啶碘盐（化合物1）；

（2）1,4-二甲基-吡啶碘盐和1，3，3-三甲基-2-亚甲基吲哚啉乙醛溶于乙醇中，在吡咯烷存在下室温搅拌，有固体析出，过滤得粗产物，提纯后得产物，即rna荧光探针。

步骤（1）中，4-甲基吡啶中与碘甲烷的摩尔比为1:1.2。

步骤（2）中，1,4-二甲基-吡啶碘盐与1，3，3-三甲基-2-亚甲基吲哚啉乙醛的摩尔比为1：1；1,4-二甲基-吡啶碘盐与吡咯烷的摩尔比为1:1-9。

步骤（1）中，反应温度为90℃，反应时间为24-48小时。

步骤（2）中，提纯方法为乙醇中重结晶。

上述荧光探针的合成路线如下：

。

一种上述荧光探针在检测、标记或显示细胞中rna的存在与分布中的应用。可采用波长为488nm的单光子激发，检测波段为红光波段550-650nm。

本发明的荧光探针工作原理如下：

本发明的探针以吲哚为母体，通过双键桥连吡啶盐构建了荧光探针。合适大小的共轭结构以及强的吸电子基团保证了红光发射；该探针特定的结构赋予其可以与rna沟槽区域相嵌合从而识别rna。

本发明具有以下优点：

本发明提供的荧光探针是一类新型的rna荧光探针分子，与其功能相近的荧光探针比，本发明所述探针具有低生物毒性、膜通透性好的特点，作为rna荧光探针具有广泛的应用，有望开发为rna的生理和病理学研究用简洁、直观的生物检测试剂。

附图说明

图1为化合物1的¹hnmr谱；

图2为荧光探针bhi的¹hnmr谱；

图3为荧光探针bhi的¹³cnmr谱；

图4为探针bhi对rna的滴定荧光光谱图片；

图5为探针bhi对固定细胞成像图片；

图6为探针bhi对rnase处理后固定细胞成像图片；

图7为探针bhi的细胞毒性测试结果。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。

实施例1荧光探针的合成

（1）1,4-二甲基-吡啶碘盐的合成：

向圆底烧瓶中加入8ml乙醇，然后加入1ml的4-甲基吡啶，加入0.755ml的碘甲烷溶液，加热至90℃反应24h，反应完毕后将反应体系冷却至室温，有固体析出，过滤并使用乙醇洗涤可得到1,4-二甲基-吡啶碘盐（化合物1），产率为92%。其核磁共振氢谱如图1所示：¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.84(s,2h),7.97(s,2h),4.27(s,3h),2.61(s,3h)；

（2）rna探针bhi的合成：

取化合物1（0.6g，2mmol）加入圆底烧瓶中，加入5ml的乙醇，加入1eq的1，3，3-三甲基-2-亚甲基吲哚啉乙醛，加入1eq的吡咯烷，室温搅拌12h，有大量固体析出，过滤可得粗产物，粗产物用无水乙醇重洗三遍，然后在乙醇中重结晶，得纯品bhi，产率为48%。其核磁氢谱与碳谱如图2和图3所示：¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.40(d,j=6.9hz,2h),8.05–7.95(m,1h),7.85(d,j=6.8hz,2h),7.42(d,j=7.2hz,1h),7.25(d,j=7.5hz,1h),7.06(s,1h),7.01(s,1h),6.33(s,1h),5.79(s,1h),4.07(s,3h),3.34(s,3h),1.62(s,6h).

¹³cnmr(101mhz,dmso)δ165.52,153.56,144.37,143.19,139.77,128.56,127.70,122.04,120.17,116.67,108.63,97.68,47.09,47.09,47.05,46.24,46.23,46.05,40.64,40.43,40.22,40.02,39.81,39.60,39.39,29.95,28.65。

实施例2荧光探针对rna的响应

配置实施案例1中制备的荧光探针的dmso母液，浓度为1mm。然后分别取5μl探针母液加入5ml容量瓶中，每个容量瓶中加入同浓度不同体积的rna溶液，最后用pbs缓冲溶液定容到5ml，使rna的浓度与探针浓度的当量比分别为5，20，40，60，100，200，300，400，500，600。然后进行荧光检测（激发波长500nm）。以波长为横坐标，荧光强度为纵坐标作图4。由图可以看出，探针本身的荧光很弱，当rna与探针当量比为600时，荧光强度增强了4倍。

实施例3荧光探针bhi对细胞的荧光成像

配制实施例1中制备的荧光探针dmso母液，浓度为1mm。再取20μl用lml培养基稀释，得终浓度为20μm的探针稀释液。将接种好的细胞用lml多聚甲醛处理30min后用pbs洗3次，然后用0.5ml5%的tritontmx-100处理3min，最后在探针稀释液中室温孵育30min，用pbs洗3次，贴壁生长的细胞置于载玻片上；然后用荧光显微镜进行明场成像与荧光成像(激发波长488nm，发射波段550-650nm)，结果如图5所示：荧光探针bhi能够染色固定细胞的细胞质和核仁，发出红色荧光。

将接种好的细胞用lml多聚甲醛处理30min后用pbs洗3次，然后用0.5ml5%的tritontmx-100处理3min，再加入3μl的rnase(5mg/ml)处理2h，最后在探针稀释液中室温孵育30min，用pbs洗3次，贴壁生长的细胞置于载玻片上；然后用荧光显微镜进行明场成像与荧光成像(激发波长488nm，发射波段550-650nm)，结果如图6所示：与图5相比，用rnase处理固定细胞后，细胞内的红色荧光明显变弱。

实施例4探针bhi对细胞的毒性

将细胞密度为8000个/ml的hela细胞接种到96孔板的部分孔内，剩余孔则用pbs缓冲液填充，按照下述条件在co2培养箱中孵育细胞：实验组为用含5μm的bhi的培养基孵育2小时、24小时和36小时后的细胞样品，对照组为不加染料的含细胞样品，空白组为pbs缓冲液样品。待孵育完成后，用新鲜的培养基换掉细胞培养液，并在每个培养孔中加入10μl的mtt，再孵育细胞4小时。孵育完成后，移除培养基，每孔加入200μl的dmso，并用摇床晃动其10min以溶解甲瓒。使用酶标仪测试每个孔在570nm处的吸光度，细胞的存活率（survivalrate）可通过下述公式计算得到：

其中，asample为实验组吸光度，ac为对照组吸光度，ab为空白组的吸光度。以探针孵育时间为横坐标，以细胞存活率为纵坐标作图7：染色36h后细胞存活率仍高达90%，说明探针对活细胞的毒性很低。