一种荧光染料的制备方法与流程

本发明属于发明名称为一种荧光染料及其制备方法与在细菌检测中的应用、申请日为2017年12月29日、申请号为2017114799437发明申请的分案申请，为产品的制备方法部分。

本发明属于染料化合物技术领域，具体涉及一种荧光染料及其制备方法与在细菌检测中的应用。

背景技术：

常规细菌培养法是最常见的细菌检测方法。但是有些细菌处于特殊的存活状态中，即处于细菌活的非可培养状态（viablebutnonculturablestate，vbnc），其特征是具有生物活性和致病性（即隐形传染源），但在常规条件下培养时，在培养基上不生长繁殖导致常规细菌培养法失去效力。对于这样状态细菌的检测，在食品检疫、水质检测与疾病预防与控制等领域显得尤其重要。比如食源性病原菌一旦进入vbnc状态常会造成漏检，从而引起严重的公共卫生危机，甚至会发生传染病的爆发。为了检测到处于活的非可培养状态的细菌的方法有很多种，其中一种是基于核酸（dna）分子的vbnc细菌pcr检测方法。该方法具备很大的优点，因为vbnc细菌基因组dna易提取，pcr技术又非常快速、灵敏、特异，并且操作简便。但在实际应用中，该法一个最大的缺憾便是难以排除假阳性的干扰。因为在对基因组dna的提取时，如果无法对死细菌和活细菌进行区分时，死细菌中的dna有时会依然具备扩增性，死细菌中dna的提取无疑会对后续pcr的结果产生假阳性。

细菌活的非可培养状态是在1982年提出的。vbnc状态的细菌不再分裂增殖但保持其活性，即仍具有潜在致病性以及代谢活性和基因表达等生物学特性。作为活细菌，具备如下特征：其胞膜完整，而细胞壁结构发生改变；具有代谢活性(如呼吸运动、吸收生化物质等)或者能合成dna、存在mrna分子以及vbnc特异性基因。因此以检测核酸为基础的检测方法是检测vnbc细菌的重要手段之一。在这些方法里面，以mrna分子为基础的检测技术具备假阳性低的特点，然而由于mrna分子丰度偏低且不稳定，因此导致敏感性与特异性均很低。以检测dna为基础的方法即基于dna分子的vbnc细菌pcr检测法特异性较高且简便省时。但由于dna分子比较稳定，即使细菌裂解甚至死亡之后dna仍然可以长期保留而不发生降解，常规的pcr法无法区分细菌的死活状态，死细胞或者自由的dna也能被当作目的基因被检测出来，但其已经失去致病能力，这样检测的假阳性率非常高，因此需要建立一种新的检测方法弥补这种不足。

为了弥补基于dna分子的vbnc细菌pcr检测法的不足，有一类染料被应用在这个检测方法上以消除可能带来的假阳性；比如溴化乙锭（ema）、叠氮溴化丙锭(propidiummonoazide，pma)、pmaxx染料以及pemax染料等等。针对于上述几种染料，已经有很多研究性文章进行了研究。研究显示针对受热致死细菌，如果温度不够高，此时导致细胞膜的损失不足，那么ema和pma均无法进入细胞里面，实验证明需在60℃或更高温度才能使得细菌发生明显的膜损伤水平，此种情况下ema比pma更有效地穿透热损伤的细胞；但是ema同pma相比也有很大的缺陷，比如，不仅ema对活细胞膜的渗透性远大于pma，导致活细胞的基因组dna显著损失；然而，一些研究也发现，pma-pcr方法在去除死细胞信号方面不能完全有效；kralik等人报道使用分枝杆菌的膜可渗透细胞可以获得不超过2log的pcr信号；pan和breidt也表明pma-pcr并不总是能消除热杀死的单核细胞增生利斯特氏菌的信号；ema-pcr也有类似的问题，即对死细胞信号的不能完全抑制；biotium.inc.研发的pmaxx是一种新的和改进的可行性pcr染料，功能与pma非常相似，具有更大的活性和区分活细菌和死细菌的能力，但是同时对于细胞的毒性也更大。这种染料在消除死细胞dna的pcr扩增方面更有效，但是很多时候需要同biotiuminc.提供的一种增强缓冲液一起使用，比如当通过pcr扩增来自革兰氏阴性细菌的序列时，用染料和增强缓冲液预处理的样品显示来自死细胞的信号降低，而来自活细胞的信号没有变化，但是这种增强缓冲液对于使用温和方法如低热灭菌细菌的样品是必须的。

技术实现要素：

针对目前这种非存活细菌中dna的提取对后续pcr的结果产生假阳性的问题，本发明提供了一种新型化合物，此化合物可以在活细菌和死细菌的混合群体中标记死细菌，被标记后的死细菌中的dna即使被提取出来，也无法再进行扩增，从而避免死细菌中dna造成的假阳性问题；比现有染料更加灵敏，计量低，而且对于细菌的毒性远小于现存的几种上述试剂，因此在快速检测上比现有产品更加快速而且更经济，应用范围很广，对各种细菌，原生动物，病毒和真菌（包括病原体和环境菌株）进行的pma-qpcr测试都非常有效。

本发明采用如下技术方案：

一种荧光染料，具有如下化学结构式：

其中，r1、r2独立的选自c1～c3的直链烷基或者h；n为1～4；m为1～4；r为阴离子；r`为阴离子，优选的，r`为两个氯离子；r为四个氯离子；本发明在两个苯基菲啶连接体的氮原子上可以只有一个取代基团，阴离子可以为一个多价态阴离子，也可为多个单价态阴离子，比如2cl^-或者4cl^-。

优选的，本发明的荧光染料化学结构式如下：

本发明的染料均是以高亲和力结合dsdna的光反应性染料，自身的荧光非常微弱，但是结合核酸后荧光信号很强，这些染料是细胞膜不可渗透的，只能进入破损的细胞膜与dna通过共价键结合从而导致永久的dna修饰，这些被修饰过的dna不能够再扩增，因此与pcr方法联合使用能够很好的弥补常规检测方法的不足。或者说这些染料能在细胞和死细胞的混合群体中选择性修饰死细胞“暴露”的dna（即细胞壁和细胞膜已破损的细胞），同时不会破坏活细胞的完整性，该特征使得染料在存在已经被染料修饰并因此不能扩增的死细胞的存在下通过定量实时pcr选择性检测活的致病细胞，从而解决现有技术由于死细胞带来的假阳性问题。

本发明还公开了上述荧光染料的制备方法，包括以下步骤：

（1）以3,8-二氨基-6-苯基菲啶与氯甲酸乙酯为原料制备中间体i；

（2）以中间体i与碘化物为原料制备中间体ii；所述碘化物的化学结构式为i（ch2）ni；

（3）以中间体ii与胺化合物为原料制备中间体iii；所述胺化合物的化学结构为r1nhr2或者r1nh2；

（4）以中间体iii与碘化合物为原料制备中间体iv；所述碘化合物的化学结构式为i（ch2）mi；

（5）以中间体iv与氢溴酸为原料制备中间体v；

（6）将中间体v、盐酸混合后再滴加亚硝酸钠溶液，搅拌后滴加叠氮化钠溶液，反应得到荧光染料。

上述技术方案中，

中间体i的化学结构式如下：

中间体ii的化学结构式如下：

中间体iii的化学结构式如下结构式的一种：

中间体iv的化学结构式如下结构式的一种：

中间体v的化学结构式如下结构式的一种：

上述技术方案中，步骤（1）中，制备中间体i时，反应的温度为0～5℃；步骤（2）中，制备中间体ii时，反应的温度为105℃～115℃；步骤（3）中，制备中间体iii时，反应的温度为回流；步骤（4）中，制备中间体iv时，反应的温度为回流；步骤（5）中，制备中间体v时，反应的温度为105℃～115℃；步骤（6）中，反应的温度小于0℃。

本发明还公开了上述荧光染料在vbnc细菌pcr检测中的应用以及上述荧光染料在细菌检测中的应用。

本发明还公开了上述荧光染料在标记非存活细菌中的应用；非存活细菌的标记方法，包括以下步骤，将权利要求1的荧光染料与细菌孵育5～50分钟，完成非存活细菌的标记，标记后的死细菌可以发出很强的荧光，尤其是不可参与扩增反应，解决了死细菌导致的假阳性问题。

本发明的产品不仅对于细胞的毒性很小，即对于细胞膜的不可渗透性大为增加，而且消除死细胞dna中的pcr产物方面也比现有产品更加彻底，而且无需额外的增强缓冲液，适用范围也非常广泛，比如沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、抗药性金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、结核杆菌、李斯特菌等都可以用本产品来处理。

附图说明

图1为本发明表1编号1结构的质谱图；

图2为本发明表1编号2结构的质谱图；

图3为本发明表1编号3染料与现有染料pmaxx标记细菌后5分钟的荧光图；

图4为本发明表1编号3染料与现有染料pmaxx标记细菌后10分钟的荧光图；

图5为本发明表1编号3染料与现有染料pmaxx标记细菌后30分钟的荧光图；

图6为本发明表1编号3染料同现有染料pmaxx处理细菌后qpcr结果对比图。

具体实施方式

实施例一

1000ml三口圆底烧瓶中放入60.0g3,8-二氨基-6-苯基菲啶，360mldmf和37.2ml吡啶，机械搅拌，冰水浴（0-5℃）下逐滴滴加42ml氯乙酸甲酯，滴加过程保温0-5℃；滴加完毕后继续反应10小时至反应完成；抽滤，滤饼加入到约2l纯水中，机械搅拌30min，抽滤；滤饼用2l纯水再洗涤一次，抽滤至干；减压干燥至恒重，得48g中间体i。

实施例二

在装有控温计和机械搅拌的1l三颈烧瓶中，加入中间体20gi与80ml1,3-二碘丙烷，混合搅拌，在105℃-115℃下反应3天，tlc跟踪，展开剂为:二氯甲烷：甲醇：乙酸乙酯：醋酸=75：10：10：5，按体积比；

反应结束后，停止反应并冷却至室温。向反应体系中加入约150ml乙酸乙酯，加热回流1小时，冷却到室温，过滤；过滤得到的固体用乙酸乙酯洗涤。收集的固体在真空箱中干燥,得22g中间体ii。

实施例三

250ml蛋形瓶中加入7.25g中间体ii，60mlmeoh和0.65gn-乙基甲基胺，加热至回流状态反应过夜，tlc跟踪，展开剂为:二氯甲烷：甲醇：乙酸乙酯：醋酸=75：10：10：5，按体积比；

反应结束后旋除溶剂，加入40ml乙酸乙酯回流30分钟后降至常温，过滤，滤饼用乙酸乙酯洗涤，真空干燥12小时后得到5.5g中间体iii。

实施例四

100ml反应瓶中加入2.62g中间体iii，676mg1,6-二碘己烷，40ml甲醇，搅拌，加热至回流状态反应过夜，tlc跟踪，展开剂为：乙腈：水=5：1，按体积比；

反应结束后，旋除溶剂，过氧化铝柱纯化，淋洗剂为水/乙腈(2%-8%)，得1.46g中间体iv。

实施例五

100ml反应瓶中加入1.46g中间体，20ml氢溴酸，搅拌，加热至110℃反应过夜；tlc跟踪，展开剂为：乙腈:水=10：1，按体积比；

反应结束后，冷却至室温，过滤，100ml水洗，固体干燥，得0.7g中间体v。

实施例六

100ml三颈瓶中加入0.6g中间体v，30ml盐酸（1m），搅拌，降温至-5℃；缓慢滴加2ml亚硝酸钠溶液（142mg），保持温度小于零度；tlc跟踪，展开剂为：乙腈:水=10：3，按体积比；

反应结束后，缓慢滴加2ml叠氮化钠溶液（75mg），保持温度小于零度，反应10小时；tlc跟踪，展开剂为：乙腈:水=10：3，按体积比；

反应完成后体系降温至零度，滴加氢氧化钠溶液中和至中性，冻干；过氧化铝柱纯化，淋洗剂为水/乙腈(5%-10%)，得0.35g终产品。

实施例七

根据上述方法，更换原料胺化合物可以得到多种产物，具体见表1，附图1、附图2分别是表1编号1、编号2结构的质谱图，因为电荷关系，图示为所得分子量的一半。

表1本发明高效荧光染料结构式

实施例八细胞毒性对比

实验步骤：将e.coli细胞于24孔板中培养，然后将pmaxx与上述表1编号3的荧光染料分别加入到细胞中，最终浓度为50μm，在37℃孵育一段时间，例如分别孵育5、15和30min，并在各时间点拍照，用cy3激发光源分别采集不同时间点的荧光图片，附图3、附图4、附图5分别为现有pmaxx与本发明编号3的荧光染料不同时间点的荧光图，从图可以看出，本发明产品对细胞的毒性明显小于pmaxx，因此由于产品本身毒性造成的假阳性显著要小于biotium的产品。

实施例九活死细菌测试结果

采用biotium公司公布的实验方法进行，用50μm表1编号3的荧光染料或pmaxx处理活的或热灭活的枯草芽孢杆菌，然后用其公司出品的pma-lite和dna纯化进行暴露。使用苏州宇恒生物科技有限公司生产的ueiris荧光定量试剂盒来扩增枯草芽孢杆菌dna的500-bp片段，用此类染料来处理细菌时不影响活细胞dna的扩增，但是会导致死细胞中荧光定量（qpcr）循环数（ct）的降低。图6纵坐标是用通过用染料处理过样品的荧光定量（qpcr）循环数（ct）减去没有用染料处理过的荧光定量（qpcr）循环数（ct），从图6可以看出，在同等条件下处理活细菌时，由于产品本身毒性造成的假阳性biotium公司的pmaxx明显要高于本发明编号3的产品，在处理含有死细菌的样品时，本发明荧光染料明显优于biotium公司的pmaxx.，即用本发明荧光染料处理的死亡细胞的qpcr与用biotiumpmaxx处理的死亡细胞相比显示出更明显的进一步延迟（>6ct）。

本发明的产品相对于现有的产品不仅对于细胞的毒性很小，而且对于细胞膜的不可渗透性大为增加，而且消除死细胞dna中的pcr产物方面也比现有产品更加彻底，而且无需额外的增强缓冲液。适用范围也非常广泛，比如沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、抗药性金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、结核杆菌、李斯特菌等等都可以用本产品来处理。