一种生物破胶剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及油田增产剂技术领域，具体涉及一种生物破胶剂剂。
【背景技术】
[0002] 传统破胶剂主要有以下几种：1、氧化破胶剂：常用的氧化破胶剂有过硫酸钾、过 硫酸铵等。由于氧化剂的活性和温度有关，一般当地层温度低于49°C时，反应的速度就很 慢，需要加入活化剂。氧化破胶剂有很多的缺陷如：①在高温下与压裂液反应迅速，使压裂 液提前降解而失去输送支撑剂的能力，甚至导致压裂施工失败；②它属于非特殊性反应物， 能和遇到的任何反应物如管材、地层基质和烃类等发生反应，生成与地层不配伍的污染物， 造成地层伤害；③氧化破胶剂很可能在到达目的裂缝前就消耗尽了，因而达不到破胶的目 的。2、胶囊氧化破胶剂：胶囊氧化破胶剂是把过氧化物单独装在合成外壳内。胶囊氧化破 胶剂的核心材料为破胶剂，可采用与水接触即可溶解变为高活性的固体强氧化剂。胶囊氧 化破胶剂的优点在于减少了破胶剂对压裂液流变性能的影响；增大破胶剂用量，改善了支 撑裂缝的导流能力。3、常规酶破胶剂：酶是具有高催化能力和很好的活性的生物蛋白，它在 催化反应时自身的形态和结构不发生改变，因此可再催化另一个反应。常规酶破胶剂是半 纤维素酶、纤维素酶、淀粉酶和果胶酶的混合物，它无法降解特定的聚合物，达不到理想的 破胶效果。另外，常规酶破胶剂虽然在低温下是一种较好的压裂液破胶剂，但它要求较低 的pH值。一般酶在pH=6时活性最大，高温、高pH值会使酶失去活性。4、特异性酶破胶剂： 针对于此，新型特异性生物酶破胶体系在其使用温度范围、PH范围等深入研究，主要针对多 糖聚合物糖的甙键筛选特异性水解酶（LSE)，它们只分解多糖聚合物结构中特定的糖甙键， 可将聚合物降解为非还原性的单糖和二糖。这些特异性破胶酶主要有纤维素糖甙键特异性 酶、淀粉糖甙键特异性酶、胍胶糖甙键特异性酶等等。
[0003] 传统破胶技术存在的问题：1、速度慢，反应时间及其活性主要依赖于温度，温度低 于50°C，反应很慢；2、不环保，它属于非特殊性反应物，能和遇到的任何反应物如管材、地 层基质和烃类等发生反应，生成与地层不配伍的污染物，造成地层伤害；3、破胶持续时间 短，氧化破胶剂很可能在到达目的裂缝前就消耗尽了，因而达不到破胶的目的；4、残渣多， 氧化破胶具有随机性，造成胍胶链不能完全降解，约20%的分子量大于2. OX IO6聚合物基 本上未降解。
【发明内容】
[0004] 为克服传统破胶剂的技术缺陷，本发明提供了一种新型生物破胶剂XYPJ-2破胶 齐IJ，该破胶剂为稳定化的生物制剂，是天然酶和分子改造酶的混合物，由特异水解生物胶 XYSW-I的多糖构成，可根据压裂的实际需要调整二者的比例，改造后破胶剂在常温条件下 的性能比较稳定。由于与之配套使用的生物清洁可回收压裂液稠化剂形成的胶体遇油水部 分破胶，所以该破胶剂在压裂后期加入，破胶效果好，返排彻底、无残渣。
[0005] 为了达到如上目的，本发明采取如下技术方案：
[0006] -种生物破胶剂，由天然酶和分子改造酶混合制成，其特征在于：按质量份数计所 述天然酶60-75份、所述分子改造酶25-40份。
[0007] 进一步优选地，按质量份数计所述天然酶65-70份、所述分子改造酶30-35份。
[0008] 进一步优选地，按质量份数计所述天然酶68份、所述分子改造酶32份。
[0009] 进一步地，所述天然酶为纤维素酶。
[0010] 进一步地，所述分子改造酶的制备包括如下步骤：
[0011] 1)引物设计与目的基因的扩增
[0012] 根据破胶制剂OA的基因序列设计并合成引物，密码子优化后的破胶制剂OA重组 质粒为模板进行PCR扩增，PCR反应体系为25μ 1，反应参数为：95°C预变性2min ;95°C 15s， 50°C 30s，72°C 3min，共30个循环；最后72°C延伸10min，16°C保存；取9μ 1反应产物用于 1%琼脂糖凝胶电泳鉴定；
[0013] 2)破胶制剂OA克隆载体的构建
[0014] 分别对胶回收后的PCR产物和pET28a载体进行EcoRI和Sail双酶切，胶回收后 用T4DNA连接酶于16°C过夜连接；将连接产物转化入E. coli ToplO感受态细胞，涂布在含 有卡那霉素的LB平板上；提取质粒进行EcoRI和Sail双酶切，用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定， 将筛选得到的阳性克隆命名为pET28a-0A，并将其菌液送往生物技术公司测序；
[0015] 3)诱导目的蛋白表达
[0016] 将空质粒pET28a和克隆载体pET28a_0A化学法分别转入感受态细胞E. Co I i BL21star (DE3)中，在含有卡纳霉素抗性的LB固体培养基上37°C过夜培养，次日挑选单个 菌落分别接种于5ml含有卡那霉素的LB培养基中，于37°C振荡培养至0D600=0. 4?0. 6时， 取出Iml未诱导的菌液作为诱导前对照，在剩余培养物中加入终浓度为lmmol/L的IPTG，继 续诱导培养，6h后取出细菌培养液离心去上清后进行SDS-PAGE分析；
[0017] 4)重组蛋白表达形式的分析
[0018] 将过夜菌按1 :1〇〇接种于20ml LB液体培养基中，置于37°C培养至菌浓度 0D600=0. 4?0· 6时，加入IPTG至终浓度为I. Ommol/L，诱导培养6h，lOOOOrpm，离心IOmin 收集菌体，加入1/10体积的超声裂解液（pH8. 0,50mM Tris-HCl，50mM NaCl)于冰浴中超声 波破碎l〇min，离心后分别对上清和沉淀进行SDS-PAGE分析；
[0019] 5)诱导表达时间的优化
[0020] 在IPTG诱导终浓度统一为I. Ommol/L的基础上，改变诱导时间，将扩大培养的菌 液按1 :100接种于LB液体培养基中，当0D600=0. 4?0. 6时，分别在诱导0h、2h、4h、6h、8h、 IOh时取ImL菌液离心去上清进行SDS-PAGE电泳，确定最适诱导时间为6-7h ;
[0021] 6) IPTG诱导浓度的优化
[0022] 将过夜菌按1:100接种于LB液体培养基中，当其0D600=0. 4?0. 6时，按终浓度 为0. 2、0. 4、0. 6、0. 8、1. 0、I. 2mmol/L加入IPTG，37°C诱导6h，取菌液ImL离心去上清进行 SDS-PAGE电泳，确定IPTG最佳诱导浓度为0. 8-0. 9mmol/L ;
[0023] 7 )诱导温度的优化
[0024] 将过夜菌按1:100接种于LB液体培养基中，分别置于25°C、28°C、37°C培养，至菌 浓度为〇D600=0. 4?0. 6时，分别加入IPTG至终浓度为I. 0mm〇l/L，诱导培养6h，取菌液离 心去上清进行SDS-PAGE电泳，确定最佳诱导温度为37°C ;
[0025] 8)重组蛋白的纯化
[0026] 将过夜菌按1:100接种于150mL培养基中，37°C培养至菌浓度0D600值为0. 4? 〇· 6时，加入IPTG至终浓度为I. Ommol/L，诱导培养IOh后，IOOOOrpm,离心15min沉淀菌 体，并将收集到的菌体放置于_2〇°C过夜后备用。收集诱导菌体后加入1/10体积的超声 裂解液，冰浴超声波破碎5次；离心收集上清，上样于经平衡缓冲液（IXPBS)平衡好的 5ml Talon resin柱上，经缓慢流速上样后，用6倍柱体积平衡缓冲液洗去