未结合的杂蛋 白，最后用含150mM咪唑的平衡缓冲液洗脱目的蛋白，并将洗脱的目的蛋白溶液经透析液 (pH8. 0, 20mMTris-HCl，50mM NaCl) 4°C过夜透析后进行 SDS-PAGE 分析。
[0027] 结果与分析：
[0028] 1、破胶制剂OA重组表达载体的构建及鉴定
[0029] 用设计好的引物对目的基因进行PCR扩增，经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，得到一 条大小为1473bp左右的特异性目的DNA片段（图一 A)，与预期结果一致。
[0030] 以重组质粒为模板进行PCR扩增，得到大小约为1473bp的片段（图二B)，与目的 基因大小一致。同时将重组质粒经EcoRI和Sail双酶切，产生1473bp的片段（图一 B)。 表明目的基因已正确插入载体，重组质粒构建成功。
[0031] 2、破胶制剂OA基因的诱导表达及表达形式鉴定
[0032] SDS-PAGE电泳结果显示，经IPTG诱导的含重组表达载体的细菌可大量表达大小 约为53. 4kD的新蛋白，而转入空载体pET28a的细菌、转入重组载体pET28a-0A而未经IPTG 诱导的细菌和不含任何载体的细菌都不表达该蛋白（图二）。新蛋白的分子量约为53. 4kD， 与预期值大小一致，说明目的蛋白诱导表达成功。
[0033] 3、不同诱导温度对目的蛋白表达量的影响
[0034] SDS-PAGE电泳结果显示（图三），目的蛋白在28°C诱导时的表达量高于23°C，但 在37°C时表达量最高。
[0035] 4、融合蛋白的纯化
[0036] 利用重组蛋白N端含有的His-tag进行金属离子螯合层析柱纯化，纯化的样品经 SDS-PAGE电泳检测，显示为单一条带（图四），说明通过钴柱亲和层析可实现该蛋白的高效 纯化。
[0037] 本发明的生物破胶剂与传统破胶剂相比的有益效果如表1。
[0038] 表1本发明的生物破胶剂与传统破胶剂对比表
[0039]
【主权项】
1. 一种生物破胶剂，由天然酶和分子改造酶混合制成，其特征在于：按质量份数计所 述天然酶60-75份、所述分子改造酶25-40份。
2. 根据权利要求1所述的生物破胶剂，其特征在于：按质量份数计所述天然酶65-70 份、所述分子改造酶30-35份。
3. 根据权利要求1所述的生物破胶剂，其特征在于：按质量份数计所述天然酶68份、 所述分子改造酶32份。
4. 根据权利要求1-3中任一项所述的生物破胶剂，其特征在于：所述天然酶为纤维素 酶。
5. 根据权利要求1-3中任一项所述的生物破胶剂，其特征在于，所述分子改造酶的制 备包括如下步骤： 1) 引物设计与目的基因的扩增 根据破胶制剂OA的基因序列设计并合成引物，密码子优化后的破胶制剂OA重组质 粒为模板进行PCR扩增，PCR反应体系为25μ 1，反应参数为：95°C预变性2min ;95°C 15s， 50°C 30s，72°C 3min，共30个循环；最后72°C延伸lOmin，16°C保存；取9μ 1反应产物用于 1%琼脂糖凝胶电泳鉴定； 2) 破胶制剂OA克隆载体的构建 分别对胶回收后的PCR产物和pET28a载体进行EcoRI和Sail双酶切，胶回收后用 T4DNA连接酶于16°C过夜连接；将连接产物转化入E. coli ToplO感受态细胞，涂布在含有 卡那霉素的LB平板上；提取质粒进行EcoRI和Sail双酶切，用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，将 筛选得到的阳性克隆命名为pET28a-0A，并将其菌液送往生物技术公司测序； 3) 诱导目的蛋白表达 将空质粒pET28a和克隆载体pET28a-0A化学法分别转入感受态细胞E. coli BL21star (DE3)中，在含有卡纳霉素抗性的LB固体培养基上37°C过夜培养，次日挑选单个 菌落分别接种于5ml含有卡那霉素的LB培养基中，于37°C振荡培养至0D600=0. 4?0. 6时， 取出Iml未诱导的菌液作为诱导前对照，在剩余培养物中加入终浓度为lmmol/L的IPTG，继 续诱导培养，6h后取出细菌培养液离心去上清后进行SDS-PAGE分析； 4) 重组蛋白表达形式的分析 将过夜菌按1 :1〇〇接种于20ml LB液体培养基中，置于37 °C培养至菌浓度 0D600=0. 4?0· 6时，加入IPTG至终浓度为I. Ommol/L，诱导培养6h，lOOOOrpm，离心IOmin 收集菌体，加入1/10体积的超声裂解液（pH8. 0,50mM Tris-HCl，50mM NaCl)于冰浴中超声 波破碎lOmin，离心后分别对上清和沉淀进行SDS-PAGE分析； 5) 诱导表达时间的优化 在IPTG诱导终浓度统一为I. Ommol/L的基础上，改变诱导时间，将扩大培养的菌液按 I :100接种于LB液体培养基中，当0D600=0. 4?0. 6时，分别在诱导0h、2h、4h、6h、8h、10h 时取ImL菌液离心去上清进行SDS-PAGE电泳，确定最适诱导时间为6-7h ; 6. IPTG诱导浓度的优化 将过夜菌按1:100接种于LB液体培养基中，当其0D600=0. 4?0. 6时，按终浓度为 0. 2、0. 4、0. 6、0. 8、1. 0、1. 2mmol/L 加入 IPTG，37°C 诱导 6h，取菌液 ImL 离心去上清进行 SDS-PAGE电泳，确定IPTG最佳诱导浓度为0. 8-0. 9mmol/L ; 7) 诱导温度的优化 将过夜菌按1:100接种于LB液体培养基中，分别置于25°C、28°C、37°C培养，至菌浓度 为0D600=0. 4?0. 6时，分别加入IPTG至终浓度为I. Ommol/L，诱导培养6h，取菌液离心去 上清进行SDS-PAGE电泳，确定最佳诱导温度为37°C ; 8) 重组蛋白的纯化 将过夜菌按1:100接种于150mL培养基中，37°C培养至菌浓度0D600值为0. 4?0. 6 时，加入IPTG至终浓度为I. Ommol/L，诱导培养IOh后，IOOOOrpm,离心15min沉淀菌体，并 将收集到的菌体放置于_20°C过夜后备用。收集诱导菌体后加入1/10体积的超声裂解液， 冰浴超声波破碎5次；离心收集上清，上样于经平衡缓冲液（IXPBS)平衡好的5ml Talon resin柱上，经缓慢流速上样后，用6倍柱体积平衡缓冲液洗去未结合的杂蛋白，最后用 含150mM咪唑的平衡缓冲液洗脱目的蛋白，并将洗脱的目的蛋白溶液经透析液（pH8. 0， 20mMTris-HCl，50mM NaCl) 4°C过夜透析后进行 SDS-PAGE 分析。
【专利摘要】本发明公布了一种生物破胶剂，由天然酶和分子改造酶混合制成，所述天然酶为纤维素酶，按质量份数计所述天然酶60-75份、所述分子改造酶25-40份。可根据压裂的实际需要调整二者的比例，改造后破胶剂在常温条件下的性能稳定；适用温度范围20-130℃；反应可控，持续时间长；具有专一性，不产生附加伤害，不容易消耗。该破胶剂在压裂后期加入，破胶效果好，返排彻底、无残渣。
【IPC分类】C09K8-62, C12N9-42
【公开号】CN104559994
【申请号】CN201310479346
【发明人】王祖文, 周丰, 孙虎, 王文武, 张冕, 李还向, 段凯
【申请人】中国石油集团川庆钻探工程有限公司长庆井下技术作业公司
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2013年10月14日