5%乙醇，含有5滴乙酸)中室温反应24小时，乙醇超声清洗3次，120°C真空交联4小时实现玻璃片氨基改性。将氨基改性的玻璃片置于二乙烯基砜(DVS)溶液(10%，v/v, pH 9.5，含10%丙酮助溶)中，室温活化12小时后取出，用水超声清洗3次，乙醇超声清洗3次，制备DVS活化的玻璃片。将DVS活化的玻璃片浸泡在氨基乳糖溶液(10%，W/v，pH 9.5)中，室温反应12小时后取出，用水超声清洗3次制备乳糖糖基功能化的玻璃片。
[0039]分别将乳糖糖基化和未处理的玻璃片浸入200 μ L花生凝集素-辣根过氧化物酶偶联物(PNA-HRP，ΡΝΑ特异性识别乳糖)和牛血清白蛋白-辣根过氧化物酶偶联物(BSA-HRP，BSA为杂蛋白样品)溶液中，37°C孵育2小时后吸出蛋白溶液并用磷酸盐缓冲液冲洗 3 次。使用 Pierece QuantaBlu? Flurogenic Peroxidase Substrate 试剂盒测定孔板上蛋白吸附情况。测定方法如下:在酶标板每孔加入200 μ L HRP荧光发色底物，37°C孵育10分钟后加入200 μ L终止液。用酶标仪在激发波长320nm，发射波长410nm条件下测定各孔的荧光强度，荧光强度越高，则玻璃片上吸附的蛋白越多，结果如图2所示。未处理的玻璃片对杂蛋白BSA-HRP的吸附较多，而对特异性蛋白PNA-HRP的吸附较少，经过乳糖糖基化的玻璃片对杂蛋白BSA-HRP的吸附量明显减少，而对特异性蛋白PNA-HRP的吸附显著提高，表明经过乳糖糖基化处理，玻璃片具备了乳糖特异性识别凝集素蛋白的生物功能。
[0040]实施例3:乳糖糖基化玻璃微载体的制备及性能测试
[0041]将2g玻璃微载体加入95%乙醇中，用1M硝酸调节至pH 4，40°C反应30min，加入lmL 3-氨基丙基三甲氧基硅烷(APTES)室温反应24小时，乙醇冲洗3次，120°C真空交联4小时实现玻璃微载体的氨基改性。称取0.7g氨基乳糖(2.lmmol)溶于20mL 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液(10mM，pH 9.5)中，加入2.5mLDVS (10倍当量)，并加入4mL丙酮助溶。溶液在室温条件下反应12小时，加入20mL乙酸乙酯萃取3次除去过量的DVS，制备二乙烯基砜修饰的氨基乳糖溶液。将氨基改性的玻璃微载体加入到二乙烯基砜修饰的氨基乳糖溶液中，室温反应12小时后取出，用水冲洗3次，制备乳糖糖基化的玻璃微载体。
[0042]分别将lOOmg乳糖糖基化和未处理的玻璃微载体浸入200 μ L花生凝集素-辣根过氧化物酶偶联物(PNA-HRP，ΡΝΑ特异性识别乳糖)和牛血清白蛋白-辣根过氧化物酶偶联物(BSA-HRP，BSA为杂蛋白样品)溶液中，37°C孵育2小时后滤出玻璃微载体并用磷酸盐缓冲液冲洗 3 次。使用 Pierece QuantaBlu? Flurogenic Peroxidase Substrate 试剂盒测定孔板上蛋白吸附情况。测定方法如下:在酶标板每孔加入100 μ L HRP荧光发色底物，37°C孵育10分钟后加入100 μ L终止液。用酶标仪在激发波长320nm，发射波长410nm条件下测定各孔的荧光强度，荧光强度越高，则玻璃微载体上吸附的蛋白越多，结果如图3所示。经过乳糖糖基化，玻璃微载体对杂蛋白BSA-HRP的吸附量明显降低，对于特异性蛋白PNA-HRP的吸附量升高了约5倍，表明经过乳糖糖基化，玻璃微载体在蛋白水平具备了乳糖糖特异性识别凝集素蛋白的生物功能。
[0043]实施例4:半胱氨酸功能化硅片的制备及其性能测试
[0044]蛋白的非特异性吸附是降低材料在生物体系中使用寿命的主要原因，也是在生物传感与医疗检测中降低仪器检测灵敏度和选择性的重要元素，因此，学者们尝试了多种方法来降低蛋白的非特异性吸附。现在常用的方法可以归纳为亲水性高分子(典型实例为PEG)和两性离子材料，这两种方法都有一定的弊端。Gu等报道了氨基酸在生理条件下具有两性离子的性质，并在一定程度上可以降低蛋白的非特异性吸附。本实施例通过在硅片表面固定半胱氨酸分子，实现降低蛋白非特异性吸附功能化。
[0045]将硅片切割为lcmX 1cm样品，分别用水和乙醇超声清洗2次，将清洗干净的硅片置于食人鱼洗液(硫酸-双氧水溶液，浓硫酸:双氧水=3:1，v/v)中，90°C反应30min，水超声清洗3次。将羟基化的硅片置于3-氨基丙基三甲氧基硅烷(APTES)溶液(2%，v/v,溶剂为95%乙醇，含有5滴乙酸)中室温反应24小时，乙醇超声清洗3次，120°C真空交联4小时实现氨基改性。将氨基改性的硅片置于二乙烯基砜(DVS)溶液(10%，ν/ν，ρΗ 9.5，含10%丙酮助溶)中，室温活化12小时后取出，用水超声清洗3次，乙醇超声清洗3次。将DVS活化的硅片浸泡在半胱氨酸溶液(5mM，pH 7.5)中，室温反应8小时后取出，用水超声清洗3次制备半胱氨酸功能化硅片。
[0046]分别将半胱氨酸功能化和未处理的硅片片浸入200 μ L牛血清白蛋白-辣根过氧化物酶偶联物(BSA-HRP，BSA为蛋白样品)溶液中，37°C孵育2小时后吸出蛋白溶液并用磷酸盐缓冲液冲洗 3 次。使用 Pierece QuantaBlu? Flurogenic Peroxidase Substrate 试剂盒测定孔板上蛋白吸附情况。测定方法如下:在酶标板每孔加入200 μ L HRP荧光发色底物，37°C孵育10分钟后加入200 μ L终止液。用酶标仪在激发波长320nm，发射波长410nm条件下测定各孔的荧光强度，荧光强度越高，则硅片上吸附的蛋白越多，结果如图4所示。经过半胱氨酸功能化，硅片表面的蛋白吸附量减少了约70%，说明经过半胱氨酸氨酸功能化，硅片具备了抗非特异性蛋白吸附的功能。
[0047]实施例5:赖氨酸功能化硅纳米球的制备及其性能测试
[0048]将5mL LUDOX AS-40硅纳米球(Sigma)加入100mL 95%乙醇中，用1M硝酸调节至pH 4，40°(:反应3011^11，加入21^ 3-氨基丙基三甲氧基硅烷(APTES)室温反应24小时，11，OOOrpm离心30min并用乙醇洗涤2次，实现氨基改性。将氨基改性的硅纳米球加入到二乙烯基砜(DVS)溶液(10%，v/v，pH 9.5，含10%丙酮助溶)中，室温活化12小时后取出，11，OOOrpm离心30min并用乙醇洗涤2次，完成DVS活化。将DVS活化的硅纳米球加入到100mL赖氨酸溶液(50mM，pH 9.5)中，室温反应12小时，11，OOOrpm离心30min并用水洗涤2次制备赖氨酸功能化的硅纳米球。
[0049]分别将lmL赖氨酸功能化和未处理的娃纳米球(100mg/mL)加入到9mL lmg/mL的BSA溶液和10%新生牛血清(NBS)溶液中，用动态光散射(DLS)的方法检测其水力学直径的变化。硅纳米球表面蛋白吸附越多，其水力学直径增大越多，结果如图5所示。未处理的硅纳米球在BSA和NBS溶液中水力学直径迅速增大，表明其表面有大量蛋白吸附，经过赖氨酸功能化之后，硅纳米球在测试期间水力学直径未发现显著增大，表明其表面蛋白吸附量很少。该结果表明经过赖氨酸功能化，硅纳米球具备了抗蛋白非特异性吸附的功能。
【主权项】
1.娃基材料表面生物功能化的方法，其特征在于是以二乙稀基砜连接由巯基/氨基娃烷偶联剂表面改性的羟基化硅基材料与生物分子的方法。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的生物分子是含有巯基、氨基和/或羟基的生物分子。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的生物分子选自含有巯基和/或氨基的氨基酸，多肽或蛋白质。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的娃基材料是无机娃材料。5.权利要求1所述的方法，是二乙稀基砜反应单元先与娃基材料反应单元和生物分子反应单元中之一反应，所得反应物再与其余一种进行反应； 所述的二乙烯基砜反应单元是体积浓度为1?20%的二乙烯基砜溶液，溶剂为水或体积浓度5?20%的丙酮-水溶液； 所述的硅基材料反应单元是巯基/氨基硅烷偶联剂改性的羟基化硅基材料； 所述的生物分子反应单元是生物分子的水溶液。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于: 所述的娃基材料反应单元参与的反应中，反应温度0?40°C ;反应时间1?16小时； 所述的生物分子反应单元参与的反应中，反应温度0?40°C ;反应时间1?16小时。7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于: 以疏基娃烧偶联剂对轻基化娃基材料进彳丁改性的方法中，所述的一.乙稀基讽洛液pH 彡 7.0 ; 以氨基硅烷偶联剂对羟基化硅基材料进行改性的方法中，所述的二乙烯基砜溶液pH ^ 8.5o8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于: 所述的含巯基的生物分子溶液pH多7.0 ; 所述的含氨基的生物分子溶液pH多8.5 ; 所述的含羟基的生物分子溶液pH多10。9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的娃基材料反应单元通过下述方法制备: (1)制备轻基化娃基材料； (2)将羟基化硅基材料置于质量浓度为0.5?5%的巯基/氨基硅烷偶联剂溶液中，0?40°C保持1?48小时，溶剂为添加少量乙酸的体积浓度为90?95%的醇水溶液； 所述的巯基/氨基硅烷偶联剂选自3-巯基丙基三甲氧基硅烷，3-氨基丙基三甲氧基硅烷，3-氨基丙基二甲氧基硅烷或3-氨基丙基甲氧基硅烷。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中羟基化硅基材料是用酸或碱对硅基材料进行表面羟基化处理后所得，其中:所述的酸选自硫酸、硝酸或硫酸-双氧水溶液；所述的碱是氨水。11.权利要求1?10中任一权利要求所述的方法所制备的表面生物功能化的硅基材料。
【专利摘要】本发明公开一种硅基材料表面生物功能化的方法，并公开以该方法所制备的功能化硅基材料。所述的方法是以二乙烯基砜连接由巯基/氨基硅烷偶联剂表面改性的羟基化硅基材料与生物分子的方法。该方法使用商业化的巯基/氨基硅烷偶联剂和二乙烯基砜为偶联试剂，无需前处理，可操作性强、重现性高、适用性广；乙烯基砜可以和巯基、氨基、羟基反应，适用生物分子具有广谱性；涉及的反应均在水溶液中进行，条件温和、环境友好；是一种潜力巨大的广谱性硅基材料表面生物功能化方法。
【IPC分类】C09C1/28, C09C3/12
【公开号】CN105295447
【申请号】CN201510594737
【发明人】程昉, 王汉奇, 孙世猷, 李明洋, 孙蔷, 陆安慧, 曲景平, 彭伟
【申请人】大连理工大学
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2015年9月17日