胶球藻属的新型抗辐射藻类的制作方法

专利名称：胶球藻属的新型抗辐射藻类的制作方法
胶球藻属的新型抗辐射藻类本发明涉及新型藻类，并涉及其用于从含水(aqueous)介质，特别是放射性介质摄取或吸收(up take)金属的应用。放射性排出物主要由核电站产生。所述排出物主要是来自废燃料贮存池的水、来自净化罐的水或来自核电厂冷却循环的水，由于放射对非活性化合物的活化或由于放射性化合物的释放和溶解，导致其最终都包含放射性化合物。放射性排出物的其他来源是核医疗学、使用放射性物质的研究实验室以及某些非核工业(例如，稀土族的提取)。有多种物理和化学方法用于纯化包含放射性化合物的排出物，特别是废水。然而，这些方法的操作和设备成本高，需要大修并且产生大量的放射性废物。此外，这些方法的应用领域往往有限。例如，离子交换树脂用于维持来自核电厂的水的低电导率。这些离子交换树脂负载放射性离子，并在饱和时贮存以等待适合的再处理方案，或在使用毒性或高反 应性化合物的条件下贮存。此外，现有的生物方法使用，例如细菌、真菌、酵母或植物纯化毒性产物(非放射性或放射性)污染的介质(工业废物、天然介质等)。这些方法使用活生物来富集并吸收污染性化合物并降低其毒性(对化学形式进行修饰)，或者使用非活生物质和源自活生物的衍生物对污染物进行生物吸附。生物方法的应用领域通常大于物理和化学方法，其不需要添加化学试剂或产品，并且处理成本通常较低，因此具有经济效益。特别地，植物是良好的土壤或水净化剂，这是因为其具有代谢物、蛋白质、酶、吸收机理、膜通道、内部结构等的完整系统，使其能够恰当地固定毒性化合物，将其螯合在植物外部或内部，通过特异性或非特异性吸收途径将其大量引入，将其保留在细胞内，改变其形式以使其无害或毒性降低，降低其溶解性，将其以无毒形式贮存在液泡中等。研究显示，某些微生物能够通过生物吸附富集稀溶液中的金属离子，例如Ag、Al、Au、Co、Cd、Cu、Cr、Fe、Hg、Mn、Ni、Pb、Pd、Pt、U、Th、Zn 等(White et al. , InternationalBiodeterioration&Biodegradation, 35:17-40，1995 ;美国专利 US 6 355 172)。生物吸附是生物质通过借助位于细胞表面的壁化合物(parietal compound)的官能团的相互作用而以非选择性物化机理的方式结合重金属的能力。例如，现已提出使用细菌和微生物混合物非选择性地生物吸附重金属(美国专利US 7 479 220 ；PCT申请WO 03/011487)。其他方法使用死生物质或源自活生物的培养物的衍生化合物以净化污染有金属的介质。所涉及的过程是没有生物活性的物化机理，例如离子交换，例如使用存在于细胞壁中的多糖，络合作用或吸附作用。现已使用源自藻类的生物质(例如细胞壁)纯化废液中包含的金属(美国专利US4769223 ；PCT 申请 WO 86/07346 ;美国专利 US 5648313 ；PCT 申请 W02006/081932)。现有几种将活体生物用于处理污染有放射性化合物的介质的方法。实际上，在水被放射性化合物污染或水接近于放射源的情况下，有必要使用耐放射或抗放射性的生物，其还能够耐受污染物的化学毒性并且与足量的目标化合物结合以用于工业处理的背景中。在自然环境下，积聚放射性化合物的生物通常经受低放射性。例如，在切尔诺贝利核事故发生后不久，对于含水介质，反应堆冷却箱水的电离辐射的外部剂量率不超过100 μ Gy/h, 1986年全年的最大累积剂量为O. OlGy。核电站周围30km区域的普利比亚特河(Pripyat River)的沉积物上沉积的放射性核素的剂量率在事故后于各处立即升高至 O. 4mGy/h (Kryshev and Sazykina, Journal of EnvironmentalRadioactivity, 28:91-103，1995)。在多数情况下，均没有测试提议用于防止污染有放射性的物质或废物的污染和/或用于浓缩放射性化合物的微生物的电离辐射抗性。这是因为，这些微生物用于提取U(铀)和Th(钍)，而这两种元素的主要同位素的活性低(例如，对于包含10yg/l 238U或235U的溶液，238U或235U的活性分别为O. 13或O. 8Bq/l)。美国专利US 4320093提出使用根霉属(Rhizopus)的真菌提取含水废物中包含的铀或钍。英国专利GB 1472626提出使用通过X射线辐射经铀预适应的单细胞绿藻获得的突变单细胞绿藻，英国专利GB 1507003专利提出使用多种微生物，特别是黑曲霉(Aspergillus niger)真菌和颤藻属(Oscillatoria)蓝细菌来浓缩天然存在于海水中的铀。美国专利US 7 172 691提出使用小球藻属(Chlorella)、栅藻属(Scenedesmus)、卵囊藻属(Oocystis)和衣藻属(Chlamydomonas)的活光合藻类从包含浓度约0_20ppm铀(表现为238U和235U分别260和1600Bq/l的活性)的含水介质浓缩放射性污染物，特别是铀。与此相比，构成下文所述微藻生活环境的来自核元素贮存池的水的活性为约300000Bq/l。
迄今为止，所描述的大部分抗辐射生物均是原核生物。耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans)具有抵抗电离福射的超常能力，其在60Gy/h的福射下生长，并且在15kGy的剂量下存活。然而，这种细菌的天然耐金属性并不很高。例如，该菌不耐受钴(无论任何同位素)，5ppm的钴，即约10_4mol/l的钴即抑制其生长(Johnet al.，Symposium Chemical-biological Interactions In Contaminant Fate, MetalToxicity In Deinococcus radiodurans, p. 426~428in Preprints of Extended AbstractsVol. 40No. 2，2000)。因此，要将该细菌作为放射性介质中包含的金属的纯化剂使用，需要遗传修饰以引入使其能够积聚目标金属的基因。因此，曾提出对奇球菌属(Deinococcus)的细菌进行遗传修饰，以表达能够消除有机化合物、金属或放射性核素的毒性或将其代谢的酶，进而用于核废料场原位生物治理的目的(PCT申请WO 01/23526)。新近，从高活性的放射性废料场分离并纯化了耐福射动球菌(Kineococcus radiotolerans)种的细菌。根据描述，这些细菌能够在剂量率大于lOGy/h的电离辐射存在条件下降解有机污染物，还提出所述细菌通过生物吸附用于非选择性的防止放射性核素污染的应用(美国专利US7, 160，715)。尽管可用于净化放射活性非常高的介质，但这两种微生物的不足之处在于不是自养生物，因此需要外部提供的含碳养分才能以活培养物的形式使用。此外，与还需要较不丰富培养基(less rich culture medium)的自养生物相比,这两种微生物的培养物对其他细菌的污染更加敏感。现已描述了一种形式(single form)的耐福射自养生物(Farhi etal.，20:104216，2008)。该生物为绿藻纲(Chlorophyceae)的微藻，耐受电离福射，LD50为6kGy，而藻类电离辐射抗性的LD50通常在30至1200Gy之间(IAEA, 1976，Effects ofionizing radiation on aquatic organisms and ecosystems. Technical reports seriesNo. 172, International Atomic Energy Agency，Vienna)。
本发明人现在分离出了另一种耐福射微藻，其属于胶球藻属(Coccomyxa)(共球藻(Trebouxiophyceae)纲Proschold and Leliaert, Unravelling the algae: thepast,present,and future of algal systematics, CRC Press,Brodie and Lewiseds.，2007)，并且发现这种微藻不仅表现出高于Farhi等(2008，见上)所述微藻的电离辐射抗性，而且还能够摄取并浓缩含水介质中溶解的放射性或非放射性金属离子，因此，其能够生长在放射性介质中。这种藻代表了胶球藻属的新种,下文中称作Coccomyxa actinabiotis。根据布达佩斯条约，在2009年6月23日将这种新种的代表性无生物污染性培养物保藏在藻类和原生生物培养物保藏中心(Culture Collection of Algaeand Protozoa, CCAP),地址在英国阿盖尔郡苏格兰海洋科技协会，Dunstaffnage 海洋所(Scottish Association for Marine Science,Dunstaffnage MarineLaboratory, GB-Oban, Argyll, PA37 IQA, UK)，保藏号为 CCAP 216/25。
Coccomyxa actinabiotis种藻类的特征特别在于其对应于18S核糖体RNA-ITS1-5. 8S核糖体RNA-ITS2-26S核糖体RNA(start)的基因包含与SEQ ID NO: I具有至少95%同一性的序列，按优选顺序递增，包含与SEQ ID NO: I具有至少96%、97%、98%或99%同一性的序列。上文所述同一性百分数是使用Clustal 软件(Larkin et al. , Bioinformatics, 23，2947-2948，2007)比对序列后，在由SEQ ID NO: I的全序列组成的比较窗口上计算获得的。Coccomyxa actinabiotis 种藻类的特征还可在于对应于 ITS1-5. 8SrRNA_ITS2的区域与SEQ ID NO: I序列的相应区域具有至少90%的同一性。将此阈值估算为90%是以本发明人的观察结果为基础的，该结果显示Coccomyxa actinabiotis和其他胶球藻属在此区域间的最大同一性为81%，且其他胶球藻属彼此在ITS1-5. 8S rRNA-ITS2之间的最大同一性为88%(见下表III)。特别地,Coccomyxa actinabiotis的核糖体rNA基因的序列与所属的胶球藻属其他种的不同之处在于，对应于18S rRNA的区域中约500bp的两个插入物(图2中以斜体字表示的插入物)。差别还在于其18S rRNA基因(图3)的性质及其ITSl和ITS2的性质。基于其对电离福射的抗性,Coccomyxa actinabiotis不仅能够吸收并浓缩含水介质中溶解的放射性或非放射性金属离子，还能够在允许其吸收并代谢除金属之外的放射性化合物(例如3H或14C)的放射性介质中生长。因此，本发明的主题是胶球藻属的绿藻，特别是上述定义的Coccomyxaactinabiotis种的应用，其用于从包含溶解的金属Ag、Co、Cr、Zn、Mn、Sb、Cs、Ni、Fe、锕系元素、镧系元素(无论其具有或没有放射性)或放射性同位素14C和3H的含水介质吸收选自所述金属或所述放射性同位素中的至少一种元素。更具体地，本发明的主题是从包含溶解的放射性或非放射性金属Ag、Co、Cr、Zn、Mn、Sb、Cs、Ni、Fe、锕系元素或镧系元素，或放射性同位素14C和3H的含水介质吸收选自所述元素中的至少一种元素的方法，其特征在于通过在所述含水介质中温育胶球藻属的绿藻进行所述吸收。有利地，所述元素是选自Ag、Co和锕系元素U的金属。
另外，有利地，所述元素是14C。在法国，核电站废料中的14C量在近几年才受到单独管理。然而，14C是核电站排放到环境中的主要放射性污染物，仅次于氚。例如，Tricastin核电站的基础核电站(4组900MW)在2009年向空气排放了 170GBq的14C,在废液中排放了 15.9GBq的14C(EDF Annual Report 2009)。利用Pui’ex 工艺的核燃料后处理厂(例如，AREVA’海牙)为了对IGWe反应堆的所有燃料进行后处理，每年向环境排放约600GBq的14C (Toxicologie nucleaire environnementale et humaine[Environmental and humannuclear toxicology], eds Tec and Doc,Lavoisier,2009)。根据本发明的一个优选实施方式，所述含水介质是放射性介质，即所述藻类在其中受到的剂量率在数PGy/h至lkGy/h范围的介质。根据该实施方式的一个优选方面，待吸收的元素是选自上述的金属，其为放射性同位素的形式，或同位素混合物的形式。所述藻类在所述含水介质中的温育时间可具体地根据以下改变第一，所涉及的元素；第二，必须进行吸收的含水介质的性质。所述温育通常可以是至少I小时，并可以长达数个月，甚至数年。例如，如果仅需要吸收Ag，约I小时的温育时间足可吸收大部分Ag， 约1(Γ20小时几乎可完全吸收；如果要吸收其他金属，可使用至少3飞天，且有利地为至少I周的更长温育时间。例如，如果需要吸收14C,在下文实施例4提出的优化条件下，3小时的温育时间将足以吸收绝大部分14c。实际上，需要的最长温育时间主要取决于所述藻类在所述含水介质中生长和存活的能力。在存在光和二氧化碳(通过接触环境空气、搅拌培养物或充气引入)时，胶球藻属的藻类，特别是Coccomyxa actinabiotis种的藻类,能够在pH 5 6且温度20 30°C的弱矿化水(电导率I至I. 5 μ S/cm)中生长和存活非常长的时间，并且能够在去矿质水(电导率O. 05 μ S/cm)中生长和存活3 4周。由于这些绿藻类需要光进行光合作用并产生其有机质，因此在避光放置时其停止生长。因此，根据本发明方法的一个实施方式，可通过控制对包含Coccomyxaactinabiotis种绿藻的含水介质的光照来控制所述藻类的生长。Coccomyxa actinabiotis藻类还可以在弱放射性介质中生长和存活数年,其在所述介质中受到的辐射小于或等于O. 15mGy/h。所述藻类可以耐受lGy/h的辐射长达约I个月，其还能够耐受300Gy/h的辐射约I天，以及lOOGy/h的辐射约3天。在放射性非常高的介质中，所述藻类能够耐受lkGy/h的辐射长达20小时；如果随后将其转入非放射性介质中，其在不到2周内恢复生长能力。作为例示，可将低剂量率范围的界限(在低于该界限时，没有检测到生物学效应)设置为约lmSv/h(即对于Y-辐射为lmGy/h)。低剂量是小于lOmSv/h的剂量。大于lmSv/h的剂量率产生有害的生物学效应。大于IO-IOOmSv的剂量出现统计学上可观察到的效应。高剂量是大于IGy的辐射，从该数值起确定性的效应开始变得明显。为了实施本发明的方法，可在振荡下使用悬浮在有待进行吸收的所述含水介质中的所述藻类，以避免其凝聚。所述藻类也可附着到放置在所述含水介质中的平滑、多孔或是珠形式的固体支持物上。所述方法是可移动的，即使所述藻类与独立于核电站的室中的待进行除污处理的介质接触；或者在原位进行；在后一种情况下，所述藻类随即被直接植入到待进行除污处理的介质中。在原位吸收或净化方法的情况下，所述藻类可在不影响操作的情况下驻留在电厂中。作为例示，所述藻类的生长可通过光照强度(避光或弱光照)，或照明灯波长的选择(例如黄绿色非光化性光)来控制。过滤水也使得通过吸收悬浮在水中的藻类来控制其生长成为可能。如果证明有必要除去这些藻类，这些藻类的明确破坏可伴随有金属的释放，因此，必须优选由电厂中的部门进行，并回收包含一定浓度金属的废物。在移动性方法的情况下，在温育结束时，通过常规手段(过滤、倾析、离心等)收集吸收有金属的藻类。在任选地干燥和/或焚烧后，可将所述藻类作为废物除去，无需预先提取其所包含的金属。有利地，可回收所述藻类吸收的金属以将这些金属再利用。这种回收可通过任何适合的手段进行。例如，可非破坏性地回收所述藻类吸收的至少部分金属，从而可以在适合的条件下重新使用所述藻类，特别是对于如Ag和Cr的金 属，所述金属在吸收后大部分保留在粘液水平和细胞表面水平。可通过将所述藻放置在存在络合或酸溶液的条件下来进行所述回收。因此，对于诸如Ag的金属，尤其可通过在pHΓ2. 5，优选pH I. 5^2的酸性介质中处理所述藻类f 2天来进行回收。对于诸如Cr的其他金属以及结合在粘液水平和细胞表面水平的金属部分，还可通过使用O. lmol/1诸如EDTA的螯合剂处理I小时至3天,优选处理约I天的方式进行回收。对于在被藻类吸收后隔离在细胞内的诸如Co的金属，可通过在pH O. 5的酸性介质中处理所述藻类2 10天进行回收，但对细胞的后续存活力没有任何保证。所述金属还可以在破坏所述藻类后被回收。这种破坏可以通过，例如裂解所述藻类而进行。还可以通过，例如焚烧所述藻类而进行。可以在需要从含水介质提取放射性或非放射性金属，特别是上述那些金属的所有情况下实施本发明的方法，以用于矿业操作，或对含金属的含水废物、特别是放射性废物进行除污处理的目的。除了特异性吸收和浓缩上述金属(Ag、Co、Cr、Zn、Mn、Sb、Cs、Ni、Fe、锕系金属或镧系金属，无论其具有放射性还是没有放射性)的强能力外，胶球藻属的藻类，特别是Coccomyxa actinabiotis种的藻类,还具有非特异性吸收其他金属的性质,特别是借助于其由具有络合阳离子性质的多糖组成的细胞外粘液。因此，本发明的方法特别适合用于放射性或非放射性金属污染的含水介质或土壤(泥炭沼泽、湿地)的除污和净化，更特别地，用于放射性介质，例如来自核电站或反应堆的贮存池的水或二次冷却回路的轻水，或者来自核电站排放到环境中的废物的除污和净化。本发明不仅可以使用Coccomyxa actinabiotis种的单细胞绿藻类实施,还可以使用微生物混合物实施，所述微生物混合物包含Coccomyxa actinabiotis种的单细胞绿藻类和至少一种微生物，特别是细菌、真菌、酵母、另一种单细胞藻和/或多细胞植物，优选抗辐射或耐辐射、能够浓缩溶解的金属离子和/或吸收并代谢金属之外的放射性化合物(例如，3H或14C)的那些。可与Coccomyxa actinabiotis种的单细胞绿藻类组合使用的多细胞植物和微生物特别是上文所述的那些，特别是抗辐射或耐辐射的那些。在将本发明应用于放射性含水介质的情况下，微生物混合物的温育时间依赖于组成所述混合物的微生物的个体抗性。类似地，可调整培养条件，以促进组成所述混合物的一种或多种微生物的生长。由以下说明可更清楚地理解本发明，其涉及描述Coccomyxa actinabiotis种的分离和表征及其用于净化放射性含水介质的应用的实施例。所述实施例通过以下附图的方式进行说明-图IA和IB代表了通过光子显微镜(Zeissbinocular Axioplan 2显微镜，图IA和IB的放大倍率分别为1000和3000)观察的本发明微藻类的图片。图IB显示了两个具有鞭毛的细胞的接合。-图2 显不了 Coccomyxa actinabiotis 微藻类的 18SrRNA-ITSl-5. 8SrRNA-ITS2-26 S rRNA 核糖体 DNA 基因(前 500 个碱基)的序列。-图3显示了通过使用ClustalW22. 0. 12软件的多序列比对而进行的微藻CCAP216/25与数据库中列出的其他胶球藻种的核糖体RNA小亚基(18S rRNA)序列的比较。-图4显示了作为以戈瑞(Gy)计的福射剂量的函数的Coccomyxaactinabiotis的死亡百分比。-图5说明了Coccomyxa actinabiotis对金属的结合和浓缩。该图显示了所得的金属11(taAg、6°C0、51Cr、65Zn、54Mn和124Sb的浓缩系数，其中所述浓缩系数定义为微藻中吸附或吸收的金属浓度(新物质的原子/g)与水中金属浓度(原子/ml)的比。-图6 8显不了在有(图7)或没有(图6和8)粘液时,Coccomyxaactinabiotis微藻结合和掺入金属银(图6和7)和钴(图8)的动力学。以接触时间(小时)的函数表示的吸附-吸收的金属量(以百分比计)。图6A :包含110 μ g/1银离子的溶液；图6B :包含5. 5mg/l银离子的溶液；图7A :包含I. lmg/1银离子的溶液；图7B :包含55mg/l银离子的溶液;图8A :19 μ g/1钴尚子;图8B :0. 94mg/l钴尚子;图8C -A. 8mg/l钴尚子。-图9显示了通过Coccomyxaactinabiotis的培养物引入14C。包含所述藻类的颗粒中(三角形)和培养上清(菱形)中的碳氢化合物形式的14C的百分比以时间(小时)函数表示。-

图10显示了在Coccomyxaactinabiotis存在下,放射性元素忙存池中作为时间(天)函数的银-IlOm的浓度(表示为kBq/Ι)。实施例I :Coccomyxa actinabiotis 的分离和表征从核反应堆的废燃料贮存池收集微藻。该贮存池中包含的水的pH为5. 2 5. 8，电导率为f I. 5 μ S/cm,与环境空气接触并且包含溶解的放射性元素。其温度在23 30°C之间的范围，平均为25°C。所述贮存池中的放射性活性依赖于测量点而在低至很高的范围变化。在接触废燃料元素后，Y活性可达到数千Gy/h。在该贮存池的壁和多个表面上观察到了绿色有机物膜的存在。采集样品，在显微镜下观察时，其显示为单细胞绿色微藻。培养条件将采集的样品贮存并放置在光照、pH 5飞.5、温度23°C且由可进行气体交换的多孔瓶塞封闭的无菌Erlenmeyer瓶中培养。测试了以下培养基-BBM培养基(Bold，s Basal Medium, Sigma)，纯培养基或由去矿质水稀释。BBM
培养基通常用于培养绿藻；
-BGll 培养基(Rippka et al.，“The Prokaryotes”，vol. 1:212-220，1979; Sigma)。这种培养基通常用于培养蓝细菌；-弱矿化水(电导率1 1·5 μ S/cm)，或去矿质水(电导率O. 05 μ S/cm)。下表I中标出了 BBM和BGll的组成表I
_组分g/L__BBM__BGll_
_NaNO3__025__L5_ _KH2PO4__0.175__
_K2HPO4__0.075__
_K2HPO4JH2O___(λ04_
_MgSO4JH2O__0.075__0.075_
_FeSO4JH2O__0.005__
_CaCUH2O__0.025__0.036_
_NaCl__0.025__
_Na2EDTA__OOl__
_KOH__0.QQ6__
_梓檬酸___0006_
_梓檬酸铁铵___0.006_
_微暈元素(mg/L)_
_H3BO4__12.86__^86_
_MnCMH2O__L81__L81_
_ZnSO4TH2O__0.222__0.222_
_Na2MoO4^H2O__039__039_
_CuSO4-SH2O__0.079__0.079_
_Co(NO 止.6H20__0.049__0.049_
_pH_^_6Λ_^_65_在BGll和BBM培养基中，所述微藻在这两种培养基中以类似的指数生长期生长。在弱矿化水或电导率为O. 05 μ S/cm的去矿质水中，所述微藻在短时间内以快速生长期生长，这与BGl I和BBM培养基获得的结果类似，但在电导率为O. 05 μ S/cm的去矿质水中，其健康状况在3 4周后恶化，这可能是由于储量(reserves)耗尽造成的。将所述藻类放置在固体琼脂BBM培养基上培养。由此分离圆形集落，随后各自铺在琼脂培养基上。将此操作重复6次以获得源自单个细胞的纯培养物。根据布达佩斯条约，在2009年6月25日将此培养物(下文称作微藻CCAP216/25)的样品保藏在藻类和原生生物培养物保藏中心(CCAP)，地址在英国阿盖尔郡苏格兰海洋科技协会，Dunstaffnage海洋所，保藏号为CCAP 216/25。形杰学和牛物化学特证
所分离的微藻是单细胞微藻。通过光子显微镜和共焦显微镜观察，其细胞有核，呈椭圆形。其平均长度为6.8±0.9μπι，平均宽度为3.8±0.6μπι。然而，根据其生长阶段，可观察到更大的平均长度，达9-10 μ m,或更小的平均长度，约5 μ m，特别是在刚刚分裂后。所述微藻包含叶绿体(或许多个)，该叶绿体包含叶绿素，是光合作用的位点。蛋白颗粒，即淀粉核，占据了叶绿体的一部分，其涉及淀粉的合成等。其他细胞器，特别是液泡，占据了细胞的其余部分。在其植物形式中，所述细胞不具有移动性。有时，某些个体具有两条运动鞭毛，其为进行生殖的性细胞或配子，或参与增殖以使物种散播的游动孢子。通过原始细胞或母细胞的分裂形成这两种类型细胞。在琼脂培养基上的培养物中，所述细胞保持聚集在饼状的聚集体中。从贮存池新采集的细胞与在BBM培养基中培养一个月的细胞有一些差异的区别。 前者具有大贮藏粒，大多彼此聚集，通过由多糖组成的粘液保持在一起，并且其具有鞭毛的细胞的运动性降低。在将培养在BBM培养基中的所述藻类送回到放射性和营养胁迫条件时，其恢复成从贮存池水分离的那些细胞的形态。从贮存池水分离的细胞的着色更深(鲜绿色)，通常被很好地区分(bienindiVidualis6es)，且在对培养物定期搅动时，其具有鞭毛的细胞非常活跃。因此，可以将这种微藻在分离出该微藻的不利培养基中的形态学和行为学变化理解为是对特定物理化学条件(存在电离辐射、存在诱导氧化和电离胁迫的放射性金属；缺少矿物盐，导致营养胁迫)的适应。图IA和IB代表了在将源自反应堆的池的样品引入至BBM培养基中I个月后，通过光子显微镜观察的这些微藻的图片。位于叶绿体中的淀粉可通过卢戈氏液(I2+IK=碘化水)染色显示。对这种反应的阳性反应(棕色至蓝紫色染色)可将这种微藻归类至绿藻类(=绿藻门)。该生物的UV-可见光吸收谱显示存在叶绿素a (吸收峰在663nm)、叶绿素b (吸收峰在647nm)和胡萝卜素(吸收峰在470nm)。因此，该生物为单细胞、真核细胞和淡水类的绿藻，其属于对植物具有亲和性的原生生物界，因此属于原生植物类。因为其包含叶绿素a和b和胡萝卜素作为光合色素且其储量是淀粉，所述生物属于绿藻门或绿藻类。核糖体DNA基因的扩增和测序通过Newman等的方法(Genetics, 126:875-888，1990),从按如上描述分离的微藻A提取总DNA。通过PCR 扩增覆盖 18S rRNA-ITSl-5. 8S rRNA_ITS2_26S rRNA (前 500 个碱基)核糖体DNA基因的基因组区域，并测序。所使用的引物为常用于扩增微藻rRNA基因的EAF3: TCGACAATCTGGTTGATCCTGCCAG(SEQ ID NO:2)和 ITS055R:CTCCTTGGTC CGTGTTTCAAGACGGG(SEQ ID NO:3)。使用从两个独立培养物分离的DNA获得的扩增产物为4kb (即，比通常描述的微藻长lkb)。这些扩增产物的序列显示在图2和序列表的SEQ ID NO: I中。该序列包含微藻CCAP 216/25特异性的且如图2中加粗斜体字显示的约500碱基对的2个插入物。使用BLASTN 算法(Altschul et al. Nucleic AcidsResearch, 25:3389-3402, 1997)在数据库中检索与序列SEQ ID NO: I显示最大同一性的核糖体RNA基因序列。为了进行该检索，取出图2中加粗斜体字显示的约500碱基对的2个序列。该检索显示，特征与微藻CCAP 216/25最接近的物种属于胶球藻属。然而，序列SEQID NO: I包含约500碱基对的2个特异性插入物，其在目前表征的胶球藻属藻类中没有发现。通过使用Clustal W22. O. 12软件的多序列比对，将微藻CCAP 216/25与数据库中列出的其他胶球藻种的核糖体RNA小亚基(18S rRNA)的序列进行比较。序列比对显示在图3中。下表II给出了该序列比对的结果。参考其在序列表中的编号，成对比较的18S rRNA的序列显示在SEQ ID A和SEQ ID B列中。表II
权利要求
1.胶球藻属的单细胞绿藻类，其特征在于其属于Coccomyxaactinabiotis种,所述的Coccomyxa actinabiotis种通过在 18S核糖体RNA-ITS1-5. 8SrRNA_ITS2_26S rRNA基因中存在与序列SEQ ID NO: I具有至少95%同一性的序列而定义。
2.如权利要求I所述的单细胞绿藻类，其具有在2009年6月25日保藏在CCAP，保藏号为 CCAP 216/25 的 Coccomyxa actinabiotis 株的特征。
3.用于从含水介质吸收选自金属Ag、Co、Cr、Zn、Mn、Sb、Ni、Fe、Cs、锕系元素和镧系元素以及放射性同位素14C和3H的至少一种元素的方法，其中所述含水介质包含溶解的所述金属或所述放射性同位素，所述方法的特征在于所述吸收通过在所述含水介质中温育所述胶球藻属的单细胞绿藻类而进行。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述绿藻类如权利要求I或2所定义。
5.如权利要求3和4任一项所述的方法，其特征在于所述含水介质是放射性介质。
6.如权利要求5所述的方法，其用于吸收选自Ag、Co、Cr、Zn、Mn、Sb、Ni、Fe、Cs、锕系元素和镧系元素的金属，所述方法的特征在于所述金属是放射性同位素的形式或同位素混合物的形式。
7.如权利要求:Te中任一项所述的方法，其特征在于所述绿藻类与至少一种其他微生物和/或至少一种多细胞植物组合。
8.如
权利要求
Γ7中任一项所述的方法，其特征在于通过控制所述含水介质的光照而控制所述Coccomyxa actinabiotis种绿藻类的生长。
9.如
权利要求
Γ8中任一项所述的方法，其特征在于所吸收的元素是金属，所述方法包括从所述藻类回收所述金属的步骤。
10.胶球藻属的绿藻类用于净化放射性含水介质的应用，所述放射性含水介质包含选自金属Ag、Co、Cr、Zn、Mn、Sb、Ni、Fe、Cs、锕系元素和镧系元素以及放射性同位素14C和3H中的至少一种元素。
11.如权利要求10所述的应用，其特征在于所述绿藻类如权利要求I或2所定义。
12.如权利要求10或11所述的应用，其特征在于所述绿藻类与至少一种其他抗辐射或耐辐射微生物和/或至少一种抗辐射或耐辐射多细胞植物组合。
全文摘要
本发明涉及胶球藻属的新藻类，特别是名为Coccomyxa actinabiotis的新种的藻类，及其用于从含水介质，特别是从放射性介质吸收金属的应用。
文档编号C02F3/34GK102869764SQ201180018527
公开日2013年1月9日 申请日期2011年2月11日 优先权日2010年2月12日
发明者科琳娜·里瓦索, 埃马纽埃尔·法里, 阿兰·库特, 阿里亚纳·阿泰亚 申请人:原子能与替代能源署, 马克斯·冯·劳厄 - 保罗·朗之万研究所, 国家科学研究中心, 国家自然历史博物馆