一株可降解石油烃的溶杆菌及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一株可降解石油烃的溶杆菌——海连溶杆菌2-5，及其在微生物降解石油烃中的应用。海连溶杆菌（Lysobacter hymeniacidonis）2-5，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2013年1月18日，保藏编号CGMCC No.7164。本发明的海连溶杆菌2-5是溶杆菌属的新菌种，分离自石油污染的海绵样品，能够有效降解石油烃并利用石油作为生长的唯一碳源。在人工海水培养基中，7天内对石油烃（初始浓度为1000mg/L）的平均降解率为67.8%。本发明的海连溶杆菌2-5可用于石油烃的降解。
CGMCC No7164
20130118
【专利说明】-株可降解石油烃的溶杆菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一株可降解石油烃的溶杆菌及其应用。
【背景技术】
[0002] 随着石油工业的迅速发展，人们越来越多地涉及海上石油开发，因此，井喷、运 输船舶的石油泄漏、撞船、沉船以及输油管道的泄漏等事故，造成的海上溢油事故也时 有发生，严重污染了海洋环境，给海洋的生态平衡带来了极大危害。因此，需要采取及 时有效的措施对石油污染进行迅速处理。而目前公认的处理海洋石油污染最环保的方 法就是利用微生物降解石油。据统计已经发现能够降解石油的微生物超过了 200多种， 在海洋环境石油经降解占主导地位的微生物主要包括：无色杆菌属（Achromobacter )、 不动杆菌属（Acinetobacter)、产喊杆菌属（Alcaligenes)、芽抱杆菌属（Bacillus)、黄 杆菌属（Flavobacterium)、棒杆菌属（Coryneforms)、微杆菌属（Microbacterium)、放 线菌属（Actinomycetes)、诺卡氏菌属（Nocardia)、假单胞菌属（Pseudomonas)、食烧菌 属（Alcanirorax)、解环菌属（Cycloclasticus)、海杆菌属（Marinobacter)、海细菌属 (Marinobacterium)、油螺旋菌属（Oleispira)、海旋菌属（Thalassospira)和微球菌属 (Miro coccus)等。目前对降解微生物资源的研究已成为一个新的重要方向，越来越多的石 油降解微生物被发现，国际上已建成了专门的降解微生物菌群资源库。分离筛选对石油烃 具有降解能力的菌株，是研究微生物降解石油机理及对石油烃污染环境进行生物修复的基 础。石油降解菌的研究已经从近海环境扩展到大洋、极地等环境，这些降解菌主要是从海 水、海泥样品中分离获得，而从石油污染后引发一系列变化的生物体内筛选降解菌的研究 并不多见。
[0003] 海绵作为滤食性的低等海洋动物，体内共生着丰富的微生物菌群，菌群的多样性 与海绵种属及其生存环境密切相关。同时海绵生存环境的变化(包括环境恶化)，将会导致 其共生微生物多样性的变化。海绵微生物和海绵互利共生，不仅能为海绵提供营养物质和 能量，还可通过生产和释放一些具有生物活性的化合物，参与海绵对抗化学污染的生物防 御系统，其中一个重要的功能是降解污染。从海绵中筛选出具有高效石油降解能力的微生 物，探索该类海绵相关微生物对环境的修复作用，及其与宿主在生物修复方面的协同作用， 形成一种高度符合自然规律的生物修复方法，为海洋石油污染的生物修复提供理论和技术 基础。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一株可降解石油烃的溶杆菌。
[0005] 本发明所提供的溶杆菌是从大连湾潮间带原油污染的海绵样品中筛选到的。根 据其形态特征、培养特性、生理生化特性和16S rRNA基因序列分析等证实属于溶杆菌属 (Lysobacter)新种，命名为海连溶杆菌（Lysobacter hymeniacidonis) 2-5。海连溶杆菌 (Lysobacter hymeniacidonis) 2-5已于2013年1月18日保藏于中国微生物菌种保藏管 理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研 究所)，保藏登记号为CGMCC NO. 7164。
[0006] 海连溶杆菌（Lysobacter hymeniacidonis) 2-5CGMCC NO. 7164 为革兰氏阴性菌， 细胞呈杆状，无鞭毛，没有运动性，大小为（1.1?1.2) μ mX (0.2?0.3) μ m。在LB培养 基上培养3天，该菌株的菌落呈大圆形、光滑、较大、隆起、浅棕黄色、半透明、边缘整齐等特 征。
[0007] 海连溶杆菌（Lysobacter hymeniacidonis) 2-5CGMCC NO. 7164 属于好氧菌，可生 长的pH范围为6. 0?8. 0,最适生长pH值为7. 2 ;可生长温度范围为15?42°C，最适生长 温度为30°C ;该菌株能在0?6%(w/v)盐度范围内生长，最适生长盐度为3%。
[0008] 海连溶杆菌（Lysobacter hymeniacidonis)2_5CGMCC NO. 7164接触酶和氧化酶阳 性，β -半乳糖苷酶、精氨酸双水解酶、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、脲酶和色氨酸脱氨酶 阴性；该菌株的柠檬酸盐利用、七叶灵水解、V. Ρ.反应、明胶液化阳性，淀粉水解和硝酸盐 还原阴性。该菌株能利用糖原、L-阿拉伯糖、a-环糊精、N-乙酰半乳糖胺、N-乙酰葡萄糖 胺、核糖醇、L-阿拉伯糖、D-阿糖醇、D-纤维二糖、D-果糖、a-D葡萄糖、m-肌醇、a-D-乳 糖、乳果糖、麦芽糖、D-甘露糖、D-蜜二糖、甲基葡萄苷、D-绵子糖、L-鼠李糖、D-山梨醇、 D-海藻糖、松二糖、木糖醇、乙酸、顺-阿康酸、柠檬酸、甲酸、D-半乳糖酸内酯、D-半乳糖醛 酸、D-葡糖酸、b-甲基葡糖苷、D-葡糖醛酸、a-羟基丁酸、b-羟基丁酸、g-羟基丁酸、a-氧 代丁酸、a-氧代戊二酸、D，L-乳酸、丙二酸、丙酸、奎尼酸、D-已糖酸、琥珀酰胺酸、葡糖醛 酰胺、L-丙氨酰胺、L-丙氨酸、L-丙氨酰甘氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、甘 氨酰天冬氨酸、甘氨酰谷氨酸、羟基脯氨酸、L-亮氨酸、L-鸟氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、 L-焦谷氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、D，L-肉碱、肌苷和尿苷作为唯一碳源和能源。
[0009] 海连溶杆菌（Lysobacter hymeniacidonis) 2-5CGMCC NO. 7164 细胞中的脂肪酸 主要包括异式十六碳饱和脂肪酸（15. 10%)、异式十五碳饱和脂肪酸（14. 35%)、c〇9c异式 --h七碳单不饱和脂肪酸（9. 45%)、3_轻基异式十三碳饱和脂肪酸（8. 37%)、异式^ 碳饱 和脂肪酸（7. 66%)、ω 7c_十六碳单不饱和脂肪酸/ω 6c_十六碳单不饱和脂肪酸（6. 45%)、 十六碳饱和脂肪酸（5. 33%)、c〇8c型环式 h九碳饱和脂肪酸（5. 20%)、ω 7c异式--h八 碳单不饱和脂肪酸（3. 95%)、异式十七碳饱和脂肪酸（2. 54%)、环式十七碳饱和脂肪酸 (2. 30%)、反异式十五碳饱和脂肪酸（2. 11%)、3-轻基十碳饱和脂肪酸（1. 66%)、异式十碳饱 和脂肪酸（1. 33%)、反异式十七碳饱和脂肪酸（1. 32%)、3_羟基十八碳饱和脂肪酸（1. 30%)、 异式十四碳饱和脂肪酸（1. 23%)、I型-异式/B型-反异式十七碳单不饱和脂肪酸（1. 22%) 和3-羟基八碳饱和脂肪酸（1. 00%)。
[0010] 海连溶杆菌（Lysobacter hymeniacidonis) 2-5CGMCC NO. 7164 的 G+C 摩尔百分 含量为63. 88% ;该菌株的16S rRNA基因序列如序列表中序列1所示，与已发表的溶杆菌属 的模式菌 Lysobacter concretionis KCTC12205、Lysobacter. daejeonensis DSM17634、 Lysobacter defluvii IMMIB APB_9T 和 Lysobacter spongiicola KMM329 的 16S rRNA 基 因序列的同源性分别为96. 0%、96%、96%和95%。
[0011] 海连溶杆菌（Lysobacter hymeniacidonis) 2-5CGMCC NO. 7164 与上述模式菌 株Lysobacter concretionis KCTC122〇roNA杂交的同源性比较低，为23%;同时，该菌 株的生理生化特性、细胞壁脂肪酸组成也与上述模式菌株有明显差异，说明海连溶杆菌 (Lysobacter hymeniacidonis) 2-5CGMCC NO. 7164 是溶杆菌属的一个新菌种。
[0012] 本发明的另一个目的是提供一种降解石油烃的方法。
[0013] 本发明所提供的降解石油烃的方法，是用所述海连溶杆菌（Lysobacter hymeniacidonis) 2-5CGMCC NO. 7164对待测样品进行处理，使石油烃得到降解。
[0014] 上述方法中，所述的应用为：以2216E为基础培养基，对海连溶杆菌2-5菌种进行 扩大培养，以培养获得的菌液为石油降解菌剂，加入到以原油为唯一碳源和能源的人工海 水培养基中，使海水培养基中的原油得到降解。
[0015] 以海连溶杆菌（Lysobacter hymeniacidonis)2_5CGMCC NO. 7164为活性成分制备 的生物制剂也属于本发明的保护范围。
[0016] 本发明的海连溶杆菌（Lysobacter hymeniacidonis)2_5CGMCC NO. 7164是溶杆菌 属的新菌种，分离自石油污染的海绵样品，能够有效降解石油烃并利用石油烃作为生长的 唯一碳源。在人工海水培养基中，7天内对石油烃(初始浓度为1000mg/L)的平均降解率为 67.8%。本发明的海连溶杆菌（Lysobacter hymeniacidonis) 2-5CGMCC NO. 7164 可用于石 油烃的降解。
[0017] 下面结合说明书附图和【具体实施方式】对本发明作进一步说明，并非对本发明的限 制。
【专利附图】
【附图说明】
[0018] 图 1 为海连溶杆菌（Lysobacter hymeniacidonis)2_5CGMCC NO. 7164 在扫描电子 显微镜下的形态照片；
[0019] 图 2 为海连溶杆菌（Lysobacter hymeniacidonis)2_5CGMCC NO. 7164 在透射电子 显微镜下的形态照片；
[0020] 图 3 为海连溶杆菌（Lysobacter hymeniacidonis)2_5CGMCC NO. 7164 的 16S rRNA 基因序列系统发育树分析图；
[0021] 图 4 为海连溶杆菌（Lysobacter hymeniacidonis)2_5CGMCC NO. 7164 对石油煙的 降解曲线图；
[0022] 海连溶杆菌（Lysobacter hymeniacidonis) 2-5已于2013年1月18日保藏于中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路， 中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC NO. 7164。
【具体实施方式】
[0023] 下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材 料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0024] 实施例 1 :海连溶杆菌（Lysobacter hymeniacidonis) 2-5CGMCC NO. 7164 的分离 及鉴定
[0025] 一、降解石油烃菌株的分离
[0026] 分离培养基：（1)人工海水培养基（ASM) =MgSO4 · 7Η207· 0g/L，KC10. 7g/L， ΚΗ2Ρ042· 0g/L，Na2HP043. 0g/L，NH4NO3L 0g/L，NaC130g/L，Crude oil lg/L，ΡΗ7· 2 ;微量元素 溶液 10mL。微量元素组成为：CaCl220mg/L，FeCl350mg/L，CuSO 4O. 5mg/L，MnCl2. 4Η200· 5mg/ L，ZnSO4. 7H2010mg/L。（2)固体平板分离培养基（ASMl):上述人工海水培养基加18g/L琼 脂；（3)固体平板纯化培养基：2216E (Difco)。
[0027] 将石油溶于石油醚中，配制成浓度为100mg/mL的石油溶液。
[0028] 将采自大连湾石油污染海域海绵样品，用无菌手术刀切成小块，在烧杯中用无菌 海水将样品洗涤3次，以除去样品表面附着的微生物和其它杂质，在无菌研钵中研磨5min， 使之成匀浆状，取5mL，加入到灭菌的含IOOmL人工海水培养基ASM的500mL摇瓶中，以石油 (浓度0. 5?lg/L)为唯一碳源进行富集培养，置于28°C，200r/min摇床中培养，做为第一 次富集培养液，7天后，取5mL的第一次富集培养液转接入新鲜的人工海水培养基中，再进 行富集培养，做为第二次富集培养液，7天后，取第二次富集培养液5mL，转接入新鲜的人工 海水培养基中，共转接3次。将最终的富集培养液进行ΚΓ 1、1(Γ2、KT3梯度稀释，涂布固体 平板分离培养基ASMl上；以不加原油的人工海水培养基为空白对照平板，28°C培养7?10 天，挑取单菌落于2216E纯化平板，划线分离单菌，得到纯化的单菌落。挑取纯化后的单菌 落接种在装有5mL液体培养基的2216E试管中，将试管置于200r/min振荡培养箱中，28°C 振荡培养72h左右，取200 μ L菌液加入装有含I. 8mL20%甘油水溶液的冻存管中，-70°C放 置保存备用。
[0029] 结果表明，空白对照平板上没有任何菌落生长，说明没有外加石油作为碳源的平 板上，海水样本中的微生物无法生长；相应的，在加有石油的平板上有菌株能够生长，说明 这些单菌落对应的菌株能够降解石油烃并以石油烃为唯一碳源生长。挑取能够降解石油 烃的单菌落2-5作进一步研究。
[0030] 二、菌株的形态特征
[0031] 将上述步骤一分离得到的菌株2-5接种到2216E培养基中，当细胞生长至对数生 长后期，菌落大小稳定后，进行单菌落平均状态的描述。主要包括菌落的大小、颜色、透明 度、湿润度、菌落表面状态(是否平坦、突起、褶皱、凹陷等)、菌落边缘状态(是否整齐、不规 贝IJ、放射状等)。
[0032] 将处于对数生长期的细胞，采用扫描电子显微镜和透射电子显微镜观察细胞形 态，结果如图1和图2所示；同时进行革兰氏染色，于40X 100倍的光学显微镜下观察菌体 细胞的形态。
[0033] 结果表明，上述步骤一筛选到的菌株菌落直径为2. 5?3mm，呈圆形、光滑、隆起、 黄色、有光泽、半透明、边缘整齐；在电子显微镜下观察，菌体细胞呈杆状、无鞭毛，没有运动 性，大小为（I. 1 ?1. 2) μ--Χ (0· 2 ?0· 3) μ--。
[0034] 二、菌株的生长特性
[0035] 上述步骤一筛选到的菌株属于革兰氏阴性、好氧细菌。该菌株最适生长pH值是 7. 2,可生长pH范围是6. 0?8. 0 ;最适生长温度为30°C，可生长的温度范围为15?42°C。 该菌株属于海洋细菌，生长依赖于盐的存在，能在〇?6 (w/v)盐度范围内生长繁殖，最适 生长盐度3%。
[0036] 四、菌株的生化特征
[0037] 1、碳源利用
[0038] 利用Biolog微生物自动鉴定系统测试菌株对95种碳源的利用情况。先将待测菌 株的纯培养菌落制成细胞悬液，然后接种于GN2鉴定板上培养，再用Biolog Microstation 软件读取数据，确定碳源利用情况。
[0039] 2、其它生化特征
[0040] 该菌株的接触酶、氧化酶、β -半乳糖苷酶、精氨酸双水解酶、赖氨酸脱羧酶、鸟氨 酸脱羧酶、脲酶和色氨酸脱氨酶活性利用ΑΡΙ20Ε生化试剂盒检测；菌株的柠檬酸盐利用、 七叶灵水解、淀粉水解、V. Ρ.反应、明胶液化和硝酸盐还原反应利用ΑΡΙ20ΝΕ生化试剂盒检 测。
[0041] 以上实验结果表明，上述步骤一筛选到的菌株能利用糖原、L-阿拉伯糖、a-环糊 精、N-乙酰半乳糖胺、N-乙酰葡萄糖胺、核糖醇、L-阿拉伯糖、D-阿糖醇、D-纤维二糖、D-果 糖、a-D葡萄糖、m-肌醇、a-D-乳糖、乳果糖、麦芽糖、D-甘露糖、D-蜜二糖、甲基葡萄苷、 D-绵子糖、L-鼠李糖、D-山梨醇、D-海藻糖、松二糖、木糖醇、乙酸、顺-阿康酸、柠檬酸、甲 酸、D-半乳糖酸内酯、D-半乳糖醛酸、D-葡糖酸、b-甲基葡糖苷、D-葡糖醛酸、a-羟基丁 酸、b-羟基丁酸、g-羟基丁酸、a-氧代丁酸、a-氧代戊二酸、D，L-乳酸、丙二酸、丙酸、奎尼 酸、D-已糖酸、琥珀酰胺酸、葡糖醛酰胺、L-丙氨酰胺、L-丙氨酸、L-丙氨酰甘氨酸、L-天 冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、甘氨酰天冬氨酸、甘氨酰谷氨酸、羟基脯氨酸、L-亮氨酸、 L-鸟氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-焦谷氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、D，L-肉碱、肌苷 和尿苷作为唯一碳源和能源。该菌株的接触酶和氧化酶阳性，β_半乳糖苷酶、精氨酸双水 解酶、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、脲酶和色氨酸脱氨酶阴性；该菌株的柠檬酸盐利用、七 叶灵水解、V. Ρ.反应、明胶液化阳性，淀粉水解和硝酸盐还原阴性。
[0042] 五、与溶杆菌属模式菌株生理生化特征比较
[0043] 将上述步骤一筛选到的菌株生理生化特征与溶杆菌属模式菌株（L. spongiicola DSM 21749T,L. concretionis KCTC 12205T, L daejeonensis DSM 17634T, L defluvii DSM 18482τ)的生理生化特征相比较，结果见表1所示。
[0044] 表1筛选到的菌株与溶杆菌属模式菌株的生理生化特征比较
[0045]
【权利要求】
1. 海连溶杆菌2_5(Lysobacter hymeniacidonis2_5)，保藏于中国微生物菌种保藏管 理委员会普通微生物中心，保藏日期2013年1月18日，保藏编号CGMCC NO. 7164。
2. 如权利要求1所述的海连溶杆菌2-5,其特征在于：所述海连溶杆菌2-5菌落特征和 生理生化特性为：杆状，大小为0.2?0.3 iimXl. 1?1.2 iim，革兰氏染色为阴性，在LB固 体培养基30°C培养2?3天后，菌落呈浅棕黄色，圆形，边缘整齐，表面光滑，易挑起；接触 酶和氧化酶阳性，V. P.反应阳性，淀粉水解阴性，柠檬酸盐利用阳性，硝酸盐还原阴性，七叶 灵水解阳性，明胶液化阳性。
3. 如权利要求1所述的海连溶杆菌2-5,其特征在于：所述海连溶杆菌2-5的16S rRNA 序列为： GCGGCAGCTACACATGCAAGTCGAACGGCAGCACGAGAGAGCTTGCT CTCTTGGTGGCGAGTGGCGGACGGGTGAGGAATGCGTCGGAATCTGC CTATTTGTGGGGGATAACGTAGGGAAACTTACGCTAATACCGCATACG ACCTACGGGTGAAAGTGGGGGATCTTCGGACCTCACGCAGATAGATG AGCCGACGTCGGATTAGCTAGTTGGCGGGGTAAAGGCCCACCAAGGC GACGATCCGTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTG AGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGA CAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGC CTTCGGGTTGTAAAGCACTTTTGTACGGGAAGAAACGCGATCGGTTAA TACCCGGTCGAACTGACGGTACCGTAAGAATAAGCACCGGCTAACTTC GTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGTGCAAGCGTTACTCGGAAT TACTGGGCGTAAAGCGTGCGTAGGTGGTTTGTTAAGTCAGATGTGAA AGCCCTGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTTGATACTGGCAGGCTAGA GTGCGGTAGAGGGTAGCGGAATTCCCGGTGTAGCAGTGAAATGCGTA GATATCGGGAGGAACATCCGTGGCGAAGGCGGCTACCTGGACCAGCA CTGACACTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACC CTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGCGAACTGGATGTTGGGGACACTT AGGTCTTCAGTATCGAAGCTAACGCGTTAAGTTCGCCGCCTGGGAAGT ACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACA AGCGGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGCAGAACCTTACC TGGCCTTGACATCCACGGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGG GAACCGTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGA GATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTGC CAGCACGTAATGGTGGGAACTCTAAGGAGACCGCCGGCGACAAGCC GGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCAG GGCTACACACGTACTACAATGGTGGGGACAGAGGGCTGCAAGCCGGC GACGGTGAGCCAATCCCAGAAACCCCATCTCAGTCCGGATTGGAGTC TGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCAGATCAGC ATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAC ACCATGGGAGTGGGTTGCTCCAGAAGTAGCTAGTCTAACCTTCGGGA GGACGGTACCACGGAGAT 。
4. 一种权利要求1?3任一所述的海连溶杆菌2-5在降解海洋环境石油烃污染中的应 用。
5. 如权利要求4所述的应用，其特征在于：以2216E为种子培养基，对海连溶杆菌2-5 菌种进行培养，将菌种接种到种子培养基2216E中培养获得菌悬液，菌悬液以0. 5?2 X 106个细胞/mL培养基的接种量接种到种子培养基中，30°C、转速为200r/min培养48h，得菌液， 以培养获得的菌液为石油降解菌剂，加入到含原油〇. 5?lg/L的海水样品或以原油为唯一 碳源的人工海水培养基(ASM)中，使海水样品或人工海水培养基中的原油得到降解。
6. 如权利要求5所述的应用，其特征在于所述人工海水培养基(ASM)各组分终浓度为： MgS04 ? 7H207. Og/L, KC10. 7g/L, KH2P042. Og/L, Na2HP043. Og/L, NH4N031. Og/L, NaC130g/L, Crude oillg/L，PH7. 2 ;微量元素溶液 lOmL ; 微量元素组成为：CaCl220mg/L，FeCl350mg/L，CuS040. 5mg/L，MnCl2. 4H200. 5mg/L， ZnS04. 7H2010mg/L〇
7. 如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述应用按如下步骤进行： (1) 将5?10g原油溶于约5?10ml的石油醚中，过滤除菌，加入到含100mL人工海水 培养基的500mL摇瓶中，使原油在培养基中的终浓度为0. 5?lg/L ; (2) 将海连溶杆菌2-5种子接种到2216E培养基，30°C、转速为200r/min培养24h，得 菌液，将获得的菌液按接种量为5%体积比，加入到上述人工海水培养基（ASM)中，在30°C、 转速为200r/min的好氧避光条件下培养7天；同时，以不加石油的人工海水培养基作为对 照，以不接种海连溶杆菌2-5的人工海水培养基作为空白对照，用于扣除石油挥发的影响。
【文档编号】C02F3/34GK104371942SQ201310357456
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2013年8月15日 优先权日:2013年8月15日
【发明者】薛松, 信艳娟, 曹旭鹏, 吴佩春 申请人:中国科学院大连化学物理研究所