本发明属于环境工程微生物技术领域，具体涉及一种污水脱氮处理系统中高密度厌氧氨氧化细菌富集的方法。
背景技术：
大量氨氮排入水体会引起水体富营养化。目前，氨氮已经成为污染物总量控制的约束性指标，因此污水处理过程中氮素的去除越来越受到人们的重视。然而传统脱氮技术存在能耗物耗高、工艺流程较长，外加大量有机碳源等缺点，所以开发低能耗物耗的脱氮技术成为水污染治理领域研究的热点。
anammox现象的发现是近年来环境科学领域的重大发现，使人们重新认识和完善了全球的氮循环过程。厌氧氨氧化菌是一种化能自养细菌，能在无需曝气、无需外加碳源的条件下发挥脱氮作用，若将其应用到污水生物脱氮技术之中，不仅可以节省电耗和能耗，而且该技术能够减少温室气体排放量，不产生剩余污泥，与其他厌氧技术耦合后还能产生电能，为污水处理可持续发展做出贡献。
anammox菌(厌氧氨氧化菌)在自然界中分布十分广泛，目前在人工废水处理系统、湿地、稻田等自然生态系统以及海洋生态系统等都发现了anammox菌。另外，很多研究也表明anammox过程在全球氮循环生态系统中发挥着重要作用(对于海洋生态系统的氮损失超过50％的贡献)。
厌氧氨氧化菌的富集存在很多难点，比如厌氧氨氧化菌的世代周期长达11d，anammox菌的细胞产率为0.066molc/molnh4+，对外界环境条件非常严苛，人们至今只能通过分析anammox菌的混培物来分析anammox菌，不能通过纯培养而得到anammox菌株，厌氧氨氧化菌具有群感效应，必须富集到一定丰度才能发挥作用。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种利用大孔聚氨酯填料在污水脱氮处理系统中高密度厌氧氨氧化细菌富集的方法。
本发明所提供的污水脱氮处理系统中高密度厌氧氨氧化细菌富集的方法，包括以下步骤：
1)收集含有厌氧氨氧化细菌菌群的硝化污泥，配制活性污泥溶液；将所述活性污泥溶液接种于厌氧氨氧化细菌的富集培养基中，进行硝化驯化，至氨氮的转化率不低于80％；
2)将驯化后的污泥接种到反应器，并向所述反应器中投加大孔聚氨酯填料以及氨氮和亚硝酸盐氮，然后对所述反应器进行低基质浓度启动厌氧氨氧化反应器，同时所述大孔聚氨酯填料进行挂膜生长；
3)增加氨氮和亚硝酸盐氮的加入量，对步骤2)的反应器进行中高基质浓度启动厌氧氨氧化反应器；同时增加所述反应器中大孔聚氨酯填料的投加率；
4)继续增加氨氮和亚硝酸盐氮的加入量，对步骤3)的反应器进行高密度厌氧氨氧化细菌的富集。
上述方法所述步骤1)中，含有厌氧氨氧化细菌菌群的硝化污泥取自北京市某污水处理厂的曝气池，厌氧氨氧化细菌的基因丰度具体为(7.76±0.25)×106copies·g-1干泥。所述活性污泥溶液中污泥的浓度为5000～5500mg/l。
上述方法所述步骤1)中，富集培养基包括下述中浓度的物质：nahco32.0-2.5g/l；kh2po40.005-0.008g/l；cacl2·2h2o0.4-0.8g/l；mgso4·7h2o0.3-0.4g/l；feso4·7h2o0.020-0.025g/l；edta·2h2o0.028-0.032g/l和微量元素0.8-1.2ml/l。
上述方法所述步骤1)中，微量元素包括下述终浓度的物质：mncl2·4h2o：850-950mg/l；edta：1300-1400mg/l；znso4·7h2o：350-450mg/l；cuso4·5h2o：200-250mg/l；cocl2·6h2o：200-250mg/l；namoo4·2h2o：180-220mg/l；na2seo4：80-120mg/l；nicl2·2h2o：150-200mg/l；h3bo4：10-15mg/l。
上述方法所述步骤2)中，大孔聚氨酯填料为大孔立方体聚氨酯填料，其材料密度1.1～1.15/g·cm-3，比表面积(30～40)×104m2·m-3，孔径2～4mm，孔隙度93～96％。上述方法所述步骤2)中，所述反应器具体可为sbr反应器。
上述方法所述步骤2)中，低基质浓度启动厌氧氨氧化反应器的运行条件为：ph：7.5～8.1；转速：60～80rpm/min；温度：35±1℃；水力停留时间(hrt)为2～3d；氮气曝气去除溶解氧(do)，曝气时间：10～20min，避光。
上述方法所述步骤2)中，所述大孔聚氨酯填料的投加率为所述反应器体积的28％-32％。
上述方法所述步骤2)中，对反应器进行低基质浓度启动厌氧氨氧化反应器，为启动阶段的不稳定期。所述氨氮和亚硝酸盐氮以氮计的摩尔比为1：1；在所述低基质浓度启动厌氧氨氧化反应器的过程中，所述氨氮的浓度由13-17mg/l增加至27-33mg/l，所述亚硝酸盐氮的浓度由13-17mg/l增加至27-33mg/l。
上述方法所述步骤2)中，当所述反应器中总氮的去除率基本稳定，维持在25％-30％时即可进入下一阶段即步骤3)。
上述方法所述步骤3)中，中高基质浓度启动厌氧氨氧化反应器的运行条件为：ph值为7.5-8.1，转速为60-80rpm/min，温度为35±1℃，水力停留时间(hrt)为1～2d；氮气曝气去除溶解氧(do)，曝气时间：10～20min，避光。
上述方法所述步骤3)中，在所述中高低基质浓度启动厌氧氨氧化反应器的过程中，所述氨氮和亚硝酸盐氮以氮计的摩尔比为1：1.3，其中氨氮的浓度由27-33mg/l逐渐增加至65-75mg/l，所述亚硝酸盐氮的浓度由27-33mg/l逐渐增加至85-95mg/l。
上述方法所述步骤3)中，所述中高基质浓度启动厌氧氨氧化反应器可分为两个阶段，即厌氧氨氧化菌的活性迟滞期和厌氧氨氧化菌的活性提高期；
其中，厌氧氨氧化菌的活性迟滞期的水力停留时间(hrt)可为2d；厌氧氨氧化菌的活性迟滞期阶段填料填充率为43％-47％；氨氮的浓度由27-33mg/l增加至45-55mg/l，亚硝酸盐氮的浓度由27-33mg/l增加至60-70mg/l；
厌氧氨氧化菌的活性提高期水力停留时间(hrt)可为1d；厌氧氨氧化菌的活性提高期阶段填料填充率为63-67％；氨氮的浓度进一步增加至65-75mg/l，亚硝酸盐氮的浓度进一步增加至85-95mg/l。
在上述厌氧氨氧化菌的活性迟滞期，tn去除率维持在30％左右；当tn去除率明显增加时，表明进入了厌氧氨氧化菌的活性提高期；当tn去除率稳定在70％左右时，可通过继续增加氨氮和亚硝酸盐的浓度，实现对anammox菌的进一步富集。
上述方法所述步骤4)中，在所述中高低基质浓度启动厌氧氨氧化反应器的过程中，所述氨氮的浓度增加至95-105mg/l，所述亚硝酸盐氮的浓度增加至125-135mg/l。
上述方法所述步骤4)中，高密度厌氧氨氧化细菌的富集的运行条件为：ph值：7.5～8.1；转速：60～80rpm/min；温度：35±1℃；水力停留时间(hrt)为0.5～1d；氮气曝气去除溶解氧(do)，曝气时间：10～20min，避光。
上述方法中向反应器中投加大孔聚氨酯填料，进行挂膜生长，填料初始投加率为反应器体积的28％-32％(具体可为30％)，根据每次的基质浓度的提高，逐步增加填料的填充率，最终反应器内填料的填充比为63-67％(具体可为65％)。
采用本发明的富集方法，得到的厌氧氨氧化菌的丰度可达1.54×1011copies·g-1。在上述对高密度厌氧氨氧化细菌的富集过程中厌氧氨氧化反应器中的总氮去除率为70％以上。富集得到的厌氧氨氧化细菌的优势菌为candidatusbrocadia。
本发明采用以上技术方案，其优点在于，大孔聚氨酯填料能为厌氧氨氧化菌提供微氧环境，并能适应厌氧氨氧化菌聚团生长的特性，有助于淘汰aob(氨氧化菌)和nob(亚硝酸盐氧化菌)等细菌，可以得到纯度较高、丰度较高的厌氧氨氧化细菌。
附图说明
图1为本发明采用的试验系统装置的示意图。
图中各数字序号分别表示如下：1.sbr反应器2.进水箱3.出水箱4.高纯氮气瓶5.溶解氧(do)在线测定仪6.ph在线测定仪7.搅拌机8.大孔填料9.氧化还原电位(orp)在线测定仪10.取样口。
图2为不同启动阶段anammox细菌的系统发育树。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明，但本发明并不局限于此，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所采用的填料为大孔立方体聚氨酯填料购自北京丰泽绿源环境技术有限公司，其材料密度1.1～1.15/g·cm-3，比表面积(30～40)×104m2·m-3，孔径2～4mm，孔隙度93～96％。
下述实施例中tn的测定方法为碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法gb11894－89。
实施例1、污水脱氮处理系统中高密度厌氧氨氧化细菌的富集
收集含有厌氧氨氧化细菌菌群的硝化污泥(该硝化污泥取自北京市肖家河污水处理厂曝气池污泥)，配制活性污泥溶液(污泥浓度为5500mg/l)。将所述活性污泥溶液接种于富集培养基中经80天实验室硝化驯化后(氨氮的转化率为83％)，取3l污泥接种到sbr反应器中，补充水至6l将，最终污泥浓度为5000mg/l。
试验以人工配水为基础用水，富集培养基具体配方如下：nahco32.31g/l；kh2po40.007g/l；cacl2·2h2o0.6g/l；mgso4·7h2o0.35g/l；feso4·7h2o0.023g/l；edta·2h2o0.03g/l和微量元素1ml/l。
微量元素配方为：mncl2·4h2o：900mg/l；edta：1350mg/l；znso4·7h2o：400mg/l；cuso4·5h2o：224mg/l；cocl2·6h2o：230mg/l；namoo4·2h2o：190mg/l；na2seo4：100mg/l；nicl2·2h2o：185mg/l；h3bo4：13mg/l。
采用图1所示的装置进行试验。对sbr反应器进行厌氧环境避光启动，将进水ph值调至7.8～8.0，温度控制在35±0.5℃，人工配制进水后鼓入氮气去除氧气。
对反应器进行低基质浓度启动厌氧氨氧化系统，即启动阶段的不稳定期(第1～21d)，hrt为3d，氨氮和亚硝酸盐氮按接近1:1的比例由15mg/l逐渐增加至30mg/l。该时期开始阶段氨氮浓度不降反升，之后亚硝酸盐开始积累，这是因为在缺氧系统中好氧菌死亡裂解释放出氨氮和cod，随后系统中由于水中含有少量的do可能发生短程硝化和不完全的反硝化使得亚硝酸盐开始积累。随着反应器运行由于缺乏碳源不能进行正常的反硝化作用，亚硝酸盐氮逐渐减少。
启动阶段的不稳定期，载体(大孔立方体聚氨酯填料)的填充率为30％，这一时期填料开始挂膜。
当反应器中的tn去除率稳定维持在25％-30％，表明不稳定期结束，进入下一阶段。
对反应器进行中高基质浓度启动厌氧氨氧化系统的anammox菌的活性迟滞期(第22～64d)，hrt由3d逐渐降至2d，氨氮和亚硝酸盐氮的浓度分别增加至50mg/l和65mg/l。该阶段前期由于进水中仍有部分溶解氧加之反应器搅拌作用，使得某些氨氧化细菌进行部分硝化作用。该阶段anammox菌的活性较低，此阶段的tn去除率维持在30％左右。
anammox菌的活性迟滞期，载体(大孔立方体聚氨酯填料)的填充率为45％，这一时期填料微生物挂膜明显，呈现褐色。
对反应器进行中高基质浓度启动厌氧氨氧化系统的anammox菌活性提高期(65～92d)，hrt为1d，将氨氮和亚硝酸盐的浓度最终分别增加至70mg/l和91mg/l，在该阶段运行至80d时，tn去除率逐渐升高，最终稳定在70％左右。
anammox菌的活性提高期，载体的填充率为65％，这一时期填料逐渐变为浅红色。
为了进一步富集anammox菌，继续将氨氮和亚硝酸盐的浓度分别增加至100mg/l和130mg/l，此时tn去除率迅速下降至40％，anammox活性受到抑制，随后又降低亚硝酸盐浓度至100mg/l，anammox菌活性有所恢复，目前tn去除率基本维持在70％以上。这说明本实验中anammox菌受亚硝酸盐的抑制浓度不超过130mg/l，而这种抑制是可逆的，当减小至100mg/l可解除亚硝酸盐anammox菌的抑制作用。最终氨氮和亚硝酸盐的投加浓度稳定在100mg/l，进行厌氧氨氧化菌的高密度富集。
厌氧氨氧化菌的高密度富集阶段(93～125d)，载体的填充率为65％，这一时期填料逐渐变为红色。
厌氧氨氧化菌的高密度富集阶段，运行至125d，取sbr反应器中的污泥进行测定，厌氧氨氧化菌的丰度为1.54×1011copies·g-1干泥。
厌氧氨氧化菌的高密度富集阶段，运行至125d，厌氧氨氧化反应器中的总氮去除率为79％。
厌氧氨氧化菌的高密度富集阶段，厌氧氨氧化反应器中的厌氧氨氧化细菌的优势菌为candidatusbrocadia。
厌氧氧化细菌的鉴定方法如下：厌氧氨氧化菌的高密度富集阶段，运行至125天，通过基因组dna的提取、pcr扩增、pcr产物的克隆、酶切、测序与系统发育树构建、定量pcr(苏州金唯智公司检测)等分子生物学技术检测，考察了系统中的厌氧氨氧化菌的细菌群落结构，具体扩增引物序列与反应程序见表1，运用mothur软件对所测出的dna序列按3％的差异度分析，得出样品的独立操作分类单元(otu)见表2，运用mega5软件做出的系统发育树结果见图2。结果表明，厌氧氨氧化反应器中的厌氧氨氧化细菌的优势菌为candidatusbrocadia；厌氧氨氧化菌的丰度为1.54×1011copies·g-1(拷贝数就是荧光定量pcr结果)。
表1anammox菌的扩增引物及定量pcr扩增引物序列及反应程序
表2不同培养阶段厌氧氨氧化细菌的操作分类单元(otu)