专利名称：卷裹型肝组织工程支架的制造工艺的制作方法
技术领域：
本发明属于医疗行业的生物制造领域，涉及一种可生物降解的卷裹型肝组织工程支架的制造工艺。
背景技术：
肝脏移植是治疗重型肝病患者最有效手段，然而受供体匮乏的制约，全世界每年肝移植数量也仅4-6万例；肝细胞移植能在一定程度上修复肝脏功能，但由于移植途径、细胞数量、局部微环境以及免疫排斥反应等因素的限制，至今未能在临床上广泛开展；体外人工肝支持系统作为肝移植前的过渡手段，只能完成过滤、净化等单一功能，难以提供连续的治疗，无法代替人体肝脏的全部生化作用；现有的肝组织工程支架多采用传统致孔法制备，虽包含相互连通的孔洞，但无法控制孔洞的分布，更无法获得有序分布的多级微结构发明内容针对上述肝病治疗手段的局限性，本发明运用组织工程的基本原理，结合材料科学和工程技术，提出了一种卷裹型肝组织工程支架的制造工艺。该工艺不仅能实现不同种类的细胞在支架内部的有序分布，还可以使支架具有最大的孔隙率，即物质交换能力，而且随着支架材料的降解，支架内部血管网系统和肝组织逐渐形成，实现人工肝向自然肝的转化，即肝组织的工程化制造，从而可以解决肝移植手术中供需的矛盾。
本发明的技术原理是，依据是否将血管网系统和肝细胞孔洞设计在同一模板上，肝组织工程支架的微制造工艺略有不同。对于血管网系统和肝细胞孔洞分离的肝组织工程支架，需要制造半通透膜，卷裹时夹于血管血管网系统模板和肝细胞孔洞模板之间，以防止肝细胞和血管内皮细胞的相互扩散。而对于血管网系统和肝细胞孔洞在同一模板上的肝组织工程支架，卷裹后肝细胞和血管内皮细胞分别种植在各自的微结构内，不会相互迁移，所以就没有半通透膜的制造过程。
微制造工艺按包括以下步骤(1)模拟自然肝脏的内部微结构，进行肝脏血管网系统、肝细胞孔洞结构和半通透膜的仿生设计，构建肝组织工程仿生支架CAD模型；(2)将上述组织工程仿生支架CAD模型转化为快速成型文件格式，利用快速成型技术制备血管网系统和肝细胞孔洞结构的树脂模具；(3)将仿生设计的半通透膜，利用平板印刷技术制造光掩膜，运用掩膜光固化工艺制造小于5μm孔洞的半通透膜树脂模具；(4)将血管网系统和肝细胞孔洞结构的树脂模具，通过微复型工艺翻制为硅橡胶模具；(5)将生物相容性和生物降解特性的生物材料涂敷于硅橡胶模具上，脱模后实现具有血管网系统和肝细胞孔洞的肝支架模板的微制造；(6)将半通透膜的树脂模具，运用微压印工艺在生物材料上压印出含有微小孔洞的半通透膜；(7)对于血管网系统和肝细胞孔洞结构在同一模板上的支架，直接卷裹即可得三维形态得肝组织工程支架；对于血管网系统和肝细胞孔洞结构不在同一模板上得支架，须按血管网系统支架一半通透膜—肝细胞孔洞结构支架得顺序组装，然后卷裹得到立体结构得肝组织工程支架；(8)将卷裹得到肝组织工程支架浸入蒸馏水中使其充分吸水，然后采用冷冻干燥工艺即可得到的高孔隙化肝组织工程支架。
本发明提出的制造工艺得到的三维肝组织工程支架，将肝组织工程支架复杂的三维制造问题转化为简单的二维制造，简便易行，同时，将制造成孔(血管网系统和肝细胞孔洞)与相分离致孔相结合，既可实现细胞在支架内的可控分布，又能保证支架具有最大的物质交换能力(多孔化结构)。能实现不同种类的细胞在支架内部可控而有序的分布，高孔隙结构使支架具有最大的物质交换能力，有利于营养物质的摄取和代谢废物的排出，可为肝细胞的生长繁殖提供最佳的外部环境，加快肝组织的形成。随着支架材料的降解，支架内部血管网系统和肝组织逐渐形成，实现人工肝向自然肝的转化即肝组织的工程化制造奠定基础，从而可以解决肝移植手术中供需的矛盾。同时，对于不同的肝病患者，可以提取他们自己的血管内皮细胞和健康的肝细胞与立体肝组织支架复合后进行体外培养，从而可实现肝组织的定制化制造。
图1为血管网系统与肝细胞孔洞复合的肝支架模板结构示意图；图2为孔洞分离结构示意图；图3为半通透膜结构示意图；图4为血管网系统结构示意图；图5为立体肝组织工程支架的卷裹工艺示意图；图6为使肝支架高孔隙化的冷冻干燥工艺示意图。
以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细描述。
具体实施例方式
参见附图，按照本发明的制造工艺，首先模拟自然肝组织的微结构，进行包含血管网系统和肝细胞孔洞微结构的肝组织工程支架模板的仿生设计。将设计好的肝组织工程支架模板的CAD模型转换成快速成型文件格式，用快速成型技术制备树脂模具；用该树脂模具通过微复型工艺制备含有肝细胞孔洞和血管网微结构的硅橡胶模具；对于半通透膜，可首先利用影印石板技术制造含有细微孔洞结构的掩膜，通过掩膜光固化工艺或光刻工艺成型压印模具；将具有良好生物相容性和生物降解特性的生物材料涂敷于模具上，脱模后实现具有血管网系统和肝细胞孔洞的生物可降解的肝支架模板的制造。
图1为血管网2与肝细胞孔洞1复合的肝组织工程支架模板，图2，图3和图4为分别为肝细胞孔洞，半通透膜和血管网分离的肝组织工程支架模板，卷裹前，须在显微镜下将肝细胞孔洞结构，半通透膜和血管网结构用具有良好生物相容性和生物可降解性的生物医用胶粘结组合在一起。在肝组织工程支架模板的一表面上涂敷生物医用胶，然后按图5的方式卷裹成内含多种微结构的立体肝支架。
在图6中，将卷裹好的立体肝组织工程支架浸入蒸馏水中充分吸水，然后放入低温环境(＜-20℃)将其中的液态水冷冻为细小的冰晶粒，通过冷冻干燥工艺将其中的冰晶粒升华，在立体肝组织工程支架中留下细微的孔洞结构，即实现肝组织工程支架的高孔隙化。微孔洞结构的尺度可以通过调整低温环境的温度来控制。对于血管网和肝细胞孔洞复合的肝组织工程支架，这些微孔洞结构可以起到半通透膜的作用。
利用该高孔隙的肝支架在体外构建肝组织时，将具有锚着性的肝细胞种植在肝细胞孔洞结构中，将血管内皮细胞种植于血管网结构中；然后放入生物反应器中进行细胞培养。培养液流过血管网，将营养物质和氧气通过微孔洞结构运输到肝细胞孔洞供肝细胞生长和繁殖，同时将肝细胞代谢的有毒物质带走，给肝细胞提供一个有利的生存环境。随着生物可降解材料的降解，新的血管网和肝组织生成，从而实现人工肝组织的工程化制造。
权利要求
1.一种卷裹型肝组织工程支架的制造工艺，其特征在于，该工艺包括以下步骤(1)模拟自然肝脏的内部微结构，进行肝脏血管网系统、肝细胞孔洞结构和半通透膜的仿生设计，构建肝组织工程仿生支架CAD模型；(2)将上述组织工程仿生支架CAD模型转化为快速成型文件格式，利用快速成型技术制备血管网系统和肝细胞孔洞结构的树脂模具；(3)将仿生设计的半通透膜，利用平板印刷技术制造光掩膜，运用掩膜光固化工艺制造小于5μm孔洞的半通透膜树脂模具；(4)将含有血管网系统和肝细胞孔洞结构的树脂模具，通过微复型工艺翻制为硅橡胶模具；(5)将生物相容性和生物降解特性的生物材料涂敷于硅橡胶模具上，脱模后实现具有血管网系统和肝细胞孔洞的肝支架模板的制造；(6)将半通透膜的树脂模具，运用微压印工艺在生物材料上压印出含有微小孔洞的半通透膜；(7)对于血管网系统和肝细胞孔洞结构在同一模板上的支架，直接卷裹即可得三维形态得肝组织工程支架；对于血管网系统和肝细胞孔洞结构不在同一模板上得支架，须按血管网系统支架—半通透膜—肝细胞孔洞结构支架的顺序组装，然后卷裹得到立体结构的肝组织工程支架；(8)将卷裹得到的肝组织工程支架浸入蒸馏水中使其充分吸水，然后采用冷冻干燥工艺即可得到的高孔隙化肝组织工程支架。
2.如权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述的模拟自然肝脏的内部微结构是将自然肝组织微结构简化为包含血管网系统，肝细胞孔洞和半通透膜的多孔结构，肝细胞孔洞为阶梯状结构，保证最大的细胞粘附表面积；血管网管道尺度在100-200μm之间，肝细胞孔洞尺度在200-300μm之间，半通透膜上的小于5μm的孔洞尺度只允许营养物质，氧气和代谢废物通过，而对肝细胞和血小板有阻隔作用。
3.如权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述的立体肝组织工程支架的制作方法是，将平面型的肝组织工程支架模板背面涂敷可降解的生物胶，然后层层卷裹粘结，并保证血管网系统的完全导通和血管网系统和肝细胞孔洞在立体支架内部的均匀分布。
4.如权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述的冷冻干燥工艺是将充分吸水的立体肝组织工程支架放入低于-20℃的低温环境中预冷，使液态水快速冷冻为细小的冰晶粒，通过控制冷却温度来控制冰晶粒大小的均匀性；再将预冻后的肝组织工程支架放入冷冻干燥设备干燥，将其中的冰晶粒升华，即可在立体肝组织工程支架中留下均匀分布的具有半通透功能的细微孔洞结构，通过降低低温环境的温度，能够获得更小尺度的微孔洞结构。
全文摘要
本发明公开了一种卷裹型肝组织工程支架的制造工艺，首先根据自然肝组织的内部微结构，进行肝组织工程支架血管网系统和肝细胞孔洞的仿生设计；利用快速成型微复型工艺制造仿生肝组织工程支架的硅橡胶模具；将具有良好生物相容性和生物降解特性的生物材料涂敷在硅橡胶模具上，脱模后将肝组织工程支架模板卷裹，实现肝组织工程支架的立体化，并将立体化的肝组织工程支架润湿，吸水，冷冻干燥得到高孔隙化的立体肝组织工程支架。体外培养时，将血管内皮细胞种于血管网系统，将肝细胞种于肝细胞孔洞，随着立体肝组织工程支架的降解，血管内皮细胞形成血管，肝细胞繁殖并团聚生长形成肝组织，为实现人工肝向自然肝的转化奠定基础。
文档编号B01D71/00GK1768718SQ20051009604
公开日2006年5月10日 申请日期2005年9月19日 优先权日2005年9月19日
发明者李涤尘, 贺健康, 刘亚雄, 卢秉恒 申请人:西安交通大学