专利名称：用于治疗内毒素血症的内毒素吸附材料的制作方法
技术领域：
本发明属于生物分离和生物医学工程领域，特别涉及到一种用于治疗内毒素血症的内毒 素吸附材料及其制备方法。
背景技术：
内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁的成分之一，是一种脂多糖和微量蛋白复合物。内毒素血 症是由于血液中细菌或病灶内细菌释放出大量细菌内毒素至血液，或输入大量内毒素污染的 液体而引起的一种病症。内毒素进入血液后引起一系列反应，最终导致器官坏死，不可逆休 克和死亡。据报告，美国每年约有十万病人死于革兰氏阴性菌感染，临床尚无有效的治疗方法。目前许多药物已用于内毒素血症的治疗。抗菌素在治疗感染性疾病中发挥着重要作用， 但若用于治疗内毒素血症，可使内毒素水平升高8倍。抗炎症因子类，抗内毒素单克隆抗体 类，抗肿瘤坏死因子(TNF)单克隆抗体类，这些药物价格昂贵以及可能引起过敏反应，在临 床上使用受限。由于内毒素常以大分子聚合物形式存在，分子量约为106D，细胞因子分子量 约为12-17kD，常规的血液透析及腹膜透析疗法对排除内毒素、细胞因子无效。血液净化疗法对一些重大疑难性病症有着独特疗效，是临床不可缺少的重要手段，许多 吸附材料已应用于血液净化，从而除去血液中的有毒成份或致病物质，达到净化血液，缓解 和治疗疾病的目的，如活性碳，大孔树脂等。但活性碳、大孔树脂对内毒素没有吸附选择性， 在去除内毒素的同时也去除了血液中不少蛋白质，且血液相容性很差，效果也不明显。固定 化多粘菌素B (Polymyxin B)凝胶虽有着较强的内毒素吸附力，但蛋白损失量也是很明显的， 其价格昂贵，且配基脱落后具有神经毒性和肾毒性，因此并不适合从静脉注射液中去除内毒 素(中国专利，200410024717.6)。免疫吸附材料虽不影响血液中其它成分的水平，清除效 率高，但抗体的来源、制备纯化等非常困难，且价格昂贵，当抗体游离出材料表面，会引起 一系列免疫反应。为解决现有吸附材料存在的问题，应主要从以下两方面入手(1)分析内毒素的结构特 点以及与其它分子可能存在的相互作用方式，通过一定的合成手段，使吸附材料对内毒素具
有多种作用方式，从而具有较高的选择性；(2)采用廉价、易得的基质和化合物合成吸附剂， 从而降低成本。发明内容本发明的目的是要解决现有内毒素吸附材料存在的不足(1)吸附能力较弱，选择性较 低；(2)制备成本较高，并提供一种价格低廉，对内毒素具有较高选择性和较大吸附能力的 吸附材料及其制备方法。本发明的构思是(1)内毒素分子类脂A部分含有脂肪链，能够与疏水基团产生吸附作 用；(2)内毒素分子类脂A部分含有磷酸基团，pKa为1.4，生理条件下带负电，可以与阳离 子基团产生吸附作用；(3)半胱氨酸分子含有氨基、羧基、巯基三个活性基团，作为间隔臂 末端分子可同时偶联疏水、阳离子两种基团，通过两种基团与内毒素的吸附作用，实现提高 吸附剂对内毒素的吸附量和选择性，减少对血液中其它有益成分非特异性吸附的目的。本发明的技术方案是-一种用于治疗内毒素血症的内毒素吸附材料，其特征在于内毒素吸附材料的组成包括载 体和功能基，以及连接载体和功能基的间隔臂分子三部分，其分子结构示意如下CH2CHCH2—N: OH其中黑色圆球表示琼脂糖凝胶；载体为表面含有羟基的琼脂糖凝胶；间隔臂分子末端含有氨基和羧基两个不同的官能团； 功能基由季胺盐阳离子和疏水分子两个基团组成。 所述间隔臂末端分子为半胱氨酸。所述功能基团的季胺盐阳离子为2， 3-环氧丙基三甲基氯化铵；所述功能基团的疏水分 子为磺胺甲氧哒嗪。所述内毒素吸附材料的制备方法，其特征在于该方法包括活化、偶联间隔臂、偶联功能 基三个步骤第一步琼脂糖凝胶的活化反应将琼脂糖凝胶分散于同体积的丙酮中，加入N，N'羰基二咪唑作偶联剂，用量为偶联剂琼脂糖为1:5-10 (w/v)， 20-4(TC下震荡反应1-2小时。反应结束后抽滤，并用丙酮反复冲
洗，将残留的偶联剂冲洗掉，即得活化了的琼脂糖凝胶。 第二步偶联间隔臂将第一步所得活化了的琼脂糖凝胶分散于相同体积的丙酮中，加入3, 3' -二氨丙基亚胺， 用量为3，3'-二氨丙基亚胺琼脂糖的体积比为1:5-10， 20-40'C下震荡反应2-3小时。反应 结束后抽滤，用去离子水冲洗，然后置于相同琼脂糖凝胶体积的pH 3.9， 2-(N-吗啉基)乙磺 酸水溶液中，加入溴乙酸，用量为溴乙酸琼脂糖为1.0-1.2:10 (w/v)，调pH4.5-7.5，加 入1_(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐作縮合剂，加入量为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐琼脂糖为0.6-0.8:10 (w/v)， 20-40'C， 150转/分钟的摇床中反应2_4 小时。反应结束后抽滤，使用大量去离子水冲洗凝胶；将该凝胶置于相同体积0.1M ， pH8.0 的磷酸缓冲液中，加入半胱氨酸，加入量为半胱氨酸琼脂糖为1.0-1.5:10(w/v), 20-40°C， 150转/分钟的摇床中反应2-4小时。反应完毕后抽滤，用去离子水反复冲洗凝胶，即得偶联 了间隔臂的载体。第三步偶联功能基首先用琼脂糖凝胶表面半胱氨酸的氨基与2， 3-环氧丙基三甲基氯化铵反应。将偶联了 半胱氨酸的琼脂糖凝胶置于相同体积的去离子水中，加入2， 3-环氧丙基三甲基氯化铵，加 入量为2， 3-环氧丙基三甲基氯化铵琼脂糖为1.0-1.3:10 (w/v)， 30-70。C下振荡反应2_3 小时。反应结束后抽滤，并用去离子水反复清洗，得偶联了 2， 3-环氧丙基三甲基氯化铵的 琼脂糖凝胶。进一步用琼脂糖凝胶表面半胱氨酸的羧基与磺胺甲氧哒嗪反应。将偶联了 2， 3-环氧丙 基三甲基氯化铵的琼脂糖凝胶分散到相同体积N,N-二甲基甲酰胺中，加入磺胺甲氧哒嗪，加 入量为磺胺甲氧哒嗪琼脂糖为0.8-1.2:10 (w/v)，加入1-羟基苯并三唑、苯并三氮唑 -N,N，N',N'-四甲基脲六氟磷酸、二异丙基乙胺作縮合剂，加入量分别为l-羟基苯并三唑 琼脂糖为0.2-0.4:10 (w/v)，苯并三氮唑-N， N， N', N'-四甲基脲六氟磷酸琼脂糖为 0.4-0.6:10 (w/v)， 二异丙基乙胺琼脂糖的体积比为0. 2-0. 4:10，温度20-40°C, 150转/ 分的摇床中反应12-14小时。反应完毕后抽滤，依次用DMF和去离子水清洗凝胶，即得目标 吸附剂。所述的内毒素吸附材料的用途，其特征在于吸附材料经除菌、除热源处理后，在室温下， 将吸附材料装入灌流柱，含内毒素的血浆以10ml/min的流速灌流2-3小时；或将吸附材料加 入到含内毒素的血浆中，静态吸附2-3小时；其中吸附材料:血浆的体积比为1:3-10。选择此技术方案的原因是
琼脂糖凝胶亲水性强，理化性质稳定，不受细菌和酶的作用，具有疏松的网状结构，活 化后性质稳定，可用来作为吸附材料的载体。内毒素内毒素类脂A部分同时含有磷酸基团和 脂肪链，能够与阳离子基团和疏水基团产生吸附作用。间隔臂的末端分子为半胱氨酸，含氨 基、羧基和巯基三个官能团，通过化学反应可同时偶联疏水、阳离子两种基团。吸附材料与血浆体积比为1:3-10，此比例过小则血浆中的内毒素去除率不高，此比例过 大则吸附材料没有达到吸附饱和，浪费了吸附材料。本发明的主要优点是(1) 由于使用了琼脂糖凝胶为载体，因此吸附材料理化性质稳定，且具有较好的血液相 容性。琼脂糖凝胶具有大量可利用的官能团，可提高配基的固定化密度。(2) 由于间隔臂分子末端含有氨基和羧基两个官能团，因此可将两种与内毒素相互作用的基团阳离子基团和疏水基团同时偶联到载体表面，从而提高了吸附材料对内毒素的吸附选择性。(3) 由于所涉及到的参与化学反应的分子来源广泛廉价，反应条件温和，因此吸附材料 制作成本低廉。附表说明表1是人血浆中的主要蛋白质和内毒素浓度在吸附前后的变化。取含内毒素的人血浆进行体外的模拟治疗实验。吸附条件为取2ml吸附材料装入层析柱，恒流泵控制流速10ml/min， 用10ml含内毒素的人血浆室温灌流2小时，取上清测各成分浓度。表中列出了吸附前后血浆 中内毒素、白蛋白、球蛋白、总蛋白浓度，以及各成分的去除率。数据表明该吸附材料对人 血浆中的内毒素有着较高的去除率，但对总蛋白的去除率较低，低于7%。表2是血浆中内毒素的清除率与吸附材料体积的关系，分别取吸附材料lml、 1. 5ml、 3ml、 5ml置于50ml带塞三角瓶，各加入15ml内毒素初浓度为5. 08EU/ml血浆，37°C, 150转/分 钟的摇床中震荡2.5小时，分别测上清液中内毒素浓度，计算对内毒素的清除率。数据表明 在一定血浆体系下，吸附材料用量对内毒素去除率有着较大的影响。
具体实施方式
实施例l:吸附材料的制备第一步琼脂糖凝胶的活化反应
取琼脂糖凝胶100mL，用去离子水抽滤4-5次除去凝胶中的防腐剂，依次以5倍凝胶体 积的30%、 70%、 100% (v/v)的丙酮水溶液清洗凝胶，然后把洗好的凝胶置于100ml丙酮中， 加入10g N，N'羰基二咪唑(CDI)，在3(TC、 150转/分钟摇床中反应2小时。反应结束后抽 滤，用5倍凝胶体积的丙酮反复清洗已活化的凝胶，得活化了的琼脂糖凝胶。第二步偶联间隔臂将100ml活化了的琼脂糖凝胶置于100ml的丙酮中，加入10mL的双氨基试剂(二氨基二 丙基亚胺)，在30'C， 150转/分的摇床中反应2小时。反应结束后抽滤，用5倍凝胶体积的 去离子水反复清洗反应后的凝胶，然后置于100m12-(N-吗啉基)乙磺酸水溶液(pH3.9)中， 加入12g溴乙酸，调pH 4. 5，加入6g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC HC1) 作縮合剂，在30'C， 150转/分钟的摇床中反应2小时。反应完毕后抽滤，用5倍凝胶体积的 去离子水冲洗凝胶；将该凝胶置于100ml O.IM磷酸缓冲液中(pH8.0)，加入10g半胱氨酸， 3(TC， 150转/分钟的摇床中反应2小时。反应完毕后抽滤，用5倍凝胶体积的去离子水冲洗 凝胶，即得偶联了间隔臂的载体。第三步偶联功能基首先用琼脂糖凝胶表面半胱氨酸的氨基与2， 3-环氧丙基三甲基氯化铵反应。将100ml 偶联了半胱氨酸的琼脂糖凝胶置于100ml的去离子水中，加入13g 2， 3-环氧丙基三甲基氯 化铵，70。C下搅拌反应3小时。反应结束后，过滤出载体，并用5倍凝胶体积的去离子水反 复清洗，得偶联了2， 3-环氧丙基三甲基氯化铵的琼脂糖凝胶。进一步用琼脂糖凝胶表面半胱氨酸的羧基与磺胺甲氧哒嗪反应。将100ml偶联了 2， 3-环氧丙基三甲基氯化铵的琼脂糖凝胶分散到100ml N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，加入9g磺 胺甲氧哒嗪，加入2g 1-羟基苯并三唑(HOBt)， 4g苯并三氮唑-N,N,N，，N'-四甲基脲六氟磷 酸(HBTU) ， 2ml二异丙基乙胺(DIEA)作縮合剂，在温度30°C, 150转/分的摇床中反应14 小时。反应完毕后抽滤，依次用DMF和去离子水清洗凝胶，即得目标吸附剂。实施例2:吸附材料、器皿的去热源处理实验所接触到的玻璃仪器于300'C干烤3小时去除热源。塑料器皿于30%仏02过夜浸泡， 然后用无热源水冲洗，晾干。所制备的吸附材料首先在1.5M NaOH溶液中过夜浸泡，然后置 于灌流柱，经0.2M NaOH(含20y。乙醇)2ml/min淋洗1小时，最后分别用生理盐水、无热源 水淋洗以2ml/min淋洗l小时，即得除菌、除热源的吸附材料。 实施例3:动态吸附去除人血浆体系中的内毒素.取2ml吸附材料装入层析柱，室温下恒流泵控制流速10ml/min，用10ml含内毒素的人 血浆灌流2小时，取上清测各成分浓度。(表l)实施例4:静态吸附去除人血浆体系中的内毒素分别取吸附材料lml、 1.5ml、 3ml、 5ml，各加入15ml内毒素初浓度为5. 08EU/ml血浆， 在37t:， 150转/分钟的摇床中震荡2.5小时，静置，测上清液中内毒素浓度，计算对内毒素 的清除率。附表表l:人血浆中的内毒素和主要蛋白质浓度在fe附前后的变化吸附前 吸附后 吸附率(%) 白蛋白 37.4g/L 34. lg/L 8.83 球蛋白20.5g/L 20g/L 2.44 总蛋白57.9g/L 5 4. lg/L 6.57内毒素5.08EU/ml 2.22EU/ml 56.31表2:血浆中内毒素的清除率与吸附材料体积的关系吸附材料 吸附后内毒素浓度 吸附率体积 (EU/ml) (%)lml 3.03 40.291.5ml 2.69 46.993ml 2. 18 57.095ml1.70 66.509
权利要求
1.一种用于治疗内毒素血症的内毒素吸附材料，其特征在于内毒素吸附材料的组成包括载体和功能基，以及连接载体和功能基的间隔臂分子三部分，其分子结构示意如下其中黑色圆球表示琼脂糖凝胶；载体为表面含有羟基的琼脂糖凝胶；间隔臂分子末端含有氨基和羧基两个不同的官能团；功能基由季胺盐阳离子和疏水分子两个基团组成。
1. 一种用于治疗内毒素血症的内毒素吸附材料，其特征在于内毒素吸附材料的组成包括 载体和功能基，以及连接载体和功能基的间隔臂分子三部分，其分子结构示意如下OH其中黑色圆球表示琼脂糖凝胶；载体为表面含有羟基的琼脂糖凝胶；间隔臂分子末端含有氨基和羧基两个不同的官能团； 功能基由季胺盐阳离子和疏水分子两个基团组成。
2. 根据权利要求1所述的内毒素吸附材料，其特征在于所述间隔臂末端分子为半胱氨酸。
3. 根据权利要求1所述的内毒素吸附材料，其特征在于所述功能基团的季胺盐阳离子为 2， 3-环氧丙基三甲基氯化铵；所述功能基团的疏水分子为磺胺甲氧哒嗪。
4. 如权利要求l所述的内毒素吸附材料的制备方法，其特征在于该方法包括活化、偶联 间隔臂、偶联功能基三个步骤-第一步琼脂糖凝胶的活化反应将琼脂糖凝胶分散于同体积的丙酮中，加入N,N'羰基二咪唑作偶联剂，用量为偶联剂 琼脂糖为1:5-10 (w/v)， 20-4CTC下震荡反应1-2小时；反应结束后抽滤，并用丙酮反复冲 洗，将残留的偶联剂冲洗掉，即得活化了的琼脂糖凝胶；第二步偶联间隔臂将第一步所得活化了的琼脂糖凝胶分散于相同体积的丙酮中，加入3， 3' -二氮丙基亚胺， 用量为3,3'-二氨丙基亚胺琼脂糖的体积比为1:5-10， 20-40'C下震荡反应2-3小时；反应 结束后抽滤，用去离子水冲洗，然后置于相同琼脂糖凝胶体积的pH 3.9， 2-(N-吗啉基)乙磺 酸水溶液中，加入溴乙酸，用量为溴乙酸琼脂糖为1.0-1.2:10 (w/v)，调pH4.5-7.5，加 入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐作縮合剂，加入量为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐琼脂糖为0. 6-0. 8:10 (w/v)， 20-40'C， 150转/分钟的摇床中反应2-4 小时；反应结束后抽滤，使用大量去离子水冲洗凝胶；将该凝胶置于相同体积O. 1M ， pH8.0的磷酸缓冲液中，加入半胱氨酸，加入量为半胱氨酸琼脂糖为1.0-1.5:10 (w/v), 20-40 °C， 150转/分钟的摇床中反应2-4小时；反应完毕后抽滤，用去离子水反复冲洗凝胶，即得 偶联了间隔臂的载体； 第三步偶联功能基首先用琼脂糖凝胶表面半胱氨酸的氨基与2， 3-环氧丙基三甲基氯化铵反应；将偶联了 半胱氨酸的琼脂糖凝胶置于相同体积的去离子水中，加入2， 3-环氧丙基三甲基氯化铵，加 入量为2， 3-环氧丙基三甲基氯化铵琼脂糖为1.0-1.3:10 (w/v)， 30-70。C下振荡反应2-3 小时；反应结束后抽滤，并用去离子水反复清洗，得偶联了 2, 3-环氧丙基三甲基氯化铵的 琼脂糖凝胶；进一步用琼脂糖凝胶表面半胱氨酸的羧基与磺胺甲氧哒嗪反应；将偶联了 2， 3-环氧丙 基三甲基氯化铵的琼脂糖凝胶分散到相同体积N，N-二甲基甲酰胺中，加入磺胺甲氧哒嗪，加 入量为磺胺甲氧哒嗪琼脂糖为0.8-1.2:10 (w/v)，加入1-羟基苯并三唑、苯并三氮唑 -N，N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸、二异丙基乙胺作縮合剂，加入量分别为l-羟基苯并三唑 琼脂糖为0.2-0.4:10 (w/v)，苯并三氮唑-N， N, N'， N'-四甲基脲六氟磷酸琼脂糖为 0.4-0.6:10 (w/v)， 二异丙基乙胺琼脂糖的体积比为0. 2-0. 4:10，温度20-40°C, 150转/ 分的摇床中反应12-14小时；反应完毕后抽滤，依次用DMF和去离子水清洗凝胶，即得目标 吸附剂。
5.如权利要求l所述的内毒素吸附材料的用途，其特征在于吸附材料经除菌、除热源处 理后，在室温下，将吸附材料装入灌流柱，含内毒素的血浆以10ml/min的流速灌流2-3小时； 或将吸附材料加入到含内毒素的血浆中，静态吸附2-3小时；其中吸附材料:血浆的体积比为 1:3-10。
全文摘要
本发明涉及生物分离和生物医学工程领域中，用于治疗内毒素血症的内毒素吸附材料。该吸附材料是以琼脂糖凝胶为载体，经活化反应偶联间隔臂分子，然后偶联季胺盐阳离子和疏水分子两个基团作为功能基制得。本吸附材料同时偶联两类与内毒素相互作用的基团，从而提高了吸附材料对内毒素的吸附选择性。吸附材料理化性质稳定，且具有较好的血液相容性，可用来清除血浆中的内毒素，从而治疗内毒素血症。吸附材料制备过程简便、制作成本低廉，属于新型内毒素吸附材料。
文档编号B01J20/22GK101157018SQ20071001250
公开日2008年4月9日 申请日期2007年8月17日 优先权日2007年8月17日
发明者张小锐, 贾凌云 申请人:大连理工大学