用于用试剂使生物样品脉动和稳定如此脉动的样品的装置、试剂盒和方法

专利名称：：用于用试剂使生物样品脉动和稳定如此脉动的样品的装置、试剂盒和方法用于用试剂使生物样品脉动和稳定如此脉动的样品的装置、试剂盒和方法发明领域本发明涉及用于诊断测定中的装置、方法和试剂盒，并且应用于免疫学领域中。介绍监测核酸水平，例如，mRNA水平在直接确定一种试剂对生物系统的作用时是有价值的。例如，如果一种试剂被引入至生物系统中持续规定长度的时间，则该系统与该试剂的反应可以通过测量mRNA的水平来确定。这可以有效用于监测免疫性，其中，例如，该试剂是抗原且被监测的mRNA为细胞因子mRNA，例如，白介素。通过从个体中抽血并且将在较晚的时间点及时加入试剂来测试该试剂的效果在血液离开循环和用该试剂刺激之间引入了可变的延迟。在该延迟期间，血液可能经历缓慢或快速的化学改性，例如，取决于保留其的温度。此外，延迟是可变的意味着在连续抽取的样品之间的对比研究是无效的。当测试核酸时，主要的挑战归因于RNA在体外的不稳定性，尤其是在存在检测低水平RNA或不稳定RNA的要求时。即使仅一小部分RNA的降解也可能改变对RNA水平的解释。一些转录物已知以低拷贝存在于细胞中；其他转录物在其3'端中具有"富AU"序列，促进其被内源性RNA酶快速降解。研究已经显示在样品采集后数小时内RNA迅速显著降解。此外，一旦样品采集后，某些种类的RNA通过基因诱导的过程而增加。RNA降解和体外基因诱导两者均可导致体内基因转录物数目的低估或高估。因此，当测量一种试剂对抽出的血液的作用时，本领域中存在的挑战是管理mRNA降解的过程，该过程在血液被抽出后立刻就开始了，并且在引入抗原后重新开始。因为“之前的”降解可以对“之后”的降解产生影响，因此误差与两个过程都有关；因此，误差的可能性更大并且误差更加难以阐明。本领域中的另一个问题是在进行生物样品暴露于试剂及随后进行其核酸分析时必需使用数种设备。典型地，至少需要试剂瓶、精密吸移管、冷藏设备来进行定量测量。如果在缺少合适的实验室设施的条件下获取样品，例如，在个体的家庭中或在基本装备的手术室中，则不适合于或便于进行精确的底物添加，并且此外可能没有冷藏设施可用。一旦样品已经暴露于试剂，存在许多方法来分离和测量其中的核酸，例如，mRNA。一些方法甚至允许在转录物混合物中确定低水平的转录物。然而，这些方法中没有一种提供在采样时确定生物样品中存在的一种或多种转录物的水平的可能性。即使在冷藏条件下，生物样品的保存导致不正确的mRNA水平。事实上，在实践中，由于采样的场所和RNA分析的场所位于不同的地方，因此分析新鲜样品是不可行的。近年来，PreAnalytiX(BectonDickinson和Qiagen的合资企业)生产了PAXgene血液RNA系统。该PAXgene血液RNA系统(也称为Qiagen法)是一种用于采集和稳定化全血标本和分离细胞RNA的综合标准化系统。根据I^reAnalytiX，在PAXgene血液RNA系统中，血液直接采集进PAXgene血液RNA管中，并且随后使用PAXgene血液RNA试剂盒分离RNA。使用该系统，可以从全血中获取完整的细胞RNA。PAXgene血液RNA管是一种用于采集全血并稳定细胞RNA谱(profile)的塑料真空管(evacuatedtube)。该管装有稳定细胞RNA的添加剂(一种具有专利权的试剂共混物)，可以消除基因转录物的离体诱导并防止正常在体外条件下所发生的细胞RNA表达谱的剧烈变化。然后使用由PAXgene血液RNA试剂盒中提供的硅胶膜技术分离RNA。根据PreAnalytiX，得到的RNA精确地代表了体内的表达谱并且适合用于一定范围的下游应用中。依照供应商的说法，使用此系统有可能精确地定量基因转录物。此PAXgene血液RNA系统的主要缺点是各个PAXgene血液RNA管需要与PAXgene血液RNA试剂盒组合在一起(参见PAXgene血液RNA管的说明书指南)。然而，这种强制性组合限制了该系统的进一步改进。更近期，已经开发了Tempus血液RNA管(应用生物系统(AppliedBiosystems))，其类似地是一种塑料真空管，用于采集全血和稳定化细胞RNA谱。每个管装有稳定细胞RNA的添加剂(一种具有专利权的试剂共混物)，可以消除基因转录物的离体诱导并防止正常在体外条件下所发生的细胞RNA表达谱的剧烈变化。发明目的本发明的一个目的是提供用于使生物样品暴露于试剂并且稳定如此暴露的样品中的核酸的装置、试剂盒和方法。本发明的一个目的是提供用于使生物样品暴露于试剂，稳定如此暴露的样品中的核酸的装置、试剂盒和方法，所述装置、试剂盒和方法也提供对照反应。本发明的另一个目的是提供将获得生物样品和使所述样品暴露于试剂之间的时间缩短，保持恒定或保持几乎恒定的装置、试剂盒和方法。本发明的另一个目的是提供将使样品暴露于试剂和稳定所述样品中的核酸的时间缩短，保持恒定或保持几乎恒定的装置、试剂盒和方法。本发明的另一个目的是提供在无需测量样品和/或试剂的量的条件下使试剂暴露于样品的装置、试剂盒和方法。本发明的另一个目的是提供使试剂和对照暴露于样品，并使所述样品和对照暴露于试剂和稳定所述样品中的核酸的时间保持恒定或保持几乎保持恒定的单个装置。本发明的另一个目的是提供在无需测量稳定剂的量的条件下使试剂暴露于样品的装置、试剂盒和方法。本发明的另一个目的是提供用于使生物样品暴露于试剂，稳定如此暴露的样品中的核酸并从中提取核酸用于进一步分析的装置、试剂盒和方法。本发明的另一个目的是提供用于使生物样品暴露于试剂，稳定如此暴露的样品中的核酸的装置，所述装置还提供对照反应并有助于机器人自动化。本发明的另一个目的是提供解决一种或多种上述目的的组合的装置、试剂盒和方法。发明概述本发明的一个实施方案是一种用于测定液体生物样品的试剂盒，其包括适合于容纳液体生物样品，使所述样品暴露于第一物质和随后暴露于核酸稳定剂的器皿，所述器皿包括a)存在于所述器皿内部的第一物质，b)其中存在有所述稳定剂的容器，c)所述器皿内部和所述容器内部之间的连接，d)临时阻断所述连接的物理屏障；和适合于容纳液体生物样品，使所述样品暴露于对照物质和随后暴露于核酸稳定剂的对照器皿，所述对照器皿包括a)存在于所述对照器皿内部的对照物质，b)其中存在有所述稳定剂的对照容器，c)所述对照器皿内部和所述对照容器内部之间的连接，d)临时阻断所述连接的物理屏障。本发明的另一个实施方案是如上所述的试剂盒，其中所述第一物质固定在所述器皿的一部分或全部内表面上。本发明的另一个实施方案是如上所述的试剂盒，其中所述第一物质固定在固相载体上。本发明的另一个实施方案是如上所述的试剂盒，其中所述第一物质是液体。本发明的另一个实施方案是如上所述的试剂盒，其中所述第一物质是固体。本发明的另一个实施方案是如上所述的试剂盒，其中所述器皿和/或对照器皿包括一个或多个适合于通过注射器针穿透的区域。本发明的另一个实施方案是如上所述的试剂盒，其中所述区域是可再密封的隔膜。本发明的另一个实施方案是如上所述的试剂盒，其中所述器皿和/或对照器皿包括适合于接纳注射器和将其中的内容物传输至所述器皿或对照器皿的内部的配件。本发明的另一个实施方案是如上所述的试剂盒，其中所述器皿和/或对照器皿包括适合于接纳注射器针的配件。本发明的另一个实施方案是如上所述的试剂盒，其中所述器皿和/或对照器皿包括能够最小化来自器皿的气体流/液体流并且允许液体生物样品流进所述器皿中的阀门。本发明的另一个实施方案是如上所述的试剂盒，其中所述器皿和/或对照器皿包括一种设备，通过所述设备可以排出被置换的气体。本发明的另一个实施方案是如上所述的试剂盒，其中所述器皿和/或对照器皿保持在负压下。本发明的另一个实施方案是如上所述的试剂盒，其中通过向所述器皿或对照器皿施加物理力使项d)的物理屏障开启。本发明的另一个实施方案是如上所述的试剂盒，其中所述力将开启设备传送至所述物理屏障。本发明的另一个实施方案是如上所述的试剂盒，其中所述力不可逆地开启所述物理屏障。本发明的另一个实施方案是如上所述的试剂盒，其中所述器皿和/或对照器皿包括在其中分配已知体积的稳定剂分配的指示。本发明的另一个实施方案是如上所述的试剂盒，其中所述第一物质包括一种或多种免疫系统抗原。本发明的另一个实施方案是如上所述的试剂盒，其中所述免疫系统抗原是疫苗成分。本发明的另一个实施方案是如上所述的试剂盒，其中所述免疫系统抗原是激发超变应原反应(hyperallergenicresponse)的抗原。本发明的另一个实施方案是如上所述的试剂盒，其中所述免疫系统抗原是选自组织相容性抗原、细菌LPS、破伤风类毒素(tetanoustoxoid)、癌症免疫治疗抗原、MAGE-3、猫变应原、i^eldl、来自器官供体的抗原呈递细胞、自身抗原、GAD65中的一种或多种。本发明的另一个实施方案是如上所述的试剂盒，其中所述稳定剂是细胞RNA降解和/或基因诱导的抑制剂。本发明的另一个实施方案是如上所述的试剂盒，其中所述细胞RNA降解和/或基因诱导的抑制剂是存在于PAXgene或Tempus血液RNA管中的那些。本发明的另一个实施方案是如上所述的试剂盒，其中所述器皿和对照器皿的外部接合在一起以形成单个实体。本发明的另一个实施方案是用于液体生物样品的测定装置，其有助于使所述样品分别地暴露于第一物质和对照物质，并随后暴露于核酸稳定剂，所述装置包括-第一室，其中存在所述第一物质，-第二室，其中存在所述对照物质，-第三室，其中存在所述稳定剂，和-用于生物样品管的支架。本发明的另一个实施方案是如上所述的测定装置，其中所述室中的一个或多个被密封，并且包括一个或多个适合于通过空心针刺穿的区域。本发明的另一个实施方案是如上所述的测定装置，其中所述区域是可再密封的隔膜。本发明的另一个实施方案是如上所述的测定装置，还包括用于与传输管拆卸地连接的支架，所述传输管包括在任一端配置有空心针的空心柔性或刚性管，其适合于在任意两个室之间或在一个室和所述生物样品管之间传输液体。本发明的另一个实施方案是如上所述的测定装置，还包括如上面所定义的传输管。本发明的另一个实施方案是如上所述的测定装置，其中所述传输管的一根针与加压管的空心针以平行对齐方式连接，所述加压管包括一端配置有所述针的柔性空心管，并且适于向室或生物样品管施加真空或压力从而推动液体通过传输管。本发明的另一个实施方案是如上所述的测定装置，其中所述第一物质固定在所述第一器皿的一部分或全部内表面上。本发明的另一个实施方案是如上所述的测定装置，其中一个或多个所述室包括通气孔。本发明的另一个实施方案是如上所述的测定装置，其中所述第一和/或第二室保持在负压下。本发明的另一个实施方案是如上所述的测定装置，其中所述第一和/或第二室包括在其中分配已知体积的稳定剂分配的指示。本发明的另一个实施方案是如上所述的测定装置，其中所述第一物质如上面所定义。本发明的另一个实施方案是如上所述的测定装置，其中所述稳定剂如上面所定义。发明详述本发明的一个方面涉及适合于容纳生物样品的器皿，所述器皿容纳预定量的第一物质，所述第一物质可以是脉动剂(pulsingagent)0如本文使用的“脉动剂”包括生物样品可以对其暴露的任何物质。物质的实例包括肽、核酸、抗原。脉动剂可以包括所述物质外的其他成分，诸如稳定剂，指示剂，连接剂(linker)、基质等。术语“生物样品”是指包含核酸/生物剂的样品诸如临床(例如，细胞级分、全血、血浆、血清、尿、组织、细胞等)、农业、环境(例如，土壤、泥、矿物，水，空气)、食物(任何食物材料)、法庭或其他可能的样品。“全血”是指血液诸如其通过静脉采血采集，即，含有白细胞和红细胞、血小板、血浆和最后地传染原；传染原可以是病毒性、细菌性或寄生性的。临床样品可以来自人或动物来源。分析的样品的性质可以是固体或液体。很显然地，当使用固体材料时，它们首先溶解在合适的溶液中，所述溶液可以是由Qiagen销售的RNAIater试剂。根据本发明，此溶液不总是具有至少两种充分平衡的成分的真正“缓冲液”。其可以是强低渗溶液诸如单独的NaCl或提取溶液诸如含有醇。器皿(vessel)在本文中也称为反应器皿，可以以多种方式容纳脉动剂。根据本发明的一个方面，脉动剂可以固定在器皿的内壁上。器皿的内壁可以衬以使所述脉动剂能够附着的合适涂层。备选地，所述脉动剂可以直接附着在器皿的一部分或全部内壁上。适合于这样的附着的合适涂层、方法和器皿材料在本领域中是已知的。根据本发明的另一个方面，所述脉动剂作为固体存在。所述固体可以是粉末、冻干的小球、凝胶、膏状物。合适的固体组成和它们的制备方法在本领域中是已知的。根据本发明的另一个方面，所述脉动剂固定在固相载体上。固相载体可以附着在器皿的内部。备选地，固相载体可以脱离于器皿的内部。固相载体的实例包括但不限于，色谱基质，磁珠。根据本发明的另一个方面，脉动剂作为液体存在。合适的液体组成和它们的制备方法在本领域中是已知的。在实验室条件的范围外进行分析性脉动试验要求校准的测量设备诸如吸移管。由于未校准的测量装置引起的误差可以导致固有误差，并且分配时的人为误差也可以导致不同的样品之间的误差，这使得对比分析无效。提供供应有预定量的脉动剂的器皿消除了对另外的设备的需要，并且排除了人为测量误差。此外，提供独立的对照器皿允许对结果标准化，有助于检测误差。对照的使用是重要的，因为RNA—旦从循环中取出后是不稳定的并且快速降解。在使全血脉动中的不一致的延迟将导致无法对比的结果。在与脉动剂温育期间，根据试剂采用不同的(生物学)途径。本发明允许通过定量生物标志物的信使RNA来测量这种生物学过程，所述生物标志物诸如细胞因子、趋化因子、转录因子或代表特定过程的其他基因产物或替代标志物。在没有参考值的条件下，在测定中定量这些生物标志物几乎无意义；使用综合的对照允许快速地进行对照反应。通过比较测定和对照，生物标志物的量的意义和脉动剂对生物系统的影响。作为实例，公认Mxl基因处于I型IFN的控制下。我们利用了此知识，并且使用此基因产物作为替代标志物来测量I型IFN的疗效。在将全血与I型IFN—起温育后定量Mxl基因产物。Mxl基因产物的量可以表示为与标准化基因产物(即，其转录活性不受IFN的作用影响的基因)的mRNA拷贝数相比较的mRNA拷贝数。但在没有对照反应的条件下，此定量将毫无意义，所述对照反应是在未受刺激的对照条件(即，不含I型IFN的相同处理)下定量替代标志物。相同的原因可以适用于任何免疫反应。为了具有严格的对照，对照样品以相同的方式处理是很重要的，即，对照样品来自同一次提取，相同的温育时间和温度以及平行处理；在单个装置中测定和对照室的组合将使此变得可行。根据本发明的器皿的类型可以是适合于保存生物样品的任何类型。根据本发明的一个方面，将容纳脉动剂的器皿密封。根据本发明的一个方面，容纳脉动剂的器皿具有再密封设备诸如螺帽，推进式帽(push-oncap)，翻盖(flip-cap)0参见，例如，图5。根据本发明的一个方面，生物样品或其他流体可以通过使用注射器针刺穿至器皿壁中来引入器皿中。器皿的壁可以是在刺穿后可再密封的，或器皿的壁可以是在刺穿后不可再密封的，或器皿的壁可以配备有可再密封的区域诸如隔膜。参见，例如，图4。根据本发明的一个方面，生物样品或其他液体借助于传输管来引入，所述传输管包括在任一端配置有针的空心管(例如，套管针)。一根针被设定用于刺穿容纳样品的样品管或其他容器的隔膜，且另一根针被设定用于刺穿器皿的隔膜；使用针能够将生物样品从样品管传输至器皿。所述管可以是柔性的或刚性的。传输管的形状可以是U形的。参见，例如，图22。根据本发明的一个方面，生物样品可以借助于与器皿连接的用于接纳注射器或其他装配有联接设备的容器的一个或多个配件而引入至器皿中。例如，器皿可以装配有鲁尔(Luer)配件，所述鲁尔配件可以接纳无针注射器。参见例如，图3。在另一个实施例中，器皿可以装配有非鲁尔(non-Luer)配件，所述配件可以与具有互补的(reciprocating)非鲁尔联接设计的容器紧密配合。根据本发明的一个方面，生物样品可以借助于与所述器皿相适合的套管针或皮下注射器针而引入至器皿中，所述套管针或皮下注射器针适合于从个体直接抽取生物样品。参见，例如，图6。根据本发明的一个方面，生物样品可以通过开启再密封设备引入至器皿中。参见，例如，图5。如熟练技术人员已知的，将样品引入至密封器皿中将导致从中置换出等体积的空气或气体，或在其中积累的压力。因此，器皿可以配备有合适的设备以允许被置换的气体从所述器皿中排出，或提供压力的积累。所述设备在本领域中是已知的，且包括阀，防滴水孔(non-dripholes)，通气孔，带有覆盖物的通气孔(clothed-vents)，可扩张的器皿壁，所述器皿内负压的使用。参见，例如，图11上的箭头31。在本发明的一个方面，密封器皿内部的压力是负压。可以利用所述负压来释放在将生物样品引入至所述密封器皿时积累的压力。备选地，或另外地，负压可以处于预定水平并且可以用来允许引入固定体积的生物样品。根据本发明的另一个方面，器皿配备如上所述的可密封的隔膜，适于接纳第一针(套管针)和第二针，通过第一针液体生物样品可以进入至器皿中，通过第二针可以向器皿内部施加正压或负压。当通过第二针施加负压(真空)时，生物样品可以通过第一针被抽进器皿中。优选地，第一针是前面所述的传输管的一部分。第二针可以是下面所述的加压管的一部分，所述加压管与空气(抽出或加压)泵相连接。第一针和第二针可以以平行对齐的方式接合。参见，例如，图24。其中已经供应有预定量的脉动剂的器皿允许对个体进行诊断测试，无需使用用于量出所述抗原的设备。此外，当在实验室条件的范围外进行诊断测试时，污染和分配精确度的问题可能导致定量测定中的错误结果。如本文所述的器皿克服了这些问题。本发明的另一个方面是对照器皿，其可以是如上所述的器皿，区别在于其不容纳生物脉动剂以外，而容纳对照脉动剂(对照物质)。为了描述本本发明的目的，和如其他地方所提及的，如本文所述的器皿用来容纳脉动剂，且有时也称为“反应器皿”，而如本文所述的对照器皿用来容纳对照脉动剂。器皿和对照器皿独立地操作；它们独立地接收样品和稳定剂，且内部不相连接。然而，器皿和对照器皿可以一起存在作为试剂盒的一部分。备选地，器皿和对照器皿的外表面可以机械地连接以形成包括器皿和对照器皿两者的单个实体。根据本发明的一个方面，装有对照脉动剂的对照器皿被密封。对照器皿可以具有再密封设备诸如，例如，螺帽，推进式帽，翻盖。对照器皿可以具有易破的封条诸如剥开式粘性封条(peel-backadhesiveseal)，拉断式封条(snap-offseal)。根据本发明的一个方面，对照器皿的壁可以配备有可再密封的区域诸如隔膜，通过该区域可以通过使用注射器针刺穿将物质引入至对照器皿中。对照器皿的隔膜可以是在刺穿后可再密封的。根据本发明的一个方面，生物样品或其他液体借助于上述的传输管引入，所述传输管的任一端配置有针(例如，套管针)。一根针设定用来刺穿容纳样品管的管或其他容器的隔膜，且另一根针设定用来刺穿对照器皿的隔膜；使用所述针能够将液体生物样品从样品管转移至对照器皿。所述管可以是柔性的或刚性的。传输管的形状可以是U形的。在本发明的一个方面，对照器皿可以具有当与生物样品管流体连接时从生物样品管中抽取液体生物样品的设备；实例包括但不限于注射器式柱塞，或施加负压的任何设备。要理解的是，对照器皿接收引入至反应器皿中的相同的生物样品的一部分。生物样品可以分成两部分，一份用于对照器皿，另一份用于反应器皿。备选地，一等分试样的生物样品可以引入至反应器皿中，第二相等等分试样可以弓I入至对照器皿中。根据本发明的另一个方面，对照器皿配备有如上所述的可密封的隔膜，适于接纳第一针(套管针)和第二针，通过第一针液体生物样品可以进入至对照器皿中，通过第二针可以向对照器皿的内部施加正压或负压。当通过第二针施加负压(真空)时，生物样品可以通过第一针被抽进对照器皿中。优选地，第一针是前面所述的传输管的一部分。第二针可以是下面所述的加压管的一部分，所述加压管与空气(抽出或加压)泵相连接。第一针和第二针可以以平行对齐的方式接合。参见，例如，图24。对照脉动剂将取决于脉动剂，和研究时的参数，如熟练技术人员所充分理解的那样。例如，当脉动剂为肽，一组肽，或肽混合物时，对照脉动剂可以包含具有相同长度的一种或多种肽，不同之处是所述一种或多种肽的序列被随机化和/或不同于现有蛋白或肽的片段。此对照脉动剂将和与脉动剂相同的全血，和相同量的试剂，相同体积的血液一起并在相同的温度下温育一段相同的时期。在另一个实施例中，脉动剂可以是蛋白治疗剂，诸如在赋形剂诸如水、磷酸缓冲盐水或盐水中溶解至所需浓度的IFN-β。则对照脉动剂可以是该赋形剂。在另外的实施例中，脉动剂可以是抗原，诸如在赋形剂诸如水、磷酸缓冲盐水或盐水中溶解至所需浓度的Feldl；则对照脉动剂可以是该抗原的赋形剂。备选地，对照器皿可以无对照剂或是空的，在此情况下，例如，诱导的免疫反应，或诱导的基因表达与未处理的样品相比较。本发明的另一个方面涉及如本文所述的器皿，所述器皿进一步包括其中存在有稳定剂的容器；所述稳定剂暂时地被阻止与脉动剂或暴露于所述试剂的生物样品接触。在本发明的一个方面中，稳定剂包括核酸稳定剂和/或细胞RNA降解抑制剂和/或基因诱导抑制剂，和/或所述稳定剂是如存在于PAXgene血液RNA管中的那些和/或稳定剂是如存在于Tempus血液RNA管中的那些。试剂和其组合是本领域中已知的，或可以由熟练技术人员推导出来。PAXgene和Tempus血液RNA管以包含添加剂的溶液供应，所述添加剂稳定细胞RNA并且可以消除基因转录的离体诱导。没有提供详细的信息描述此添加剂的性质。为此目的，与PAXgene管一起提供的小册子引用专利US5，906，744。然而，此专利中描述的管允许本领域技术人员从血浆中而非如本发明中进行的那样从全血中制备核酸。具体地，US5，906，744的装置优选地包括塑料或玻璃管，用于抑制血液凝固的装置和用于从全血中分离血浆的装置(US5，906，744第2栏，I.42-43)。因此，根据本发明，如US5，906，744中所述的内容与PAXgene血液RNA管的真实内容不相关，因为其涉及不同的用途。根据本发明，容纳在PAXgene血液RNA管中的溶液可以含有季胺表面活性剂。因此，根据本发明，季胺表面活性剂可以用作稳定剂。以前US5，010，183中已经记载了使用季胺表面活性剂来稳定生物样品中的核酸。此专利提供了从生物材料混合物中纯化DNA或RNA的方法。所述方法包括以下步骤将一定量的阳离子去污剂加入至含有RNA或DNA的混合物中，所述量足以溶解细胞、使混合物中的任何污染蛋白和脂质溶解并在核酸和去污剂之间形成不溶性疏水复合物。因此包含RNA或DNA和去污剂的复合物与溶解的污染物分开。在更近的专利中，相同发明人提到使用表面活性剂，如US5，010，183中所述，和其他商购的表面活性剂导致RNA的沉淀效率低，和血细胞的溶解不完全。由于为了此目的存在对改进的阳离子表面活性剂的需求，US5,010,183的发明人搜索从生物样品包括血液中分离RNA的新方法，该方法包括使用包含选择的季胺的水性阳离子表面活性剂溶液(US5,985,572)0能够稳定来自生物样品的RNA的新型水性季胺表面活性剂也记载在TO94/18156和W002/00599中。可以根据上面引用的或相关的专利中公布的规程合成可以用于本发明的任何方法中的可能的不同表面活性剂。可以用于本发明的方法中的季胺的一个实例是十四烷基三甲基草酸铵(US5，985，572)。备选地，所述阳离子去污剂可以是如本发明的实施例1中所示的Catrimox-HTM(US5，010,183)。进一步关于所述生物样品的稳定化，所述申请描述了使用常规分离技术诸如柱色谱法分离核酸。由于强制性地将PAXgene血液RNA管与PAXgene血液RNA试剂盒(也应用柱色谱法)组合在一起，供应商暗示PAXgene血液RNA管中存在的化合物可能仅与所述色谱法相容。在本发明的一个方面，稳定剂装在所述容器中直至诸如当生物样品已经与脉动剂混合的时候，和/或用户需要引入稳定剂的时候。容器可以整合至器皿中，意味着该容器可以与该器皿机械地接合在一起，从而形成一体式部件。根据本发明的一个方面，所述容器的内部和所述器皿的内部相连接，并且存在阻断所述连接的物理屏障。在适当时刻，施加力开启所述物理屏障，允许稳定剂与如此脉12动的生物样品混合。根据本发明的一个方面，根据施加的物理力，物理屏障可逆地开启和关闭。施加的力可以传递至物理屏障本身，或经稳定剂传递至物理屏障。物理屏障可以是任何机械屏障。这样的物理屏障的实例包括回转阀，孔隙阀(aperturevalve)，裂隙阀(slitvalve)，隔膜阀(diaphragmvalve)，球阀(ballvalve)，瓣阀(flapvalve)。根据本发明的另一个方面，可以通过施加力不可逆地开启物理屏障。物理力可以是任何机械力。施加的力可以传递至物理屏障本身(参见例如，图7)，或经稳定剂传递至物理屏障(参见例如，图8)。这样的物理屏障的另一实例包括被挤出适当位置的插塞(参见，例如，图1)，在施加力后破碎的屏障(参见，例如，图7)。根据本发明的另一个方面，所述容器的内部和所述器皿的内部相连接，且通过稳定剂的表面张力与所述连接的孔隙尺寸的结合阻止稳定剂从容器流动至器皿。根据本发明的此方面，在适当时刻，施加传递至稳定剂的力推动稳定剂从容器进入器皿。该力可以例如，通过挤压，连续颠倒和搅动来施加。本发明的另一个方面涉及如本文所述的对照器皿，所述对照器皿进一步包括其中存在有稳定剂的对照容器；所述稳定剂暂时地被阻止与对照脉动剂或暴露于所述对照脉动剂的生物样品接触。本文所述的具有整合的容器的器皿，以及具有整合的对照容器的对照器皿可以一起存在作为试剂盒的一部分。备选的，本文所述的具有整合的容器的器皿的外部，以及具有整合的对照容器的对照器皿的外部可以使用桥接元件接合或连接，以形成单个装置(图19和20)。对照容器可以整合至对照器皿中，意味着对照容器可以与对照器皿机械地接合以形成一体式部件。根据本发明的另一个方面，所述对照容器的内部和所述对照器皿的内部相连接，并且存在阻断所述连接的物理屏障。在适当时刻，施加力开启所述物理屏障，允许稳定剂与如此脉动的生物样品混合。根据本发明的一个方面，根据施加的物理力，物理屏障可逆地开启和关闭。施加的力可以传递至物理屏障本身，或经稳定剂传递至物理屏障。这样的物理屏障的实例包括回转阀，孔隙阀，裂隙阀，隔膜阀，球阀，瓣阀。根据本发明的另一个方面，可以通过施加力不可逆地开启物理屏障。施加的力可以传递至物理屏障本身(参见例如，图17)，或经稳定剂传递至物理屏障(参见例如，图18)。这样的物理屏障的另一实例包括被挤出适当位置的插塞(参见，例如，图12)，在施加力后破碎的屏障(参见，例如，图17)。根据本发明的另一个方面，所述对照容器的内部和所述对照器皿的内部相连接，且通过稳定剂的表面张力与所述连接的孔隙尺寸的结合阻止稳定剂从对照容器流动至对照器皿。根据本发明的此方面，在适当时刻，施加传递至稳定剂的力推动稳定剂从对照容器进入对照器皿。该力可以例如，通过挤压，连续颠倒和搅动来施加。如本文所述的器皿或对照器皿，其分别包括用于分配稳定剂的容器或对照容器，允许未受训练的技术人员使用脉动剂或对照使血液脉动，和稳定如此脉动的血液以用于在稍后的阶段由熟练技术人员分析。因此，在需要采集许多样品的情况下，如本文公开的器皿或对照器皿能够节约成本，因为可以雇用不熟练的操作者来使血液脉动和稳定所述血液。此外，器皿或对照器皿容许再现性，因为已知量的脉动剂和稳定剂可以被预先供给至所述器皿中，这样使与吸移相关的误差最小化。此外，极大地减小了抽取生物样品和使所述样品暴露于脉动抗原或对照之间的时间，因为样品可以直接抽至所述管中，或例如经由注射器。此外，由于简单地通过施加力来实现将稳定剂引入至样品中，可以准确地设定使生物样品脉动和稳定生物样品之间的时间；因此不存在由于吸移稳定剂引起的延迟。本发明的另一实施方案是适合于用脉动剂使生物样品脉动，随后向其中引入稳定剂并且测试如此脉动的生物样品中的RNA成分的试剂盒，其包括如上所公开的一个或多个器皿和一个或多个其中存在有所述稳定剂的容器。该试剂盒还进一步包括其中存在有生物对照脉动剂的对照器皿。在试剂盒的一个实施方案中，其中存在有所述稳定剂的容器不整合至其中存在有脉动剂的器皿中，和/或其中存在有所述稳定剂的对照容器不整合至其中存在有对照物质的对照器皿中。因此容器或对照容器可以是分开的，并且可以是本领域的任何容器，其适合于容纳试剂盒中的稳定剂。根据本发明的一个方面，装有稳定剂的容器或对照容器被密封。容器或对照容器可以具有再密封设备诸如例如，螺帽，推进式帽，翻盖。容器或对照容器可以具有易破的封条诸如剥开式粘性封条，拉断式封条。根据本发明的一个方面，容器或对照容器的壁可以配备有可再密封的区域诸如隔膜；稳定剂可以通过使用注射器针刺穿从容器或对照容器中抽出。容器或对照容器的隔膜可以是在刺穿后可再密封的。根据具体的实施方案，容器或对照容器与在任一端配置有针(例如，套管针)的传输管结合使用。分别地，一根针被设定用于刺穿容器或对照容器的隔膜，且另一根针被设定用于刺穿器皿或对照器皿的隔膜(下文所述)；使用传输管能够分别地将稳定剂从容器或对照容器转移至器皿或对照器皿。该管可以是柔性的或刚性的。传输管的形状可以是U形的。容器或对照容器可以包括一个或多个配件，所述配件适合于连接所述装配有互补的联接设备的器皿和将稳定剂转移至所述器皿或对照器皿。例如，容器或对照容器可以装配有鲁尔配件，该鲁尔配件可以接纳如上所述的连接至所述器皿(参见，例如，图9，10和11)，或连接至所述对照器皿的互补的鲁尔配件。在另一个实施例中，容器或对照容器可以装配有非鲁尔配件，该非鲁尔配件可以与具有互补的非鲁尔联接设计的器皿或对照器皿紧密配合。稳定剂可以通过开启器皿的再密封设备而转移至器皿或对照器皿；稳定剂可以经由任一个上述配件或开口离开容器或对照容器。容器或对照容器可以任选地具有允许空气在稳定剂离开时进入的设备。在本发明的一个方面，容器或对照容器可以具有推动来自所述容器或对照容器的稳定剂的设备；实例包括但不限于注射器式柱塞，容器或对照容器的可挤压壁或施加正压的任何设备。容器或对照容器任选地具有用来确定被分配的稳定剂的体积的测量设备，例如，计量器。在本发明的一个方面，容器或对照容器容纳足以单次使用的稳定剂的体积。在本发明的另一个方面，容器或对照容器容纳足以进行多次脉动试验的稳定剂的体积。根据本发明的另一个方面，容器或对照容器配备有如上所述的可密封隔膜，其适合于接纳第一针(套管针)和第二针，通过第一针稳定剂可以离开器皿，通过第二针可以向器皿内部施加正压或负压。当通过第二针施加正压时，稳定剂可以从容器或对照容器通过第一针被推出。优选第一针是前面所述的传输管的一部分。第二针可以是下面所述的加压管的一部分，所述加压管与空气(抽出或加压)泵相连接。第一针和第二针可以以平行对齐的方式接合。在试剂盒的另一个实施方案中，其中存在有稳定剂的容器与其中存在有脉动剂的器皿相连接；器皿的实施方案如上所述。在试剂盒的另一个实施方案中，其中存在有所述稳定剂的对照容器与其中存在有对照物质的对照器皿相连接；对照器皿的实施方案如上所述。任选地，本发明的试剂盒可以包括说明书手册，所述手册包括对用于使生物样品脉动的方法的描述。本发明的另一个方面涉及如本文公开的器皿和包含所述器皿的试剂盒，其中所述脉动剂包括抗原。根据本发明的一个方面，所述抗原是细菌LPS。根据本发明的另一个方面，所述抗原是免疫反应回忆抗原。根据本发明的另一个方面，所述抗原是破伤风类毒素。根据本发明的另一个方面，所述抗原是癌症免疫治疗抗原。根据本发明的另一个方面，所述抗原是MAGE-3。根据本发明的另一个方面，所述抗原是猫变应原。根据本发明的另一个方面，所述抗原是狗1(11。根据本发明的另一个方面，所述抗原是来自器官供体的抗原呈递细胞。根据本发明的另一个方面，所述抗原是自身抗原。根据本发明的另一个方面，所述抗原是GAD65。对照脉动剂将取决于脉动剂，和研究时的参数，如熟练技术人员所充分理解的那样。例如，当脉动剂为肽，一组肽，或肽混合物时，对照脉动剂可以包含具有相同长度的一种或多种肽，不同之处是所述一种或多种肽的序列被随机化和/或不同于现有蛋白或肽的片段。此对照脉动剂将和与脉动剂相同的全血，和相同量的试剂，相同体积的血液一起并在相同的温度下温育相同的时间段。在另一个实施例中，脉动剂可以是蛋白治疗剂，诸如在赋形剂诸如水、磷酸缓冲盐水或盐水中溶解至所需浓度的IFN-β。则对照脉动剂可以是该赋形剂。在另外的实施例中，脉动剂可以是抗原，诸如在赋形剂诸如水、磷酸缓冲盐水或盐水中溶解至所需浓度的I^eldl；则对照脉动剂可以是该抗原的赋形剂。备选地，对照器皿可以无对照剂或是空的，在此情况下，例如，诱导的免疫反应，或诱导的基因表达与未处理的样品相比较。本发明的另一个方面涉及用抗原使生物样品脉动，随后稳定其中的核酸并测试如此脉动的稳定生物样品中的RNA成分的方法。该方法包括使用如本文公开的器皿、对照器皿和/或试剂盒来任选地采集、脉动和稳定所述样品。本发明的一个实施方案是用于接受液体生物样品的装置，其有助于使所述样品分别地暴露于第一物质和对照物质，并随后暴露于核酸稳定剂，所述装置包括-第一室，其中存在第一物质，-第二室，其中存在对照物质，-第三室，其中存在稳定剂，和-用于生物样品管的支架。装置的实例显示在图21a和21b中。根据本发明的一个方面，至少一个(例如，1个、2个、3个、所有的)，优选所有室被密封。一个或多个(例如，1个、2个、3个、所有的)室可以具有再密封设备诸如例如，螺帽，推进式帽，翻盖。一个或多个(例如，1个、2个、3个、所有的)室可以具有易破的封条诸如剥开式粘性封条，拉断式封条。根据本发明的一个方面，一个或多个(例如，1个、2个、3个、所有的)室配备有可再密封的区域诸如隔膜，通过该隔膜可以通过使用注射器针刺穿将物质引入至室中。室的隔膜可以是在刺穿后可再密封的。根据具体的实施方案，一个或多个(例如，1个、2个、3个、所有的)室和生物样品管与传输管(在任一端配置有空心针(例如，皮下注射器针的套管针)的空心管，如例如图22中所示)结合使用。一根针被设定用来刺穿一个室(例如，第一室)的隔膜，且另一根针被设定用来刺穿另一个室(例如，第三室)的隔膜。备选地，一根针被设定用来刺穿一个室(例如，第一室)的隔膜，且另一根针被设定用来从生物样品管(由支架支撑)抽取流体;以此方式，两个室或一个室与生物样品管可以经所述管临时地流体连接。流体连接允许使用传输管将例如，稳定剂从第三室转移至第一室和/或第二室。所述管可以是柔性的或刚性的。传输管可以是U形的。根据本发明的生物样品管可以是适合于保存生物样品的任何管。根据本发明的一个方面，生物样品管被密封。根据本发明的一个方面，生物样品管具有再密封设备诸如，螺帽，推进式帽，翻盖。根据本发明的一个方面，生物样品可以通过使用注射器针刺穿至管壁中来引入至管中。管壁可以是在刺穿后可再密封的，或管壁可以是在刺穿后不可再密封的，或样品管的壁可以配备有可再密封的区域诸如隔膜。根据本发明的一个方面，生物样品可以通过传输管从被引入的管中抽出，所述传输管包括在任一端配置有针(例如，套管针)的空心管，如本文他处所述。一根针被设定用来刺穿容纳所述样品或其他液体的样品管的隔膜，且另一根针被设定用来刺穿室的隔膜；使用所述管能够将液体生物样品从样品管转移至一个室中。所述管可以是柔性的或刚性的。传输管的形状可以是U形的。根据本发明的一个方面，生物样品可以借助于一个或多个配件而引入至样品管中，所述配件与样品管连接，适于注射器或其他装配有联接设备的容器。例如，管可以装配有鲁尔配件，所述鲁尔配件可以接纳无针注射器。在另一个实施例中，管可以装配有非鲁尔配件，所述非鲁尔配件可以与具有互补的非鲁尔联接设计的容器紧密配合。根据本发明的一个方面，生物样品可以借助于套管针或皮下注射器针而引入至所述管中，所述套管针或皮下注射器针与所述管相适合，适合于从个体直接抽取生物样品。根据本发明的一个方面，生物样品可以通过开启再密封设备引入至样品管中。在本发明的一个方面，第一室可以具有当与生物样品管流体连接时用来将液体生物样品从生物样品管抽至第一室中的设备。第二室可以类似地具有当例如使用传输管与生物样品管流体连接时用来将液体生物样品从生物样品管抽至第二室中的设备。这样的设备的实例包括但不限于使用注射器式柱塞，或向接收室施加负压，或向供应室施加正压的任何设备。根据本发明的优选实施方案，使用下述可插入的加压管控制室内的压力。第一室和/或第二室可以部分地保持在真空下。在本发明的一个方面，第一室可以具有当与第三室流体连接时用来将稳定剂从第三室抽至第一室中的设备。第二室可以类似地具有当例如使用传输管与第三室流体连接时用来将稳定剂从第三室抽至第二室中的设备。这样的设备的实例包括但不限于使用注射器式柱塞，或向接收室施加负压，或向供应室施加正压的任何设备。根据本发明的优选实施方案，使用下述可插入的加压管控制室内的压力。第一室和/或第二室可以部分地保持在真空下。在本发明的另一个方面，第三室可以具有当例如使用传输管与第一室和/或第二室流体连接时用来将稳定剂从第三室推进至第一室和/或推进至第二室中的设备。这样的设备的实例包括但不限于注射器式柱塞，或向第三室施加正压的任何设备。根据本发明的优选实施方案，使用下述可插入的加压管控制室内的压力。第三室可以保持在正压下。根据本发明的一个方面，第一室是无菌的。根据本发明的另一个方面，第二室是无菌的。根据本发明的另一个方面，第三室是无菌的。根据本发明的另一个方面，所有室是无菌的。根据本发明的一个实施方案，每个室配备有如上所述的可密封的隔膜，适于接纳第一针和第二针，液体可以通过第一针，且通过第二针可以向室的内部施加正压或负压。当通过第二针施加正压时，液体可以通过第一针从室中被推出。备选地，当通过第二针施加负压时，液体可以通过第一针被抽进室中。优选地，第一针是前面所述的传输管的一部分。第二针可以是加压管的一部分。第一针和第二针可以以平行对齐的方式接合。参见，例如，图24。当需要时，一个或多个(例如，1个、2个、3个、所有的)室可以任选地配置有通气孔，所述通气孔允许室内的压力与环境压力相等。通气孔可以包括单向阀(例如，回转阀，孔隙阀，裂隙阀，隔膜阀，球阀，瓣阀)，所述单向阀被设定用来提供气体在仅一个方向上的通过，例如，其可以允许释放排出的气体。根据本发明的另一个方面，所述装置进一步配备有用于生物样品管的支架，在本文中也称为样品管支架。样品管支架可以是任何合适的结构，机械的或其他方式的结构，其保持样品管处于直立位置。在优选的实施方案中，样品管支架是有壁的孔，其具有与至少样品管的基部区域互补(reciprocal)的形状。根据本发明的另一个方面，所述装置进一步配备有用于传输管的支架，在本文中也称为管支架。管支架可以是任何合适的结构，机械的或其他方式的结构，其适于将传输管可拆卸地连接至所述装置。管支架允许在运输和非使用期间保存传输管。其也为传输管的针末端提供清洁的环境。在优选的实施方案中，传输管支架包括两个槽，各个槽具有与传输管的各端互补的形状。所述装置可以采取满足对室和支撑元件的要求的任何形式。要理解的是其应该优选地对于尺寸、重量、支撑能力、耐久性和重复利用性进行优化。在本发明的优选实施方案中，室彼此机械连接。优选地，样品管支架也与室机械连接。优选地，管支架也与室机械连接。在如此连接的条件下，该装置是单个实体，其具有作为自主部件(autonomousunit)的方便性。机械连接可以使用本领域中已知的任何合适的配置来实现，例如，采用与相同或不同材料制成的支架机械连接的由单块生物惰性材料诸如聚碳酸酯、聚丙烯、环烯烃共聚物(COC)或玻璃形成的室。本发明的优选实施方案以三维视图显示在图21a中并以横截面显示在图21b中，其描绘了由诸如环烯烃共聚物(COC)的材料的实体块料(solidblock)44形成的装置30，其配备有其中存在有第一物质2的第一室32，其中存在有对照物质35的第二室34，和其中存在有稳定剂5的第三室36。室32，34，36是设置在实体块料44中的圆柱形开口，每个室用盖子46，48，50密封，所述盖子也可以至少部分地由COC制成。备选地，室32，34，36可以各自由固定在设置于实体块料44中的圆柱形开口中的圆柱形瓶形成，所述圆柱形瓶由合适的材料(例如，玻璃、聚丙烯、聚碳酸酯)制成，每个瓶各自用盖子46，48，50密封。每个盖子46，48，50配置有可再密封的隔膜38，40，42，为使用针进入室内部提供通路。样品管52支架设置在装置上。所述样品管支架52是圆柱形开口，其被设定用于支撑样品管的基部区域。该装置进一步配置有管支架M，56，所述管支架包括两个槽，每个槽具有与传输管的各端互补的形状。使用U形传输管，样品管的内容物可以转移至第一(脉动剂)室32和第二(对照)室34的每一个中，所述室处于负压下。可以使用相同的针将稳定剂从第三室36转移至第一室32和第二室34的每一个中。如他处所述，包括在任一端配置有针(例如，套管针)的空心管的传输管用来将液体从一个室或器皿转移至另一个室或器皿，通过向提供室(或容器或对照容器)施加正压推出所述液体，或通过在接收室(或器皿或对照器皿)中施加负压抽取所述液体。传输管针适合刺穿可再密封的(例如，橡胶或硅氧烷)隔膜使得流体或空气仅可以通过针进入室(器皿或对照器皿)内。针的尖端优选地是成斜面的，其两侧是锋利的，并且可以是不取心的(non-coring)。所述针可以是22G，23G，24G或25G，或前述数值的任意两个之间的范围内的值，优选23G。每根针可以用可分开的不透水盖保护以防止在使用前微生物的进入。每个针盖可以位于管支架中并且与管支架连接，以使得当U形针从装置中提起时，盖子与每根针分开，使盖子仍留在管支架内。传输管中传输管针的长度(L)(是指针的直线部分的长度)可以相同或不同。它们的长度将取决于室的深度并取决于要被转移的液体的体积。作为一般的原则，一根传输管针的长度(Li)可以为25、26、28、30、32、33、34、35、36、38、40、42、44、46、48、50、55mm，或上面提及的数值的任意两个之间的范围内的值，优选25-35mm，更优选30-35mm。另一根传输管针的长度(L2)可以为25、26、28、30、32、33、34、35、36、38、40、42、44、46、48、50、55mm，或上面提及的数值的任意两个之间的范围内的值，优选40-50mm，更优选42_46mm。管的高度(L3)将取决于可用的余隙空间。作为一般的原则，一个传输管的长度(L3)可以为5、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17mm，或上面提及的数值的任意两个之间的范围内的值，优选10-15mm，更优选12-14mm。空心管可以是刚性的或柔性的。优选其是刚性的。根据本发明的优选方面，传输管由以U形弯曲的长针形成，使得第二针连接至非尖端从而形成本发明的传输管，其具有刚性空心管。当采用刚性管时两根针之间的距离(D)将取决于各室之间的间距。根据本发明的优选方面，两根针之间的距离(D)与两个相邻室之间的距离基本相同；这通常可以在室和样品支架以正方2X2阵列排列时实现。作为一般原则，针之间的距离可以为20、22、24、26、28、30或32mm，或上面提及的数值的任意两个之间的范围内的值，优选24-28mm，更优选26mm。传输管可以适于连接机器人系统(例如，机械手或平台)从而有助于自动化样品处理。在采用刚性空心管时，机器人系统经所述刚性空心管与传输管连接。机器人系统的使用容许使用本发明的几种装置进行自动化测定，其也在无菌环境中，潜在地缺少其他刺激剂的条件下进行。此外，该装置可以通过单个传输管的效用促进液体试剂的转移。对室、器皿或容器的压力可以通过包括柔性管的空心加压管来提供(图23)，所述柔性管在一端配置有用于插入至室、器皿或容器的隔膜中的针，其另一端适于与空气泵连接，所述空气泵可以对所述室、器皿或容器提供所需的受控压力。此加压管针可以通过接头(joint)诸如焊接接头、粘合接头或夹钳机械地连接至传输管的一根针(参见图24)。加压管针适合于刺穿可再密封的(例如，橡胶或硅氧烷)隔膜使得空气或气体可以仅通过所述针进入或离开室、器皿或容器。针的尖端优选地是成斜面的，其两侧是锋利的，并且可以是不取心的。所述针可以是22G，23G，24G或25G，或前述数值的任意两个之间的范围内的值，优选23G。所述装置配置有另外的密封室包括在本发明的范围内。所述室可以沿直线排列或以阵列的方式(例如，2x2，2x4等)排列。优选地，所述室和样品支架以2x2平方阵列排列，相邻的室和样品支架之间的距离是相等的。在本发明的一个实施方案中，使生物样品脉动的方法包括以下的步骤i)将生物样品引入至所述器皿中，ii)任选地搅动所述器皿，iii)在预定的时间段后将稳定剂引入至所述器皿中，和iv)测试其中核酸的水平。本发明的另一个实施方案是测试个体针对抗原的免疫应答的方法，所述个体已经针对所述抗原进行了预先免疫，所述方法包括使用如本文所公开的器皿，其中脉动剂是被研究的抗原，并且包括以下的步骤a)将从所述个体获取的血液样品引入至器皿中，b)任选地搅动所述器皿，c)在预定的时间段后，将所述核酸稳定剂引入至所述器皿中，d)测试细胞因子mRNA的水平。根据本发明的一个方面，所述细胞因子是IL-2，IL-4，IL_13，IFN-γ中的一种或多种。本发明的另一个实施方案是测试个体针对抗原的超变应原性(hyperallergenicity)的方法，所述方法包括使用如本文所公开的器皿，其中脉动剂是被研究的抗原，并且包括以下的步骤e)将从所述个体获取的血液样品引入至器皿中，f)任选地搅动所述器皿，g)在预定的时间段后，将核酸稳定剂引入至所述器皿中，h)测试IL-4mRNA的水平。本发明的另一个实施方案是测试个体排斥器官移植物的方法，所述方法包括使用如本文所公开的器皿，其中脉动剂是供体的组织相容性抗原，并且包括以下的步骤i)将从所述个体获取的血液样品引入至器皿中，j)任选地搅动所述器皿，k)在预定的时间段后，将核酸稳定剂引入至所述器皿中，1)测试IL-2mRNA的水平。上述的方法可以适合于与本发明的装置一起使用，例如，本发明的一个实施方案是使用本发明的装置使存在于生物样品管中的液体生物样品脉动的方法，所述方法包括以下的步骤i)使用U形针将液体生物样品从生物样品管转移至其中存在有对照剂的第二室，ii)使用U形针将液体生物样品从生物样品管转移至其中存在有脉动剂的第一室，iii)使用U形针将稳定剂从第三室转移至生物样品管，iv)使用U形针将稳定剂从第三室转移至其中存在有对照剂和液体生物样品的第二室，ν)使用U形针将稳定剂从第三室转移至其中存在有脉动剂和液体生物样品的第一室，由此用脉动剂和对照剂使液体生物样品脉动，并稳定如此脉动的样品。上述的其他方法，即测试个体针对抗原的免疫应答的方法，所述个体已经针对所述抗原进行了预先免疫；测试个体针对抗原的超变应原性的方法；测试个体排斥器官移植物的方法，可以类似地适合于与本发明的装置一起使用。本发明的另一个方面涉及用抗原使生物样品脉动，随后稳定其中的核酸并且测试如此脉动的稳定生物样品中的RNA成分的方法，所述方法包括以下步骤Α)使用如上所述的试剂盒、装置和/或方法，用脉动剂使所述生物样品脉动并向其加入抑制RNA降解和/或基因诱导的化合物，B)形成包含核酸的沉淀物，C)将步骤(B)的所述沉淀物与上清液分离，D)使用缓冲液溶解步骤(C)的所述沉淀物，形成混悬液，Ε)使用自动化装置从步骤(D)的所述混悬液中分离核酸，F)使用自动化装置分配/分发用于RT-PCR的试剂混合物，G)使用自动化装置将在步骤(E)中分离的核酸分配/分布在步骤(F)的已分配的试剂混合物中，以及H)以自动化设置，使用步骤(G)的核酸/RT-PCR试剂混合物确定转录物的体内水平。上述方法可以任选地采用本文所述的对照，所述生物样品暴露于所述对照。对照不含有试剂或含有对照脉动剂。该方法基本上在暴露于脉动剂的同时进行，并且以与采用器皿的方法相同的方式进行。对照器皿的结果可以用来标准化获自器皿的结果。在生物取样时抑制RNA降解和/或基因诱导是至关重要的，其目的是回收RNA混合池，所述RNA混合池可以用来确定体内转录物水平。细胞RNA可以使用PAXgene血液RNA系统以其完整形式纯化，然而，本发明证明使用此“同样的”系统不能测量真实的体内水平(参见实施例2)。本发明显示核酸转录物的体内水平仅可以在从由被稳定的生物样品制备的RNA混合池开始时，使用抑制细胞外和/或细胞内RNA降解和/或基因诱导的化合物，来测量/确定/定量；由此使用自动化装置进行核酸的分离，由此使用自动化装置分配用于RT-PCR反应的试剂混合物和分离的核酸，并且由此以自动化设置进行转录物水平的测定。根据本发明，仅此方式允许以可再现的方式定量体内RNA。在所述方法中执行的步骤数目减少至最少，以便避免误差。“误差”可以是吸移、处理、程序上和/或计算引起的误差或可以由本领域技术人员造成的任何误差。就此而言，本发明建议以一步式进行RT和PCR反应。本发明的方法在合并更多的中间步骤时应该甚至更为准确。例如，在本发明的方法中，可以合并步骤㈧和⑶。在本发明的另一个方面，核酸的分配(步骤(G))可以在分配RT-PCR所需要的试剂混合物(步骤(F))之后、之前或同时进行。根据本发明的方法，不需要进行OD测量，消除了计算核酸浓度时造成的误差。相反，使用完整的PAXgene血液RNA试剂盒，需要进行OD测量。这再次阐明了根据本发明的方法与后一种系统相比是更为可靠和精确的方法。通过表1中给出的再现性研究举例说明了本发明的此较好的精确度。在本发明的另一个方面，当在根据本发明的方法的步骤(D)中溶解形成的沉淀物时，获得的混悬液可以与完全自动化的RNA提取法和分析法相结合使用。仅此组合允许所进行的方法的精确优化和再现性，并且允许在脉动后精确和可再现地确定RNA水平。由于PAXgene血液RNA系统的小册子描述相应的管不可以与其他分离方法结合使用，并且没有详细的信息描述该试剂盒的不同组成，因此对于本领域技术人员来说使用此PAXgene血液RNA系统的一部分并由其开发新的方法不是显而易见的。仅存在少量允许完全自动化地分离RNA市售系统。此类自动化核酸提取器的实例为=MagNAPureLCΧ^(^KifHr(RocheDiagnostics)),AutoGenprep960(Autogen),ABIPrismTM6700自动化核酸工作站(应用生物系统(AppliedBiosystems))，带有任选WAVE片段收集器(FragmentCollector)FCff200的WAVE核酸分析系统(Transgenomic)禾口BioRobot8000(Qiagen)。本发明针对这样的事实对于所有这些系统必不可少的是使用这样的材料来开始，所述材料是尽可能新鲜的，或被稳定化以便允许在脉动后确定转录物水平，其中RNA降解被最小化。关于所有这些系统的问题是生物样品在这样的管中采集并且带到实验室，所述管不含有或仅含有常规添加剂，使得mRNA仍然可以快速地降解。因此，使用这些方法进行mRNA定量无疑能够定量所述管中存在的转录物，但此定量不代表取样时细胞/生物剂中存在的转录物水平。此试验证据提供在本发明的实施例1的图32.2中。术语“定量”的含义是精确地和可再现地确定RNA拷贝数；但对于本领域技术人员不太重要的是也可以使用经由如本发明所述的方法分离的RNA进行定性或半定量研究。定义“转录物”不限于信使RNA(mRNA)，而且还涉及本领域技术人员已知存在的其他类型的RNA分子。根据本发明的方法，可以提取mRNA以及总RNA。这允许正确地估计体内核RNA，从而提供评价基因转录的有力工具。术语“核酸”是指单链或双链核酸序列，所述核酸可以由脱氧核糖核苷酸(DNA)或核糖核苷酸(RNA)、RNA/DNA杂交体组成或可以是扩增的cDNA或扩增的基因组DNA，或其组合。根据本发明的核酸序列也可以包括本领域中已知的任何修饰的核苷酸。根据本发明，在生物样品中核酸可以存在于细胞外或细胞内。在本发明方法的步骤(C)中将沉淀物与上清液“分离”可以经由离心、过滤、吸附或本领域技术人员已知的其他手段来进行。所述沉淀物可以包括细胞、细胞/碎片、核酸或其组合。该概念的基础是终止含核酸试剂(生物剂)与外部来源/脉冲/信号相接触。这可以通过固定、溶解和/或分解含核酸试剂，或通过本领域技术人员已知的任何其他手段来进行。本发明的方法的步骤(D)中使用的缓冲液可以是用来溶解所述方法的步骤(C)中获得的沉淀物的缓冲液。此缓冲液可以具有附加的作用诸如溶解或进一步溶解含核酸试剂。使用的“自动化装置”可以是自动化吸移装置或本领域技术人员已知的适合于执行指定动作的另一种自动化装置。“用于RT-PCR的试剂混合物”是指同时进行RT和PCR反应所需的所有试剂(当明确提及时不包括寡核苷酸)。根据本发明，“寡核苷酸”可以包括如存在于例如引物或探针中的短段核酸。根据本发明，此方法可以与微阵列或RNA酶保护测定结合使用。如前面所指出的，保存生物样品诸如血液导致mRNA水平的不正确测定。实际上，在实践中，新鲜样品的分析是不可行的，因为取样的场所和RNA分析的场所位于不同的位置。根据本发明的方法能够在对其体内转录物含量没有任何影响条件下，使生物样品从远处场所运输至合适的实验室。生物样品的运输可以在本发明的方法中的步骤(A)或步骤⑶后进行。通常，当使用血液样品时，在分离核酸之前优先清除红细胞。红细胞富含血红蛋白，并且它们的存在导致产生高度粘性的溶胞产物。因此，这些的清除能够以更加改良的方式来分离核酸。然而，在本发明的方法中，取消了此步骤，因为立即形成包含核酸的不溶性沉淀物，从而使这些与生物样品的所有其他成分分开。这说明，除了其他优势以外，本发明的方法与大多数现有技术方法相比是更好的方法。根据本发明，在本发明的方法的步骤(D)中使用的所述缓冲液可以是含有胍-硫氰酸盐(thiocyanate)的缓冲液。在本发明的实施例中，在PAXgene血液RNA管中形成的沉淀物溶解在由MagNAPureLCmRNA分离试剂盒I(罗氏诊断(RocheDiagnostics)，分子生物化学品(MolecularBiochemicals))提供的溶解缓冲液中。因此，在本发明中建议可以用于本发明的方法中的可能的缓冲液之一是由MagNAPureLCmRNA分离试剂盒I(罗氏诊断(RocheDiagnostics)，分子生物化学品(MolecularBiochemicals))提供的含有胍-硫氰酸盐的缓冲液。MagNAPureLCmRNA分离试剂盒KitI(罗氏诊断(RocheDiagnostics)，分子生物化学品(MolecularBiochemicals))专门设计用于MagNAPureLC仪器上以保证从全血、白细胞和外周血淋巴细胞中分离高质量和未降解的RNA。根据其产品说明，获得的RNA适合于高灵敏度和定量LightCyclerRT-PCR反应，以及适合于标准模块循环仪(blockcycler)RT-PCR反应，Northern印迹和其他标准RNA应用。尽管如此，本发明证明“原样地”使用此方法不能确定正确的转录物水平。本发明显示存在着在RNA分离之前稳定RNA的需求(参见实施例1)。本发明描述了使用稳定RNA的化合物和自动化分离/分析程序的独特组合。根据本发明，一旦步骤(D)的沉淀物溶解在溶解缓冲液，诸如由MagNAPureLCmRNA分离试剂盒I提供的缓冲液中，本发明的方法可以遵照关于MagNAPureLCmRNA分离试剂盒I所述的程序。通过溶解缓冲液中存在离液盐来溶解样品后，链霉亲和素包被的磁性微粒与生物素标记的低聚-dT—起加入，并且mRNA结合于微粒的表面。紧接着进行DNase消化步骤。然后使用磁体和几次洗涤步骤将mRNA与未结合的物质分离。最后，洗脱纯化的mRNA。此分离试剂盒能够作为“离人(walkaway)”系统自动化分离纯mRNA。其能够分离适合于关于基因表达分析的所有主要下游应用的高质量和完整性的mRNA。根据使用的样品材料提供不同的试验方案。样品可以直接放置在MagNApureLC仪器平台上。当使用全血时，存在于样品中的细胞优先被手动地溶解。然后可以延期进行mRNA分离或直接在该仪器上进一步进行处理。本发明在本发明的实施例中证明在根据本发明的方法的步骤(E)，步骤(F)和/或步骤(G)中使用MagNAPureLC仪器(罗氏诊断(RocheDiagnostics)，分子生物化学品(MolecularBiochemicals))作为自动化装置导致产生RNA混合池，该RNA混合池可以用来确定暴露于脉动剂后转录物的精确水平。俘获RNA的珠子诸如经由链霉亲和素-生物素系统或等效系统包被以低聚-dT的磁珠，可以应用于本发明的方法中以便从细胞碎片中分离mRNA。备选地，根据本发明可以使用其他自动化装置诸如ABIPrismTM6700自动化核酸工作站(应用生物系统(AppliedBiosystems))或可以用于此目的的任何其他自动化装置。在MagNApureLCmRNA分离试剂盒I(目录编号3004015)的小册子中，没有详细提及此试剂盒中使用的缓冲液的组成。因此，对于本领域技术人员来说，假定此试剂盒提供的缓冲液将能够溶解通过PAXgene血液RNA管的方法所获得的沉淀物不是显而易见的。另外，本领域技术人员不会基于由PAXgene血液RNA管小册子提供的信息而将两种方法结合起来，该小册子声称这些管仅可以与相应的PAXgene血液RNA试剂盒相结合(第3页，参见系统的限制；第6页，参见订购须知)。如上面所指出的，当使用血液样品时，在本发明的方法中的步骤(A)后优先溶解红细胞。在MagNAPureLCmRNA分离试剂盒I(罗氏诊断(RocheDiagnostics)，分子生物化学品(MolecularBiochemicals))的设计中，在从白细胞中分离mRNA前，有溶解和清除红细胞的可能性。然而，由于此步骤，样品不能被处理得足够快以避免mRNA降解。本发明人决定使用包含在PAXgene血液RNA管中的稳定剂与MagNAPure仪器上的MagNAPuremRNA分离试剂盒相结合。使用PAXgene血液RNA管提供了核酸的沉淀物，推测该沉淀物不能溶于MagNAPuremRNA分离试剂盒的溶解缓冲液中。尽管这样，本发明人发现这实际上是可能的。遵照此观察，本发明人将PAXgene血液RNA管中的稳定剂的使用与自动化RNA分离系统的使用组合起来。本发明人出人意料地发现此组合是可能的，并且此组合提供了一种用于从生物样品中精确定量mRNA的有效技术。使用根据本发明的方法分离的RNA准备好用于大范围的下游应用，包括例如核酸扩增技术，诸如RT-PCR和NASBA表达阵列和表达芯片分析，定量RT-PCR，包括TaqMan技术，cDNA合成，RNase和Sl核酸酶保护，Northern、斑点印迹和狭线印迹分析和引物延伸。本发明人在本发明的实施例1和实施例2中显示使用抑制RNA降解和/或基因诱导的化合物与自动化RNA分离和自动化分析方法诸如实时PCR的结合能够确定转录物的体内水平。然而，根据本发明，可以应用除实时PCR以外的分析方法，只要它们以自动化设置提供。根据本发明的方法的主要优点是这样的事实，即通过使用此方法可以分析小的样品体积。当仅能获得小体积时这是首要重要的，例如，当分析新生儿血样或在大量失血(highbloodloss)的情况下。根据本发明，可以使用小至100μ1的生物样品进行RNA定量。使用Qiagen试剂盒(PAXgenTM血液RNA系统)分析来自小至100μ1的样品的RNA是不可能的，该试剂盒需要较大体积的血液(根据该试剂盒手册为2.5ml)。如上所述，本发明的一个方面是适合于用脉动剂使生物样品脉动，随后稳定来自如此脉动的生物样品的核酸的试剂盒。在本发明的另一个方面，所述试剂盒包含用于从稳定的、脉动的生物样品中分离可定量的RNA的附加组分。根据本发明的一个方面，所述试剂盒可以包含诸如下列的附加组分-用于自动化RNA分离的试剂，-用于同时进行RT和实时PCR反应的试剂混合物或其独立的化合物，其允许自动化分配所述混合物，-任选地，用来执行所述RT-PCT反应的特异性寡核苷酸，和-任选地，说明书手册，其说明自动化RNA分离的方法，为RT-实时PCR自动化分配试剂混合物和分配分离的核酸的方法，和自动化RNA分析的方法。在本发明实施例中，本发明人应用了来自罗氏诊断(RocheDiagnostics)，分子生物化学品(MolecularBiochemicals)的〃LightcyclermRNA杂交探针试剂盒〃(目录#3018954)来进行一步式RT-PCR反应。所有需要的试剂包含在此试剂盒中，除了寡核苷酸(由Biosource合成)以外。然而，如本发明中所述的实时PCR也可以在其他仪器，诸如应用生物系统(AppliedBiosystems)仪器上进行。该试剂盒可以另外地包含缓冲液诸如含胍-硫氰酸盐的缓冲液，其可以用于根据本发明的方法的步骤(b)中。根据本发明的方法也可以用于定量/检测生物样品中的DNA(双链或单链)。因此，本发明还涉及用于定量来自生物样品的DNA的方法，其中使用如对根据本发明定量RNA所进行的方法，其中省去了RT反应，并且其中步骤(a)的化合物也保护DNA不被降解。因为这些核酸比RNA更稳定，因此其稳定与RNA的稳定相比不太重要。另外，本发明涉及根据本发明的用于从生物样品中分离可定量的DNA的试剂盒，其中缺少用于进行所述RT反应的试剂混合物/化合物。需要确定生物样品中精确的DNA水平的情况可以用来确定生物样品中由意外的基因、病原体或寄生虫引起的一种或多种感染/一种或多种污染的“存在”；和/或用来确定所述感染/污染的“水平”。例如，该方法可以用来确定谷物批料(cerealbatch)中转基因物质的百分比。本发明还涉及使用根据本发明的装置、试剂盒和方法，以监测/检测用一种试剂脉动后生物样品中生物标志物的体内核酸变化，从而诊断特定的疾病。本发明还涉及使用根据本发明的装置、试剂盒和方法，以监测/检测用一种试剂脉动后生物样品中生物标志物的体内核酸变化，从而筛选化合物，所述化合物用于制备治疗疾病的药物。因此，本发明还涉及可通过根据本发明的方法鉴定的化合物。本文公开的装置、试剂盒和方法可以用来治疗和/或诊断疾病。要被治疗或诊断的疾病的一个实例是免疫相关疾病。根据本发明，免疫相关疾病的实例可以是自身免疫(autoimmunity)，类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis)，多发性硬化症(multiplesclerosis)，1型糖尿病，癌症(例如，在癌症免疫治疗中)，免疫缺陷(immunodeficiencies)(例如，在AIDS中)，变态反应，移植物排斥(graftrejection)或移植物抗宿主病(GraftversusHostDisease，GVHD)(例如，在移植中)。本发明中公开的实施例详细地举例说明了所述应用。因此，免疫调节性化合物或试剂可以影响所述疾病之一；免疫相关的转录物或表位特异性CTL相关的或T辅助淋巴细胞相关的转录物的变化可以指示所述疾病之一的存在和/或状态；以及可以说明所述疾病之一的状态的免疫学状态。可以使用本发明的装置、试剂盒和方法定量以便研究所述免疫相关疾病的核酸可以是编码例如，趋化因子、细胞因子、生长因子、细胞毒性标志物、转录因子、TNF相关的细胞因子受体超家族的成员和它们的配体、凋亡标志物、免疫球蛋白、T细胞受体，和已知的或待发现的与免疫系统的活化或抑制相关的任何标志物的核酸。根据本发明，所述核酸可以编码标志物诸如IL-lra,IL-Iβ，IL-2，IL-4，IL-5，IL-9,IL-10,IL-12p35,IL_12p40，IL-13，TNF-α，IFN-γ,IFN-α，TGF-β，和参与或不参与免疫应答的任何白介素或细胞因子。管家基因诸如β-肌动蛋白或GAPDH(磷酸甘油醛脱氢酶)可以用作内部标志物。根据本发明，所述表位特异性CTL相关的或T辅助淋巴细胞相关的转录物是编码细胞因子、细胞因子受体、细胞毒素、炎性或抗炎介质、TNF相关的细胞因子受体超家族的成员和它们的配体、G-蛋白偶联受体和它们的配体、酪氨酸激酶受体和它们的配体、转录因子，和参与细胞内信号传导途径的蛋白的核酸。根据本发明，所述核酸可以编码粒酶，穿孔蛋白(perforine)、前列腺素、白三烯、免疫球蛋白和免疫球蛋白超家族受体、Fas和Fas配体、T细胞受体、趋化因子和趋化因子受体、蛋白-酪氨酸激酶C、蛋白-酪氨酸激酶A、信号转导物和转录激活物(STAT)、NF-kB、T-bet、GATA-3、0ct-2中任一种的标志物。本发明还描述了根据本发明的装置、方法或试剂盒在检测/监测/筛选化合物中的应用，其中所述化合物是免疫调节性化合物，其可以选自由下列组成的组真核细胞、原核细胞、病毒、噬菌体、寄生虫、药物(天然提取物、有机分子、肽、蛋白、核酸)、医学治疗、疫苗和移植物。所述方法的应用不限于检测/监测/筛选单一化合物。也可以研究一组物质的协同作用。本发明还涉及如上所述的装置、试剂盒和方法的任一种在检测/监测表位特异性CTL或免疫相关的转录物中的应用。根据本发明的装置、试剂盒和方法也可以用于在用易于改变患者的免疫状态的药物/疗法/疫苗治疗患者后监测体内免疫学应答。根据本发明，使用所述的方法在处于治疗中的患者或参加采用免疫调节剂药物或疗法或采用(治疗性或预防性)疫苗的临床试验的患者的全血中对细胞因子mRNA(可以扩展至趋化因子、生长因子、细胞毒性标志物、凋亡标志物、或已知的或待发现的与免疫系统的活化相关的任何标志物)的检测可以用来评价治疗的功效、安全性和/或最终的副作用。本发明还涉及用于检测体内免疫学状态以用于影响免疫系统的疾病(癌症、自身免疫性疾病、变态反应、移植排斥、GVHD等)的诊断/预后的装置、试剂盒和方法。根据本发明，使用所述的方法在患有直接或间接影响其免疫系统的疾病患者的全血中检测细胞因子mRNA(可以扩展至趋化因子、生长因子、细胞毒性标志物、凋亡标志物、或已知的或待发现的与免疫系统的活化相关的任何标志物)，目的是获得诊断或预后。本发明还描述了通过分析表位特异性CTL鉴定能够改变受试者的免疫学状态的试剂的方法，所述方法包括以下步骤(a)将一种或多种免疫调节剂施用于受试者，(b)从所述受试者取样全血，(c)使用如上所述的装置，使用与步骤(a)中施用的相同/相似和/或不同的免疫调节剂使步骤(b)的全血样品中存在的血细胞脉动，(d)将步骤(C)的脉动的血细胞或步骤(b)的非脉动的血细胞收集在管中，所述管包含抑制RNA降解和/或基因诱导的化合物，或将所述化合物加入至脉动的/非脉动的细胞，(e)形成包含核酸的沉淀物，(f)将步骤(e)的所述沉淀物与上清液分开，(g)使用缓冲液溶解步骤(f)的所述沉淀物，形成混悬液，(h)使用自动化装置从步骤(g)的所述混悬液中分离核酸，(i)使用自动化装置分配/分发用于RT-PCR的试剂混合物，(j)使用自动化装置将在步骤(h)中分离的核酸分配/分发在步骤(i)的已分配的试剂混合物中，(k)以自动化设置检测/监测/分析步骤(j)的已分配的溶液中表位特异性CTL相关的转录物的体内水平，和(1)鉴定能够改变所述受试者的免疫学状态的试剂，由此，在步骤(a)的试剂已经存在于受试者中的情况下，省略步骤(a)。本发明还涉及包含能够执行至少上面步骤(C)的组分的试剂盒。该试剂盒可以包含能够执行一个或多个其他步骤的另外的试剂和说明书。本文的公开内容为技术人员教导了构建所需的试剂盒所必需的组分。根据本发明，在疾病的情况下，或所述受试者中存在移植物的情况下可以存在一种或多种免疫调节剂。在本发明中，“表位特异性CTL相关的转录物”可以是编码细胞因子、细胞因子受体、细胞毒素(如粒酶、穿孔蛋白等)、TNF相关的细胞因子受体超家族的成员和它们的配体(例如，Fas和Fas配体)或其他细胞受体的转录物。本发明还描述了鉴定能够改变受试者的免疫学状态的试剂的方法(a)将一种或多种免疫调节剂施用于受试者，(b)从所述受试者取样全血，(c)使用如上所述的装置或试剂盒，使用与步骤(a)中施用的相同/相似和/或不同的免疫调节剂使步骤(b)的全血样品中存在的血细胞脉动，(d)将步骤(C)的脉动的血细胞或步骤(b)的非脉动的血细胞收集在管中，所述管包含抑制RNA降解和/或基因诱导的化合物，或将所述化合物加入至脉动的/非脉动的细胞，(e)形成包含核酸的沉淀物，(f)将步骤(e)的所述沉淀物与上清液分开，(g)使用缓冲液溶解步骤(f)的所述沉淀物，形成混悬液，(h)使用自动化装置从步骤(g)的所述混悬液中分离核酸，(i)使用自动化装置分配/分发用于RT-PCR的试剂混合物，(j)使用自动化装置将在步骤(h)中分离的核酸分配/分发在步骤(i)的已分配的试剂混合物中，(k)以自动化设置检测/监测/分析步骤(j)的已分配的溶液中免疫相关的转录物的体内水平，和(1)鉴定能够改变所述受试者的免疫学状态的试剂，由此，在步骤(a)的试剂已经存在于受试者中的情况下，省略步骤(a)。本发明还涉及包含能够执行至少上面步骤(C)的组分的试剂盒。该试剂盒可以包含能够执行一个或多个其他步骤的另外的试剂和说明书。本文的公开内容为技术人员教导了构建所需的试剂盒所必需的组分。在本发明中，“免疫相关的转录物”可以是编码例如，一种或多种细胞因子、一种或多种趋化因子、生长因子、细胞毒性标志物、转录因子、TNF相关的细胞因子受体超家族的成员和它们的配体、或已知的或待发现的与免疫系统的活化相关的任何标志物。根据本发明，在疾病的情况下，或所述受试者中存在移植物的情况下可以存在一种或多种免疫调节剂。根据本发明的受试者可以是人或动物来源两者。本发明还提供了用于诊断/预后/监测影响受试者的免疫系统的临床状态的方法，该方法包括以下的步骤(a)从所述受试者取样全血，(b)使用如上所述的装置或试剂盒，使用与存在于所述受试者中的相同/相似和/或不同的免疫调节剂使步骤(a)的全血样品中存在的血细胞脉动，(c)将步骤(b)的脉动的血细胞收集在管中，所述管包含抑制RNA降解和/或基因诱导的化合物，或将所述化合物加入至脉动的细胞，(d)形成包含核酸的沉淀物，(e)将步骤(d)的所述沉淀物与上清液分开，(f)使用缓冲液溶解步骤(e)的所述沉淀物，形成混悬液，(g)使用自动化装置从步骤(f)的所述混悬液中分离核酸，(h)使用自动化装置分配/分发用于RT-PCR的试剂混合物，(i)使用自动化装置将在步骤(g)中分离的核酸分配/分发在步骤(h)的已分配的试剂混合物中，(j)以自动化设置检测/监测/分析步骤(i)的已分配的溶液中免疫相关的转录物的体内水平，和(k)检测/监测免疫相关的转录物的体内水平的变化，和(1)诊断/预后/监测影响免疫系统的疾病。在本发明中，“临床状态”是受试者的身体状况的任何变化，诸如不同的疾病或移植物的存在。本发明还涉及包含能够执行至少上面步骤(C)的组分的试剂盒。该试剂盒可以包含能够执行一个或多个其他步骤的另外的试剂和说明书。本文的公开内容为技术人员教导了构建所需的试剂盒所必需的组分。除非另外规定，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员所普遍理解的相同含义。示例性的方法和材料如下所述，尽管在实施或测试本发明时可以使用与本文所述的那些相似的或等价的方法和材料。本文提及的所有出版物和其他参考文献的全部内容通过引用合并。在有冲突的情况下，适用本说明书，包括定义。材料、方法和实施例仅是说明性的，且不意在是限制性的。从下面的附图、详述和权利要求，本发明的其他特征和优点将是显而易见的。附Ia-Id描绘了根据本发明的器皿和方法的实施例。图Ia显示器皿1，其中存在抗原微粒2。所述器皿装配有用于注射器针的入口的可再密封设备3。容器4也是器皿1的一部分；稳定剂5存在于该容器中；且器皿1的内部和容器4的内部之间的连接临时地被物理屏障阻断，在此例中，物理屏障是插塞25。传递物理力以移去插塞的设备以柱塞28的形式提供。在此实施例中，柱塞被帽23覆盖。在图Ib中，生物样品M通过注射器针6通过入口的可再密封设备3被引入至器皿中，并容许生物样品M暴露于抗原2。在图Ic中，柱塞帽23被取出26。在图Id中，引入轴杆7并向其施加压力27，因此迫使柱塞28推动插塞25远离容器4。在取出插塞25时，稳定剂5释放至器皿1中并允许与生物样品M和抗原2混合。图2描绘了根据本发明的其中存在抗原2的器皿1的实施例。该器皿可以是顶部开口的7，如图上所示，或可以装配有用于引入样品或稳定剂的封闭物或设备，其实例显示在图3-6中。器皿1的体部也可以包括其中存在有稳定剂的容器，如图7和8中所示。图3描绘了适合于图2中所示的器皿的类型的配件的实施例。器皿的顶部7装配有鲁尔型配件8，该配件可以接纳注射器11上的互补的鲁尔型配件。该注射器可以装有根据本发明的实施方案的生物样品或稳定剂。图4描绘了适合于图2中所示的器皿的类型的配件的实施例。器皿的顶部7装配有可再密封的隔膜9，所述隔膜可以接纳注射器针。该注射器可以装有根据本发明的实施方案的生物样品或稳定剂。图5描绘适合于图2中所示的器皿的类型的配件的实施例。器皿的顶部7装配有使用螺帽10接纳的设备。图6描绘适合于图2中所示的器皿的类型的配件的实施例。器皿的顶部7装配有皮下注射器针19。该器皿可以直接用来从个体抽取样品。图7描绘了器皿1的体部的实施例，其可以例如与图2-6中显示的器皿和配件组合使用。其中存在有抗原2的器皿1包括其中存在有稳定剂5的容器12。容器的壁全部或部分由在施加某种力时破碎的材料15制成。该容器装配有用来传送来自用户的力从而使容器的一部分或全部破碎的设备，包括与尖锐点(sharppoint)14连接的可按压区域13。在压下区域13时，尖锐点14接触可破碎材料15，使其破碎，从而去除容器和器皿之间的物理屏障，允许在由用户确定的时刻使稳定剂流动至器皿1中。图8描绘了器皿1的体部的实施例，其可以例如与图2-6中显示的器皿和配件组合使用。其中存在有抗原2的器皿1包括其中存在有稳定剂5的容器16。容器和器皿17的内部之间的连接被隔膜18物理地阻断，隔膜18可以通过施加力而破裂。在挤压容器16的壁时，压力传送至隔膜，导致隔膜破裂，从而允许稳定剂5进入至器皿1中。图9描绘了本发明的容器20的实施例，其不与器皿连接。稳定剂5存在于容器20中，且容器20装配有适合于与具有互补的配件的器皿联接的鲁尔型配件22(例如，如图3和图11中所示)。容器20的壁可以是可挤压的，能够在向其施加力时使稳定剂离开。图10描绘了本发明的容器四的实施例，其不与器皿连接。稳定剂5存在于容器29中，且容器四装配有用于与具有互补的配件的器皿联接的鲁尔型配件22(例如，如图3和图11中所示)。所述器皿进一步装配有柱塞30，在其上施加力能够使稳定剂5离开。图11描绘了根据本发明的试剂盒的实施例，其包括装配有鲁尔型配件8的器皿1，并且在此例中，包括允许被置换的空气离开器皿的阀31。该试剂盒还包括容器四，类似于图10中所描绘地，容器29中存在有稳定剂5。器皿8上的配件能够与容器22上的配件联接。图12a_12d描绘了根据本发明的对照器皿和方法的实施例。图12a显示其中存在有对照物质35的对照器皿37。对照器皿装配有用于注射器针的入口的可再密封设备3'。对照容器4'也是对照器皿37的一部分；稳定剂5'存在于对照容器中；且对照器皿37的内部和对照容器4'的内部之间的连接临时地被物理屏障阻断，在此例中，物理屏障是插塞25'。传递物理力以移去插塞的设备以柱塞28'的形式提供。在此实施例中，柱塞被帽23'覆盖。在图12b中，生物样品24通过注射器针6'，经由入口的可再密封设备3'被引入至对照器皿中，并容许生物样品24暴露于对照物质35。在图12c中，柱塞帽23'被取出26'。在图12d中，引入轴杆7'并向其施加压力27'，因此迫使柱塞28'推动插塞25'远离对照容器4'。在取出插塞25'时，稳定剂5'释放至对照器皿37中并允许与生物样品24和对照物质35混合。图13描绘了根据本发明的其中存在对照物质35的对照器皿37的实施例。该对照器皿37可以是顶部开口的7'，如图上所示，或可以装配有用于引入样品或稳定剂的封闭物或设备，其实例显示在图14-16中。对照器皿37的体部也可以包括其中存在有稳定剂的对照容器12',16'，如图17和18中所示。图14描绘了适合于图13中所示的对照器皿的类型的配件的实施例。对照器皿35的顶部7'装配有鲁尔型配件8'，该配件可以接纳注射器11'上的互补的鲁尔型配件。该注射器可以装有根据本发明的实施方案的生物样品或稳定剂。图15描绘了适合于图13中所示的对照器皿的类型的配件的实施例。对照器皿37的顶部7'装配有可再密封的隔膜9'，所述隔膜可以接纳注射器针。该注射器可以装有根据本发明的实施方案的生物样品或稳定剂。图16描绘了适合于图37中所示的对照器皿37的类型的配件的实施例。对照器皿37的顶部7'装配有使用螺帽10'接纳的设备。图17描绘了对照器皿37的体部的实施例，其可以例如与图14_16中显示的对照器皿和配件组合使用。其中存在有对照物质35的对照器皿37包括其中存在有稳定剂5'的对照容器12'。对照容器的壁全部或部分由在施加某种力时破碎的材料15'制成。该对照容器装配有用来传送来自用户的力从而使对照容器的一部分或全部破碎的设备，包括与尖锐点14'连接的可按压区域13'。在压下区域13'时，尖锐点14'接触可破碎材料15'，使其破碎，从而去除对照容器和对照器皿之间的物理屏障，允许在由用户确定的时刻使稳定剂流动至对照器皿37中。图18描绘了对照器皿37的体部的实施例，其可以例如与图14-16中显示的对照器皿和配件组合使用。其中存在有对照物35的对照器皿37包括其中存在有稳定剂5的对照容器16'。对照容器和对照器皿37的内部之间的连接被隔膜18'物理地阻断，隔膜18'可以通过施加力而破裂。在挤压对照容器16'的壁时，压力传送至隔膜，导致隔膜破裂，从而允许稳定剂5进入至对照器皿37中。图19描绘了本发明的装置的实施例，所述装置包括如图17中所述的对照器皿37，所述对照器皿37的外部通过桥接元件70与如图7中所述的器皿1连接。该装置容许生物样品在稳定剂5之前，分别地递送至第一物质2和对照物质35。因为反应样品和对照样品并行地(side-by-side)保持，因此避免了随着混合对照样品和反应样品而出现的误差。图20描绘了本发明的装置的实施例，所述装置包括如图18中所述的对照器皿37，所述对照器皿37的外部通过桥接元件70与如图8中所述的器皿1机械地连接。该装置容许生物样品在稳定剂5之前，分别地递送至第一样品2和对照物质35。因为反应样品和对照样品并行地保持，因此避免了随着混合对照样品和反应样品而出现的误差。图21a显示了本发明的用于接受液体生物样品的装置30的实施例的示意图，该装置有助于使所述样品分别地暴露于第一物质和对照物质，并随后暴露于核酸稳定剂。该装置包括其中存在有第一物质2的第一室32，其中存在有对照物质35的第二室34，其中存在有稳定剂5的第三室36，用于生物样品管的支架52，所述支架为圆柱形开口。每个室形成为实体材料44的块料中的开口。每个室用配置有可再密封的隔膜38，40，42的盖子46，48，50密封，所述隔膜可以用空心针诸如皮下套管针或针刺破。该装置进一步配置有用于传输管的支架，所述支架采取两个槽M，56的形式，所述槽适于接纳传输管的针末端。图21b描绘了沿线A-A'穿过本发明的装置的横截面，其详细地显示了第二(对照)室34和第三(稳定剂)室36的内容物。图22显示了本发明的传输管60的横截面视图，所述传输管包括空心细长管64，由此所述管的各末端配置有空心针(例如，套管针或皮下注射针)62，66。传输管60被设定成液体可以通过一根针62沿管64流动至另一根针66。在显示的实施方案中，针62，66具有不相等的长度。图23显示了本发明的加压管88的横截面视图，所述加压管包括中空的柔性细长管82，由此管的一端与空心针(例如，套管针或皮下注射器针)80连接且另一端85适于连接(加压或抽出)气体介质(例如，空气)泵86的出口接口87。加压管88被设定成刺穿器皿、或室的隔膜，并且通过抽出或引入气体介质(例如空气)来在其中建立压差。图M显示组合装置组的横截面视图，所述组合装置组包括本发明的加压管88和传输管60。传输管60的一根针62使用一个或多个接头84连接至加压管88的针80，以使得两根针62，80平行对齐。因此，隔膜被两根针62，80同时刺穿。图25显示具有指示的尺寸的本发明的传输管60的横截面视图。D代表两根针62，66之间的最小距离。Ll是一根针的长度，具体是直的部分，L2是另一根针的长度，具体是直的部分，L3是第一假想直线65上的距离，其从针62，66的直线部分朝向管64延伸，其距离L3被针的直线部分的端部67限定，并且点69是第二假想直线63与第一假想直线65交汇处，第二假想直线63与管64的顶部相交。图沈-四显示如图21a中显示的装置30使用中的实施例。在图沈中，包含液体生物样品(例如，血液，尿)的生物样品管58被插入至管支架52中。传输管60的一端通过隔膜61插入至生物样品管58中，另一端通过隔膜40插入至第二(对照)室34中。液体生物样品从生物样品管58沿传输管60在箭头的方向上流动，并且进入第二室34中，在此其接触对照物质35。液体生物样品可以通过使用加压管88(未显示)来推动，加压管的针可以刺破第二室34的隔膜38且建立真空，或刺破生物样品管58的隔膜61且其中的压力增加。在图27中，传输管已经被取出并重新插入，使得传输管60在第二室34中的末端通过隔膜38位于第一室32中，同时传输管60在生物样品管58中的末端仍在原处。液体生物样品从生物样品管58沿传输管60在箭头的方向上流动，并进入第一室32中，在此其接触第一物质2(脉动剂)。液体生物样品可以通过使用加压管88(未显示)来推动，加压管的针可以刺破第一室32的隔膜40且建立真空，或刺破生物样品管58的隔膜61且其中的压力增加。图28显示转移液体生物样品后传输管60的冲洗，所述冲洗通过取出和重新插入传输管60使得以前与生物样品管58接触的传输管60的末端通过隔膜42插入至第三(稳定剂)室36中，且传输管60的另一端通过隔膜61插入至生物样品管58中。液体稳定剂5从第三室36沿传输管60在箭头的方向上流动，并进入生物样品管58中，在此其作为废液保存或用于进一步处理。液体稳定剂5可以通过使用加压管88(未显示)来推动，加压管的针可以刺破第三室36的隔膜42且其中的压力增加，或刺破生物样品管58的隔膜61且建立真空。需注意冲洗后，允许样品温育。温育时间和温度将取决于几个因素包括脉动剂，样品以及试剂的体积和浓度。对于一般原则，温育可以在37°C下进行30分钟-16小时，最典型地2-4小时。在图四中，传输管60被取出并重新插入，使得一端通过隔膜42插入至第三(稳定剂)室36中，且另一端通过隔膜40插入至第二(对照)室34中。液体稳定剂5从第三室36沿传输管60在箭头的方向上流动，并进入第二室34中，在此其接触生物样品和对照物质2的混合物。液体稳定剂5可以通过使用加压管88(未显示)来推动，加压管的针可以刺破第三室36的隔膜42且其中的压力增加，或刺破第二室34的隔膜40且建立真空。在图30中，传输管60被取出并重新插入，使得一端通过隔膜42插入至第三(稳定剂)室36中，且另一端通过隔膜38插入至第一(脉动反应)室32中。液体稳定剂从第三室36沿传输管60在箭头的方向上流动，并进入第一室32中，在此其接触生物样品和第一物质35的混合物。液体稳定剂5可以通过使用加压管88(未显示)来推动，加压管的针可以刺破第三室36的隔膜42且其中的压力增加，或刺破第一室32的隔膜38且建立真空。在程序结束时，第一室和第二室均接收了生物样品和稳定剂。由传输管60和加压管88在使用时引起的移动可以通过机器人来驱动，例如，通过使用具有若干移动自由度的机械手或通过X-Y机器人平台(robotictable)来驱动。当采用机器人驱动时，传输管将典型地包括刚性管64，该刚性管允许精确地夹持和定位传输管60。图31.1-31.4给定实施例中采取的策略。图31.1针对破伤风类毒素的免疫应答的离体监测。图31.2实施例3中采取的策略。图31.3实施例4中采取的策略。图31.4实施例5中采取的策略。图32.1针对外周血中IFN-γ和IL-IOmRNA自然产物的RT-PCR0如所述的那样从来自6名不同的健康志愿者(柱1-6)的全血和PBMC中提取总RNA。全血在采集样品后的1分钟内将0.6ml全血与6mlCatrimox-14混合。然后样品以12000g离心5min。得到的核酸沉淀物小心地用水洗涤，并溶解在ImlTripure中。然后根据Tripure生产商的说明书进行RNA提取。PBMC根据标准程序从15ml肝素化静脉血中制备细胞，且细胞溶解在ImlTripure中用于提取RNA。如(Stordeur等，(1995)，Pradier等，(1996))所述对于所有样品由IygSRNA开始进行关于IFN-γ，IL-10和管家基因HPRT的RT-PCR。图32.2针对全血中IFN-γ和IL-IOmRNA稳定性的实时PCR。从健康供体中采集柠檬酸化(citrated)静脉血的样品。从此样品中，在采血后1分钟内，和在5小时内的每小时后，将100μ1等分试样与900μ1Catrimox-14混合，在每次取等分试样之间简单地将血样保持在室温下。得到的核酸沉淀物(参见图13.1的图例)溶解在300μ1来自"MagNAPureLCmRNA分离试剂盒I〃(罗氏诊断(RocheDiagnostics)，分子生物化学品(MolecularBiochemicals))的溶解缓冲液中。使用MagNAPureLC仪器(罗氏诊断(RocheDiagnostics)，分子生物化学品(MolecularBiochemicals))根据生产商的说明书提取mRNA(最终洗脱体积100μ1)。根据"Lightcycler-RNAMaster杂交探针试剂盒〃(罗氏诊断(RocheDiagnostics)，分子生物化学品(MolecularBiochemicals))中所述的标准程序，从5μ1mRNA制剂开始，采用一步法进行逆转录和实时PCR。引物和探针序列，和PCR条件如Stordeur等，JImmunolMethods(免疫学方法杂志)，259(1-2)=55-64,2002)中所述。图33由PreAnalytiX提议的从全血提取RNA的方法与由本发明提议的方法相比的示意性比较。图34.破伤风类毒素对细胞因子血mRNA的离体诱导。破伤风类毒素(lOug/ml，Aventis)加入至采集自健康志愿者的500μ1全血，所述志愿者7年前针对破伤风进行过疫苗接种。在37°C在5%CO2气氛中经过不同的时间段后，加入1.4mlPAXgene管中包含的试剂。300μ1获得的溶解产物用来在MagNAPure仪器上分离总mRNA，且如本发明中所述进行RT-PCR。图35.用LPS刺激全血后IL-Iβ和IL-1RAmRNA动力学。200μ1肝素化血与IOng/mlLPS温育0(培养开始时)、0.5、1、2和6小时。在培养结束时，加入500μ1PAXgene管的试剂用于全部细胞溶解和核酸沉淀。然后如本发明中所述以一步式进行针对IL-Iβ、IL-IRA和β-肌动蛋白mRNA的RT和实时PCR。结果以每100万个β-肌动蛋白mRNA拷贝的mRNA拷贝数来表示。显示关于5次独立试验的平均数的平均数和标准误差。图36.线性回归关于初始血液体积的mRNA拷贝数。在lOng/mlLPS的存在下各种血液体积(范围从20至200μ1，Χ-轴)培养6小时。培养结束时，如本发明中所述进行针对IL-Iβ和β-肌动蛋白mRNA的RT和实时PCR。Y-轴代表原始拷贝数。该线用于线性回归。显示的一个试验代表6次。图37.用破伤风类毒素刺激全血后的mRNA细胞因子动力学。从5名健康志愿者中取肝素化血液，所述志愿者至少5年前针对破伤风进行过疫苗接种。对于每个供体，200μ1全血等分试样与10μg/ml破伤风类毒素温育0(培养开始时)、4、8、16、24和48小时。在培养结束时，加入500μ1PAXgene管中包含的试剂，并使用本发明的方法定量不同转录物。结果以每100万个β-肌动蛋白mRNA拷贝的mRNA拷贝数来表示。显示关于5次独立试验的平均数的平均数和标准误差。图38.静脉注射LPS后血液细胞因子mRNA的体内调节。5名健康志愿者注射以单剂量的4ng/kgLPS。LPS注射前10分钟，和LPS注射后0.5、1、1.5、2、3和6小时，PAXgene管中取2.5ml血样。根据本发明的方法进行细胞因子mRNA的定量。结果以每100万个β-肌动蛋白mRNA拷贝的mRNA拷贝数来表示。表示关于每个时间点的平均数的平均数和标准误差。图39.抗破伤风疫苗反应的随访。选择6名健康志愿者来接受抗破伤风回忆。从与(实心圆)或不与(空心圆)10yg/ml破伤风类毒素培养20小时的全血中定量IL-2mRNA水平，并在回忆时(第0天)、14天前和3、7、14、21和90天后(X-轴)进行。结果以每100万个β-肌动蛋白mRNA拷贝的mRNA拷贝数(Y-轴)来表示。6个图板的每一个(编号1-6)表示来自6个不同供体的个体数据(每个图板1个供体)。图40.在用于分析血液细胞因子mRNA表达的实施例7、8、9、10和11中采取的程序的概述。图41.在MagNAPure上自动化提取mRNA和制备试剂混合物初始生物材料的量和存在的拷贝数之间的直接相关性。Y-轴代表原始拷贝数。该线用于线性回归。图42.在MagNAPure上自动化提取mRNA和制备试剂混合物初始生物材料的量和存在的拷贝数之间的直接相关性。Y-轴代表原始拷贝数。该线用于线性回归。图43.参加癌症免疫治疗的患者的概括病例报告。于1999年7月诊断出黑素瘤。在2001年8月，证明多处转移，并且在2002年4月进行睾丸切除术(orchydectomy)后该患者立即参加接受癌症疫苗。该疫苗存在于MAGE-3纯化蛋白(由黑素瘤细胞特异性表达的抗原)与佐剂组合的若干注射中。图44.疫苗接种方案和通过实时PCR监测免疫应答的图示。体外刺激全血以评估对MAGE-3的免疫应答。患者接受3次疫苗注射，同时在9周的时间内一周一次取血样。每名患者的全血样品的200μ1等分试样在10μg/mlMAGE-3蛋白或作为阴型对照的10μg/mlTRAP(恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)抗原)的存在下温育。培养结束时，加入PAXgene管中包含的试剂从而能够如实施例6中所述进行IL-2mRNA定量。结果在图45中给出。图45.在患者#3中MAGE-3疫苗接种后全血中的IL_2mRNA。在MAGE-3疫苗加强免疫后，在MAGE-3刺激的全血中观察到较高的IL-2mRNA水平。Y-轴代表每100万个β-肌动蛋白mRNA拷贝的IL-2mRNA拷贝数，且X-轴是取血样时的周数。疫苗注射液在第0、2和6周时施用。实心柱用于存在MAGE-3时温育的全血，阴影线柱用于存在TRAP时温育的全血。图46.全血的体外刺激评价对变应原的免疫应答。进行试验，在全血与变应原温育后进行IL-4mRNA定量。从对猫具有变应性的一名受试者和从两名健康受试者中取血样。然后全血在不存在或存在猫变应原(即i^eldl)的条件下温育不同的培养时间段，温育结束时，加入PAXgene管中包含的试剂从而能够如实施例6中所述进行IL_4mRNA定量。结果在图47中给出。图47.全血的体外刺激评价对!^eldl的免疫应答。Feldl变应原显著诱导来自对猫具有变应性的受试者的全血中的IL-4mRNA水平高于无变应性的受试者。Y-轴代表每100万个β-肌动蛋白mRNA拷贝的IL-4mRNA拷贝数，且X-轴是不同的温育时间。绿色柱代表与变应原温育的正常全血中存在的IL-4mRNA水平，变应性受试者的全血中存在的IL-4mRNA水平由红色柱(在存在狗1(11的条件下温育的血液)和黄色柱(在不存在!^eldl的条件下温育的血液)表示。图48.在此全血系统中对!^eldl的应答是特异性的和剂量相关的。来自变应原性受试者的全血1)在增加浓度的i^eldl的存在下(斜线阴影柱)；幻在另一种变应原10μg/ml的乳球蛋白(BLG)的存在下(水平虚线阴影柱)；3)在交联的IgE(斑点柱)的存在下温育2小时。Y-轴代表每100万个β-肌动蛋白mRNA拷贝的IL_4mRNA拷贝数。图49.在对猫具有变应性的患者中用Feldl刺激全血后的IL_4mRNA水平高于健康对照。对来自10名健康受试者(CTR柱)和10名对猫具有变应性的患者(ALL柱)的血样重复进行幻灯片9-11上所述的试验。全血样品在IOygFeldl的存在下或在作为阳性对照的交联IgE的存在下温育2小时。显示平均数和平均数的标准误差。图50.全血的体外刺激评估对GAD65的T细胞应答。图示在全血与纯化的GAD65蛋白温育后为了IL-2mRNA定量进行的试验。血样取自6名1型糖尿病患者，和5名健康受试者。然后全血在不存在或存在10μg/mlGAD65的条件下温育18小时，然后通过加入PAXgene管中包含的试剂终止培养。然后如实施例6中所述定量IL_2mRNA水平。结果在图51中给出。图51.全血的体外刺激评估对GAD65的T细胞应答。与健康受试者相比，来自1型糖尿病患者的全血在GAD65刺激后显示出较高的IL-2mRNA水平。结果表示为在针对β-肌动蛋白校正后，相对于在不存在GAD65时培养的全血中存在的拷贝数计算的IL-2mRNA拷贝数。使用对数标度。显示平均数和平均数的标准误差。健康供体CTR柱；自身免疫糖尿病患者PAT柱。图52.监测同种异体反应性(alloreactive)免疫应答全血+树突细胞系统中IL-2mRNA的定量。在全血与不相关的树突细胞(DC)温育后为了IL_2mRNA定量进行试验以评估同种异体反应性T细胞应答。在IL-4和GM-CSF的存在下，来自两名不相关的健康志愿者(MT和MA)的树突细胞在体外产生。来自每名供体的全血样品在另一名供体的树突细胞群的存在下⑴或在它们自身的树突细胞的存在下⑵培养。将来自两名供体的全血样品混合(3)，以及混合两个树突细胞制剂(4)。温育12小时后，通过加入PAXgene管中包含的试剂终止培养。然后如实施例6中所述定量IL-2mRNA水平。结果显示在图53中。图53.监测同种异体反应性免疫应答全血+树突细胞系统中IL-2mRNA的定量。通过全血中IL-2mRNA定量评估同种异体反应性T细胞应答。显示每100万个β-肌动蛋白mRNA拷贝的IL-2mRNA拷贝数。条件从左到右为单独的来自供体MA的全血，来自供体MA的全血+来自供体MA的DC，来自供体MA的全血+来自供体MT的DC，单独的来自供体MT的全血，来自供体MT的全血+来自供体MT的DC，来自供体MT的全血+来自供体MA的DC,来自供体MT的全血+来自供体MA的全血，来自供体MT的DC+来自供体MA的DC。实施例实施例1外周血中自发细胞因子mRNA的分析由外周血细胞合成的细胞因子mRNA的定量应该有可能估计“外周免疫状态”。然而，仅可以从新鲜的全血样品中进行精确的定量，在新鲜全血中mRNA被保护不被核酸酶消化，且其中基因转录被抑制。如就此方面所讨论的那样，通过使用表面活性剂试剂诸如十四烷基三甲基草酸铵这已经变得可能。进行RT-PCR以定量在外周血中自发产生的IL-10和IFN-YmRNA。结果显示与来自相同个体的外周血单核细胞(PBMC)相比，全血中IFN-γ转录物水平较高，而对IL-10mRNA没有观察到显著差异。在血液中观察到的较高量的IFN-γmRNA可以至少归因于mRNA的降解。使用实时PCR技术，可以实际地证明血液IFN-YmRNA在体外快速地降解，在室温下相当于约1小时。HSrtel等最近分析了细胞纯化程序对外周血中自发细胞因子mRNA生成的影响(Hartel等，2001)。它们显示新鲜分离的外周血单核细胞(PBMC)与从相同个体新鲜采集的全血相比，表达更高水平的IL-2、IL-4和TNF-αmRNA,而IFN-ymRNA水平没有观察到差异。在6个不同的个体中进行IFN-γ的比较，并且发现了不同的结果。观察到在所有供体的全血中IFN-YmRNA的强表达，其在PBMC中是明显降低的(图32.1)。获得的结果和HSrtel等的结果之间的此差异可能与用来从全血中分离总RNA的程序相关，尽管事实是后者使用了定量实时PCR技术。HSrtel等使用了肝素化血液，其在2小时内通过等渗的氯化铵处理来溶血。在本发明的方法中使用了十四烷基三甲基草酸铵，一种称为Catrimox-14的阳离子表面活性剂试剂Oliagen，ffestburg,Leusden，荷兰)，其与血液直接混合，避免了使用抗凝剂(Dahle和Macfarlane，(1993)fchmidt等，(19%))。此外，此试剂在采集样品后的1分钟内诱导核酸沉淀和核酸酶抑制。这提供了总RNA制剂，其可能最接近体内mRNA状态。这对于细胞因子mRNA是特别重要的，由于位于其3'非翻译区中的富含AU的序列使得其对内源性核酸酶敏感。使用实时PCR技术，事实上观察到外周血IFN-YmRNA自发并且快速降解，在采集血液后1小时该水平已经降低了大致50%。然而，此现象对于所有细胞因子并不都正确，因为发现IL-IOmRNA水平在采血后稳定至少5个小时(图32.2)。此外，全血的IL-IOmRNA水平与PBMC的IL-IOmRNA水平相比没有发现显著的差异(图32.1)。在Catrimox-14溶解后获得的核酸沉淀物(参见图32.1的图例)可以溶解在由Chomczynski和Mcchi(1987)所述的胍/硫氰酸盐溶液，以及其商购形式诸如Tripure(罗氏诊断(RocheDiagnostics)，分子生物化学品(MolecularBiochemicals)，Brussels，比利时)中，使得此表面活性剂的应用特别容易。这意味着，除了使用Catrimox-14的第一步骤以外，RNA分离程序与对于全血和细胞是相同的。备选地，PAXgene血液RNA管^!iagen，ffestburg,Leusden，荷兰)可以用来代替Catrimox-14。在此情况下，得到的沉淀物可以溶解在"MagNAPureLCmRNA分离试剂盒I“的溶解缓冲液中，如在图32.2的图例中对于Catrimox-14所述的那样。表征人单核血细胞的自发IL-10mRNA产生(Mordeur等，(1995))，和监测0KT3单克隆抗体对体内组织因子mRNA的诱导(Pradier等，(1996))，代表了其中成功使用Catrimox-14的两个实例。在向全血加入离子载体A23187+佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯(phorbolmyristateacetate)后也观察到强的IL-2mRNA诱导(未显示)，提示其在对全血的体外研究中的应用。在本实施例中得到的观察突出了尽可能快地从溶解的全血中进行RT-PCR的重要性，从而精确地定量外周血细胞因子mRNA。为此目的，使用试剂诸如Catrimox-14或PAXgene血液RNA管中包含的添加剂，以及实时RT-PCR，可能代表了目前最佳的程序。通过这样做，有可能在不使用体外强刺激物诸如离子霉素(ionomycin)或植物凝血素的条件下对外周血细胞的天然状态进行研究。实施例2:PAXgene血液RNA系统和根据本发明提议的方法之间的比较"PAXgene血液RNA系统”是指PAXgene血液RNA管”与“PAXgene血液RNA试剂盒”的组合。“Qiagen方法”是指“PAXgene血液RNA试剂盒”。基于Mordeur等，JImmunolMethods(免疫学方法杂志)，259(1-2):55-64,2002中所述的试验证据，本发明提出一种新的程序来从全血中分离mRNA，其能够使用一种容易和可再现的方法来测定体内转录物水平。PAXgene血液RNA系统和根据本发明的方法在图33中进行了示意性地比较。材料和方法从如由PAXgene血液RNA系统^jiagen)所推荐的那样直接采集在PAXgene血液RNA管中的外周静脉血进行所有试验(即，2.5ml血液真空采集在试管内，该试管含有6.9ml未知试剂)。在溶解结束后，试管的内容物转移至两个其他的试管中4.7ml用于PAXgene血液RNA试剂盒，0.4ml用于MagNAPure提取。弃去剩余的溶胞产物。这两个试管以2，OOOg离心lOmin，并弃去上清液。核酸沉淀物然后a)PAXgene血液RNA管+PAXgene血液RNA试剂盒..在水中洗涤，然后溶解在BRl缓冲液中用于总RNA提取，如相应的说明书手册中推荐的那样。PAXgene血液RNA系统的程序如下血样(2.5ml)采集在PAXgene血液RNA管中，并且如果需要在室温下保存或运输。RNA分离以离心步骤开始，使核酸沉淀在PAXgene血液RNA管中。洗涤沉淀物，并且加入蛋白酶K以进行蛋白消化。加入醇以调节结合条件，并将样品应用于由PAXgene血液RNA试剂盒提供的离心吸附柱(spincolumn)0在简短的离心期间，在污染物通过时RNA选择性地结合于由PAXgene血液RNA试剂盒提供的硅胶膜。在洗涤步骤后，RNA在优化的缓冲液中洗脱。如Mordeur等(〃CytokinemRNAQuantificationbyRealTimePCR(通过实时PCR定量细胞因子mRNA)"JImmunolMethods(免疫学方法杂志)，259(1_2)=55-64,2002)所述进行针对IFN-Y和β-肌动蛋白mRNA的逆转录和实时PCR。-b)PAXgenea血液RNA管++MagNAPureLCmRNA分离试剂盒I-...溶解在300μ1来自MagNAPuremRNA分离试剂盒的溶解缓冲液中。然后在MagNAPureLC仪器上，根据来自罗氏诊断(RocheDiagnostics)、分子生物化学品(MolecularBiochemical)的说明书，以100μ1的最终洗脱体积进行mRNA的提取和纯化。根据"Lightcycler-RNAMaster杂交探针试剂盒〃(罗氏诊断(RocheDiagnostics)，分子生物化学品(MolecularBiochemicals))中所述的标准程序，从5μ1mRNA制剂开始，采用一步法进行逆转录和实时PCR0结果由Qiagen推荐的提取方法与PAXgene血液RNA管(PAXgene血液RNA系统)的结合，和也与PAXgene血液RNA管结合的MagNAPureLC仪器提起法进行比较。在两个方法中，PAXgene血液RNA管的使用能够稳定来自血细胞的RNA。结果列举在表1.1和1.2中。此试验的结果显示MagNAPureLC技术具有较好的再现性(对于针对β-肌动蛋白校正的IFN-γmRNA拷贝数的变化系数，Qiagen与MagNAPureLC相比分别为洸％和16%)。有趣地注意到进行MagNAPure提取的初始血液体积比Qiagen方法所使用的体积小(对于MagNAPure为0.11ml，相比对于Qiagen为1.25ml)。如果使用这样小的体积进行Qiagen方法，则不可能测量RNA浓度，甚至不可能进行逆转录。这就突出了本发明中所述的技术的另一个优势以非常小的血液体积(约100μ1)定量mRNA的可能性。结论实施例2举例说明了使用PAXgene血液RNA管结合MagNAPureLCmRNA分离试剂盒I的可能性，或更准确地，将来自PAXgene血液RNA管的沉淀物溶解在该试剂盒中包含的溶解缓冲液中的可能性，此溶解缓冲液一定要与该试剂盒的其他组分一起使用。在此实施例中，证明了与其他组合相反，仅本发明中所述的组合导致正确/真实的体内转录物定量。实施例3离体监测针对破伤风类毒素的免疫应答。在实施例3中，血液离体用抗原(即，破伤风类毒素)刺激，血液供体应该针对该抗原免疫(因为7年前进行了疫苗接种)。根据该方法进行RT-PCR(图31.1)。细胞因子mRNA测量为志愿者的免疫系统针对该抗原反应的能力的读数。IL-2，IL_4，IL-13和IFN-γmRNA优先进行分析，但所有潜在的反应性蛋白可以通过它们相应的mRNA的定量来分析。实施例3的结果显示在图34中。此实施例中遵照的大体策略可以如图31.2中所示来示意性地表示。可能应用的实施例癌症免疫治疗一些年来，对于癌症免疫治疗的基本策略以疫苗接种的方式发展。事实上，在遗传学和免疫学方面的进展已经能够鉴定许多生长肿瘤抗原，它们表达至肿瘤细胞的表面。这些抗原以与主要组织相容性复合物(HLA)相关的肽的形式呈递至肿瘤细胞的表面。可以被认为是肿瘤抗原的抗原的实例由Fong和Engleman(Annu.Rev.Immunol.(免疫学年度评论)2000.18245-273)所述。抗癌疫苗接种的原理在于遵照最强免疫原性的方式将这些抗原呈递至患者的系统免疫。这从在添加剂的存在下注射抗原或相应的肽开始，然后在自身抗原呈递细胞(例如，树突细胞)上呈递所述肽。尽管抗癌疫苗接种的最终目的仍然是使肿瘤消退，但确定抗癌疫苗接种的功效仍然是困难的，尤其是在患者处于疾病晚期的情况下，其仅能利用有限的治疗窗。这就是为什么抗癌疫苗接种作为辅助疗法或在预防的框架内令人特别感兴趣的原因。因此开发灵敏的和精确的监测技术来评价实验性抗癌疫苗接种的免疫学效果以便规定这些疫苗的施用方法并发现隐含的生物学机制是非常重要的，这将有助于更好地确定未来的治疗方案。测量这些疫苗的免疫学功效的困难主要在于缺少足以灵敏地检测体内细胞免疫应答的测定。迄今为止，使用的技术包括在抗原的存在下和在易于诱导淋巴细胞的初始功能特性改变的共刺激分子的存在下长时间地集中的体外培养患者的PBMC。因此，对淋巴细胞前体针对肿瘤抗原的无反应性状态或耐受状态的分析是极端困难的，这鉴于它们在抗原的存在下的较长时间体外温育后它们的功能状态的可逆天性。另一方面，用于检测低频率的表位特异性CTL前体的基于MHC-肽复合物的四聚物的技术通常缺乏检测肿瘤特异性淋巴细胞的灵敏度。另外这些技术不提供关于这些淋巴细胞的功能反应性的任何信息。仅足够灵敏从而能够例如，在体外用抗原非常短时间刺激后检测淋巴细胞对给定抗原的原始功能反应性的技术才能允许真正的评价抗癌疫苗接种方案的功效。近年来己经显示(Kammula,U.S.，Marincola,F.M.，禾口Rosenberg,S.Α.(2000)Real-timequantitativepolymerasechainreactionassessmentofimmunereactivityinmelanomapatientsaftertumorpeptidevaccinationB^t/^MIK'pfSI链式反应评估在肿瘤肽疫苗接种后黑素瘤患者的免疫反应性)·J.Natl.CancerInst.(国家癌症协会杂志)921336-44)，检测与PBMC的短时间体外刺激(2小时)相关的细胞因子mRNA能够检测经历用肿瘤抗原疫苗接种的患者的PBMC中的表位特异性CTL。然而，根据本发明此短时间的离体脉动不是必要的。实施例4检测由供体的组织相容性抗原引起的受体免疫系统的活化。在实施例4中，来自供体的器官(例如，肝、肾、骨髓等)移植至受体中。受体的全血采集在包含根据本发明的抑制RNA降解和/或基因诱导的化合物的试管中。根据该方法进行RT-PCR。细胞因子mRNA测量为由供体的组织相容性抗原引起的受体的免疫系统的活化的读数(图31.3)。实施例5检测受体的免疫系统对供体的组织相容性抗原的反应性。在实施例5中，来自供体的器官(例如，肝、肾、骨髓等)移植至受体中。受体的全血采集在试管中，并与供体的组织相容性抗原离体温育。根据本发明的抑制RNA降解和/或基因诱导的化合物加入至血液中。根据该方法进行RT-PCR。细胞因子mRNA测量为由供体的组织相容性抗原引起的受体的免疫系统的应答的读数(图31.4)。应用实施例监测器官移植后的排斥监测移植物的排斥基本上基于在患者的尿或血液中(在肾脏移植物的情况下的血液尿素氮-BIN-或肌酸酐)或在分析移植的器官的活组织检查时测量到的标志物的检测。然而这些指标仅当排斥机制已经充分进展时被检测到。事实上，移植物排斥是先于移植器官破坏的免疫学机制的结果。在移植器官受损之前检测这些免疫学机制将能够通过较早地调节免疫抑制治疗而相当可观地减少移植器官的损失。另一方面，也认识到在移植后频繁地发生排斥的亚临床事件(没有诱发临床体征)。这些亚临床排斥事件可能是慢性排斥的原因。几个作者已经研究了检测器官排斥的早期免疫学标志物，和具体地，检测受体循环中的针对供体的同种异体抗原的同种异体反应性T淋巴细胞。方法基本上包括将混合培养物与通过不同方法(ELISA，ELISP0T，流式细胞计数等)连续测量受者的淋巴细胞增殖或测量细胞因子的产生相结合。最近，其他作者已经关注表征淋巴细胞激活标志物模式，其易于早期强调引发排斥机制。通过灵敏的定量PCR法检测由活化的细胞毒性活化T淋巴细胞T表达的基因(粒酶B，穿孔蛋白，不同的细胞因子)的mRNA显示是测量引发排斥的优异工具。为此目的，根据本发明，可以研究编码不同种类的细胞因子的信使，优选的靶标可以是IL-2，IFN-y,IL-4，IL-5，粒酶，穿孔蛋白和FasFas-配体。实施例6使用实时PCR的全血中的免疫监测。在实施例6中，描述了全血方法，其能够在mRNA水平测量细胞因子合成的诱导。此方法的创意在于用于采血的含有mRNA稳定剂的PAXgene管，作为用于提取mRNA和制备RT-PCR试剂混合物的自动化系统的MagNAPure仪器，和关于用于精确的和可再现的定量转录物水平的在Lightcycler的实时PCR方法学的组合。此实施例首先证明此方法足以测量在向全血加入细菌脂多糖(LPS)时的IL(白介素)_1β和IL-I受体拮抗剂(IL-IRA)mRNA的诱导。此实施例进一步证明此方式还适合于检测与破伤风类毒素温育的全血(作为对回忆抗原的体外免疫应答模型)中编码T细胞来源的细胞因子的mRNA的产生。最后，该实施例证明此方法学可以成功地用来评价体内的炎性应答以及T细胞应答，因为其能够检测健康志愿者中注射LPS后IL-Iβ和IL-IRA的诱导，还可以检测在使用破伤风疫苗回忆免疫时的IL-2的诱导。材料和方法用于体内研究的血液采集。为了精确的定量外周血mRNA水平，取2.5-ml血样于PAXgene管中立即用于细胞溶解和核酸沉淀。在此血液溶胞产物中mRNA稳定至多5天，该管保持在室温下直至mRNA提取。体外全血培养。对200μ1肝素化全血，并且在采血后最晚4个小时时开始进行体外全血LPS刺激或破伤风类毒素再攻击。通过加入500μ1PAXgene管的试剂终止培养，其诱导全部细胞溶解和mRNA稳定。这样能够使用相同的mRNA提取方案用于体外和体内研究两者。mRNA提取。在PAXgene管中或在全血培养结束时获得的血液溶胞产物简短地混合，然后转移300μ1等分试样至1.5-ml印pendorf管中用于以最大速度离心5分钟(12，000-16,OOOg,取决于装置)。弃去上清液，核酸沉淀物通过涡旋而充分溶解在MagNAPuremRNA提取试剂盒(罗氏应用科学(RocheAppliedScience))中包含的300μ1溶解缓冲液中。然后在MagNAPure仪器(罗氏应用科学(RocheAppliedScience))上遵照生产商的说明书(“mRNAI细胞〃罗氏实验方案(Roche'sprotocol)，最终洗脱体积100μ1)，使用此试剂盒从300μ1此溶液中提取mRNA。提取的mRNA的质量以前通过Northern印迹分析(罗氏应用科学(RocheAppliedScience)，未发表的数据)证明过。实时PCR和试剂混合物制备。根据〃Lightcycler-RNAMaster杂交探针〃试剂盒(罗氏应用科学(RocheAppliedScience))中所述的标准程序，采用一步法进行逆转录和实时PCR。更准确地，在含有下列的20μ1终体积中进行RT-PCR反应1)至多20μ1的H2O；2)7.5μ1RNAMaster杂交探针2.7xconc(RNAMaster杂交探针试剂盒-罗氏应用科学(RocheAppliedScience)；3)1.3μ150mMMn(OAc)2；4)1，2或3μ1的6皮摩尔/微升正向和反向引物(终浓度300，600或900ηΜ，依赖于mRNA靶标；对于每种mRNA靶标的特殊条件充分地记载在Stordeur等，JImmunolMethods(免疫学方法杂志)，259(1-2)=55-64,2002中，除了IL-2和IL-4以外，它们列举在表2中)；5)1μ1的4皮摩尔/微升TaqMan探针(终浓度200ηΜ)；6)5μ1纯化的mRNA或标准稀释液。在61°C温育20分钟使mRNA逆转录，和然后在95°C30s进行初步的变性步骤后，开始温度循环。每个循环由95°C0(零)秒和60°C20s组成，在此第二步骤结束时读出荧光(F1/F2通道，无色彩补偿)。总共进行45个循环。所有引物被选择为跨越内含子序列，使得不可能扩增基因组DNA。通过MagNAPure仪器，在用于Lightcycler上的毛细管中直接完全制备含有所有试剂、寡核苷酸和样品的RT-PCR反应混合物。将这些毛细管的顶部闭合，离心，然后引入至Lightcycler中用于一步RT-PCR。因此所有RT-PCR组分的采样完全自动化，避免了手动采样的误差。结果表示为针对β-肌动蛋白mRNA标准化的拷贝数(每100万个β-肌动蛋白mRNA拷贝的细胞因子mRNA的mRNA拷贝数)。对于每个样品，mRNA拷贝数通过仪器软件使用Ct值(“算术拟合点分析(ArithmeticFitpointanalysis)“)从标准曲线上计算。该后者针对来自纯化DNA的连续稀释液的每轮PCR作图，如Stordeur等，JImmunolMethods(免疫学方法杂志)，259(1-2)=55-64,2002中所述。实验性内毒素血症。5名健康男性志愿者(21-28岁)接受静脉注射单剂量的LPS(来自大肠杆菌(E.coli)，lotG；美国药典(UnitedStatesPharmacopeialConvention)，Rockville,MD；4ng/kg体重)，这些志愿者实验前至少10天没有服用任何药物。在LPS注射前10分钟，和LPS注射后0.5,1,1.5，2，3和6小时，取2.5ml血样于PAXgene管中。对于体外研究，取自健康个体的200μ1肝素化全血与lOng/mlLPS(来自大肠杆菌血清型0128:B12,Sigma-Aldrich,Bornem,比利时)在37°C下在5%CO2气氛中温育0(培养开始)，0.5，1，2和6小时。抗破伤风回忆疫苗接种。健康志愿者(2名男性，4名女性，27-53岁)接受肌肉内疫苗回忆接种(Tevax，SmithKlineBeechamBiologicals，Rixensart，比利时)，这些志愿者的最后一次破伤风类毒素疫苗接种至少在5年前。在给药的当天、14天前、和给药后3，7，14，21和90天取肝素化血液管。200μ1血液在37°C下在5%CO2气氛中，存在或不存在10μg/ml破伤风类毒素(由Dr.E.Trannoy,AventisPasteur,Lyon,France惠贝曾)的条件下温育20小时。结果在向全血中加入细菌LPS时测量IL-Iβ和IL-IRAmRNA。如图35中所证明，向全血中加入LPS(10ng/ml)导致IL-Iβ和IL-IRAmRNA的快速诱导。此诱导在加入LPS后30-60分钟已经很明显，在6小时后导致IL-Iβ和IL-IRA的mRNA水平分别增加至47-倍和22-倍。曲线的图型表明这两种细胞因子mRNA量的快速和持续增加。为了评价该系统对mRNA定量的精确度，由不同体积(20-200μ1)的LPS刺激的全血，针对β-肌动蛋白和IL-Iβ进行mRNA定量。如图36中所示，β-肌动蛋白和IL-Iβ两者的mRNA拷贝数实际上与开始的血液体积直接相关。针对破伤风类毒素的体外应答。为了确定此方法是否可以适合于分析T细胞应答，定量加入破伤风类毒素后的全血培养物中的细胞因子mRNA水平，破伤风类毒素是一种被充分确定的回忆抗原，因为所有个体在童年期均进行疫苗接种。发现全血与此抗原温育后IFN-γ，IL-2，IL-4和IL-13mRNA的快速和瞬间诱导(图37)。当将每种细胞因子的应答幅度相比较时，似乎IL-2mRNA的诱导是最突出的。事实上，关于图37中显示的5个独立实验，在该类毒素的存在下温育16小时后IL-2mRNA拷贝的总体增加为约220倍，而在相同实验中IL-4和IFN-ymRNA的最大增加不超过5倍。因此IL_2mRNA的定量似乎是此评估T细胞应答的全血系统中最灵敏的参数。表3中给出的数据指示在此测试中对破伤风类毒素的应答幅度相当可变，其可能取决于最后一次疫苗回忆的时间。在向新生儿脐带血加入破伤风类毒素后没有有效地观察到IL-2mRNA的诱导，说明在此测定中仅先前致敏的T细胞和非幼稚T细胞能够应答(表3)。静脉注射LPS后在全血中诱导IL-IRA和IL-IβmRNA。作为用于检测体内细胞因子诱导的方法的第一个应用，分析来自用低剂量(4ng/kg)细菌脂多糖注射的健康志愿者的系列血样。观察到IL-IRA和IL-IβmRNA两者的明显诱导(图38)。IL-IβmRNA的诱导是快速的，因为在内毒素施用后30-60分钟其已经被检测到，并且其是瞬时的，因为在6小时后IL-IβmRNA水平恢复至注射前的数值。IL-IRAmRNA也被诱导，与IL-IβmRNA相比其具有延迟的动力学。回忆疫苗接种后抗破伤风类毒素免疫应答的检测。因为体外实验提示IL_2mRNA是监测抗破伤风类毒素应答的最灵敏参数，所以选择此参数来分析体内回忆疫苗接种后全血中T细胞对破伤风类毒素的应答的变化。为此目的，在缺少或存在破伤风类毒素的条件下，在施用疫苗前和之后数个时间点进行全血温育。如图39中所示，在所有接种疫苗的个体中，暴露于抗原的全血中IL-2mRNA的产生均显著增加。在疫苗接种后7天IL_2mRNA诱导已经很明显，在第14天或第21天时达到最大水平。个体之间的变异性可能与抗破伤风免疫性的基础状态差异有关(也参见表3)。在疫苗接种后全血中测量到的IL-2应答对免疫抗原是特异的，因为在缺少体外再刺激的条件下测量的IL-2mRNA水平没有显著改变(表3)。讨论之所以称为实时PCR是因为在PCR过程期间使用结合PCR产物的荧光分子可以直接监测到扩增子积累。这导致生成每个样品的荧光曲线，由该曲线，通过与使用校准的标准品获得的荧光曲线相比较，有可能确定样品的(C)DNA拷贝数。为了增强特异性，荧光分子可以是与位于两条引物之间的PCR产物序列互补的寡核苷酸。如本申请中所述，新的方法学提供了一种灵敏和精确的方式来定量使用现有技术方法不可能定量的生物样品中的核酸。本申请通过从代表体内状况的纯化细胞或组织中定量细胞因子mRNA来阐明这一点。使用全血用于RT-PCR分析所遇到的困难之一是在RNA提取之前进行的细胞溶解。由于大量蛋白存在于血浆和红细胞中，从全血中分离RNA的大多数方法涉及纯化被分析的mRNA的潜在细胞来源或去除红细胞，然后进行RNA提取。这些中间步骤可以与mRNA降解和/或基因诱导相关，并且因此与mRNA水平的变化相关。此外，单纯取血这一事实就可以导致一些mRNA的降解。尤其对于细胞因子mRNA也是这样，细胞因子mRNA通过位于其3'非翻译区中的富含AU的序列而对内源性核酸酶敏感。已经显示外周血IFN-ymRNA水平在采集血液后1小时事实上已经降低了大致50%(Stordeur等，(2002)J.ImmunolMeth.(免疫学方法杂志)261195)。这可以使用季胺表面活性剂诸如十四烷基三甲基草酸铵来避免，后者是一种称为Catrim0X-14TM(Qiagen，ffestburg,Leusden，荷兰)的阳离子表面活性剂，其诱导全细胞溶解，并且同时诱导核酸沉淀。本实施例观察到使用PAXgene管获得的核酸沉淀物可以意外地溶解在胍/硫氰酸盐溶液中。所述溶液的一个实例是用于mRNA分离的MagNAPureLC试剂盒(罗氏应用科学(RocheAppliedScience))提供的溶解缓冲液。这促使我们将PAXgene管的使用与MagNAPure仪器结合起来，利用了后一装置的高再现性和精确度，其归因于PCR反应混合物的所有组分的自动化制备。令人感兴趣的是，本申请的方法成功地应用于检测体内内毒素攻击后全血中的细胞因子基因诱导，证明了其可以用于监测全身炎性应答。体内攻击后IL-I应答的瞬时天性，与体外向血液加入LPS后IL-ImRNA的持续增加形成对比。这可能与体内LPS的快速清除以及体内产生细胞因子的细胞的再分布有关，其与粘附分子和趋化因子受体的上调有关。此全血法的另一个可能应用是监测疫苗接种后的T细胞应答，如通过在用破伤风类毒素疫苗接种的个体中进行体外再攻击后所观察到的IL-2mRNA的明显诱导所提示的那样。这对于大规模疫苗接种研究可能是特别感兴趣的，在所述研究中可能难以在良好的条件下组织进行细胞分离，尤其是在发展中国家，在这些国家数种新的疫苗正处于评价中。为了进一步研究此方法在疫苗试验中的适用性，其不久将被作为针对乙型肝炎初次接种后T细胞应答的读数来测试。初始血液体积和mRNA拷贝数之间的直接相关性(图36)提示使用此方法不绝对地需要测量mRNA浓度以表示结果。然而，因为甚至小的样品体积变化都可能导致定量误差，因此优选通过同时测量管家基因诸如肌动蛋白来校准测量的拷贝数。这可能仍然不是最佳的，因为在某些刺激条件下管家基因的表达可能发生变化。因此，可以在mRNA提取之前向样品中加入外部标准。当细胞因子的细胞来源被充分确定时，诸如在对于IL-2为T细胞的情况下，可以适当地通过编码在相应细胞类型中特异表达的基因的拷贝数来校正细胞因子基因的拷贝数，诸如在后一实施例中的CD3。同样，应当开发用于通过实时PCR定量细胞因子mRNA的校准物的国际标准从而有助于比较不同实验室生成的数据。全血中细胞因子mRNA的测量有效用于监测评估新疫苗和免疫疗法所需要的先天免疫应答和获得性免疫应答。实施例7=MagNAPure上的自动化mRNA提取和试剂混合物制备初始生物材料的量和存在的拷贝数之间的直接相关性。此实施例中遵照的方法概括在图40中。为了说明该系统的精确性，计算mRNA拷贝数对初始细胞数的线性回归(图41)。从各种数目(100，000-600，000个细胞，X-轴)的外周血单核细胞(PBMC)提取mRNA，并且如本发明实施例6的“材料和方法”章节中所述进行针对β-肌动蛋白mRNA的一步RT-实时PCR。此试验已经由PBMC针对β-肌动蛋白和TNF-αmRNA(图42，图板B和D)，和由全血(图42，图板A)禾口⑶4+纯化的T细胞(图42，图板C)针对β-肌动蛋白mRNA进行了重复。实施例8癌症免疫治疗此实施例中遵照的程序概述在图40中。该方法学应用于监测由癌症疫苗诱导的免疫应答。图43，40和41图示说明了在此领域对黑素瘤患者获得的结果。实施例9变态反应此实施例中遵照的程序概述在图40中。该方法学应用于变态反应。通过变应性受试者的全血与相关变应原的体外温育所诱导的应答通过使用实时PCR定量IL-4mRNA来进行分析。图46，47，48和49图示说明了在此领域中获得的结果。实施例10:自身免疫性此实施例中遵照的程序概述在图40中。该方法学应用于自身免疫性。使用此全血系统的IL-2mRNA定量应用于评估对谷氨酸脱羧酶65(GAD65)的T细胞应答，GAD65是一种自身抗原，其是1型自身免疫性糖尿病中自身反应性T细胞的靶标。图40和41图示说明了在此领域中获得的结果。实施例11移植此实施例中遵照的程序概述在图40中。该方法学应用于移植。在全血与同种异体反应性非T细胞温育后通过实时PCR定量IL-2mRNA提供了经典的混合淋巴细胞反应(MLR)的一种替代方案，以监测同种异体反应性T细胞应答。图52和53图示说明了在此领域中获得的结果。要理解的是尽管已经结合本发明的详述说明了本发明，但前面的描述意在说明但不限制本发明的范围，本发明的范围由后附的权利要求的范围限定。其他方面、优点和改动包括在下面的权利要求的范围内。表1.Qiagen和MagNAPureLC提取法的比较。1.1.QiagenmRNA提取法。来自同一血样的血液mRNA提取9次。权利要求1.一种用于液体生物样品的测定装置(30)，其有助于使所述样品分别地暴露于第一物质(2)和对照物质(35)，和随后暴露于核酸稳定剂(5)，所述装置包括-第一室(32)，其中存在所述第一物质(2)，-第二室(34)，其中存在所述对照物质(35)，-第三室(36)，其中存在所述稳定剂(5)，和-用于生物样品管的支架(52)。2.根据权利要求1所述的装置，其中所述室(32，34，36)中的一个或多个被密封，并且包括一个或多个适合于被空心针刺穿的区域。3.根据权利要求2所述的装置，其中所述区域是可再密封的隔膜(40，42，46)。4.根据权利要求1-3中任一项所述的装置，还包括用于与传输管(60)可拆卸地连接的支架(54，56)，所述传输管包括在任一端配置有空心针(62，66)的空心柔性或刚性管(64)，适合于在任意两个室之间或在一个室和所述生物样品管之间传输液体。5.根据权利要求4所述的装置，还包括如权利要求4中所定义的传输管(60)。6.根据权利要求4或5所述的装置，其中所述传输管的一根针(62)与加压管(88)的空心针(80)以平行对齐的方式连接，所述加压管包括在一端配置所述针(80)的柔性空心管(82)，并且适于向室或生物样品管施加真空或压力从而推动液体通过传输管。7.根据权利要求1-6中任一项所述的装置，其中所述第一物质(2)固定在所述第一室(32)的一部分或全部内表面上。8.根据权利要求1-7中任一项所述的装置，其中一个或多个所述室(32，34，36)包括通气孔。9.根据权利要求1-8中任一项所述的装置，其中所述第一室(32)和/或第二室(34)保持在负压下。10.根据权利要求1-9中任一项所述的装置，其中所述第一室(32)和/或第二室(34)包括在其中分配已知体积的稳定剂的指示。11.根据权利要求1-10中任一项所述的装置，其中所述第一物质(5)包括一种或多种免疫系统抗原。12.根据权利要求11所述的装置，其中所述免疫系统抗原是疫苗成分。13.根据权利要求11所述的装置，其中所述免疫系统抗原是激发超变应原反应的抗原。14.根据权利要求11所述的装置，其中所述免疫系统抗原是选自组织相容性抗原、细菌LPS、破伤风类毒素、癌症免疫治疗抗原、MAGE-3、猫变应原、Feldl、来自器官供体的抗原呈递细胞、自身抗原、GAD65中的一种或多种。15.根据权利要求1-14中任一项所述的装置，其中所述稳定剂(35)是细胞RNA降解和/或基因诱导的抑制剂。16.根据权利要求15所述的装置，其中所述细胞RNA降解和/或基因诱导的抑制剂是存在于PAXgene或Tempus血液RNA管中的那些。17.一种用于测定液体生物样品的试剂盒，包括器皿(1)，其适合于接受液体生物样品，使所述样品暴露于第一物质(2)，并随后暴露于核酸稳定剂，所述器皿包括a)存在于所述器皿(2)内部的第一物质(1)，b)其中存在有所述稳定剂(35)的容器(4，12，16)，c)所述器皿(2)内部和所述容器(4，12，16)内部之间的连接，d)临时地阻断所述连接的物理屏障(25，15，18)；禾口对照器皿(37)，其适合于接受液体生物样品，使所述样品暴露于对照物质，并随后暴露于核酸稳定剂，所述对照器皿包括a)存在于所述对照器皿(37)内部的对照物质(35)，b)其中存在有所述稳定剂(35')的对照容器(4',12',16')，c)所述对照器皿(37)内部和所述对照容器(4',12',16')内部之间的连接，d)临时地阻断所述连接的物理屏障(15'，18'，25')。18.根据权利要求17所述的试剂盒，其中所述第一物质⑵固定在所述器皿⑴的一部分或全部内表面上。19.根据权利要求17所述的试剂盒，其中所述第一物质(2)固定在固相载体上。20.根据权利要求17-19中任一项所述的试剂盒，其中所述第一物质(1)是液体。21.根据权利要求17-19中任一项所述的试剂盒，其中所述第一物质(1)是固体。22.根据权利要求17-21中任一项所述的试剂盒，其中所述器皿(1)和/或对照器皿(37)包括一个或多个适合于被注射器针刺穿的区域。23.根据权利要求22所述的试剂盒，其中所述区域是可再密封的隔膜。24.根据权利要求17-23中任一项所述的试剂盒，其中所述器皿(1)和/或对照器皿(37)包括适合于接纳注射器和将其中的内容物传输至所述器皿(1)或对照器皿(37)的内部的配件。25.根据权利要求17-24中任一项所述的试剂盒，其中所述器皿(1)和/或对照器皿(37)包括适合于接纳注射器针的配件。26.根据权利要求17-25中任一项所述的试剂盒，其中所述器皿(1)和/或对照器皿(37)包括能够使来自器皿的气体流/液体流最小化并且允许液体生物样品流进所述器皿中的阀门。27.根据权利要求17-26中任一项所述的试剂盒，其中所述器皿(1)和/或对照器皿(37)包括一种设备，通过所述设备可以排出被置换的气体。28.根据权利要求17-27中任一项所述的试剂盒，其中所述器皿(1)和/或对照器皿(37)保持在负压下。29.根据权利要求17-28中任一项所述的试剂盒，其中通过向所述器皿或对照器皿施加物理力使项d)的物理屏障(15，18，25，15'，18'，25')开启。30.根据权利要求29所述的试剂盒，其中所述力将开启设备传递至所述物理屏障(15，18,25,15',18',25')。31.根据权利要求29所述的试剂盒，其中所述力不可逆地开启所述物理屏障(15，18，25,15'，18'，25')。32.根据权利要求17-31中任一项所述的试剂盒，其中所述器皿(1)和/或对照器皿(37)包括在其中分配已知体积的稳定剂的指示。33.根据权利要求17-32中任一项所述的试剂盒，其中所述第一物质(包括一种或多种免疫系统抗原。34.根据权利要求32所述的试剂盒，其中所述免疫系统抗原是疫苗成分。35.根据权利要求32所述的试剂盒，其中所述免疫系统抗原是激发超变应原反应的抗原。36.根据权利要求32所述的试剂盒，其中所述免疫系统抗原是选自组织相容性抗原、细菌LPS、破伤风类毒素、癌症免疫治疗抗原、MAGE-3、猫变应原、i^eldl、来自器官供体的抗原呈递细胞、自身抗原、GAD65中的一种或多种。37.根据权利要求17-36中任一项所述的试剂盒，其中所述稳定剂是细胞RNA降解和/或基因诱导的抑制剂。38.根据权利要求17-37中任一项所述的试剂盒，其中所述细胞RNA降解和/或基因诱导的抑制剂是存在于PAXgene或Tempus血液RNA管中的那些。39.根据权利要求17-38中任一项所述的试剂盒，其中所述器皿(1)和对照器皿(37)的外部接合，以形成单个实体。全文摘要本发明涉及用于用脉动剂使生物样品脉动，随后稳定如此脉动的生物样品的装置和试剂盒，所述装置或试剂盒提供对照反应。本发明在医学诊断学领域具有应用，特别是涉及免疫性。文档编号B01L3/14GK102186590SQ200880131609公开日2011年9月14日申请日期2008年10月17日优先权日2008年10月17日发明者帕特里克·斯托德尔,米歇尔·高曼,马里奥斯·特因德申请人:布鲁塞尔自由大学