用于hplc检测样品中儿茶酚胺浓度的试剂的制作方法
【专利摘要】本发明一种用于HPLC检测样品中儿茶酚胺浓度的试剂。通过优化样品预处理方法和调整流动相配方、流动相流动速度、流动相洗脱过程、柱温、参比电压、工作电压和保护池电压等参数，可快速地、准确地和高灵敏度地检测样品中的儿茶酚胺浓度。
【专利说明】用于HPLC检测样品中儿茶酚胺浓度的试剂
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测样品中儿茶酚胺浓度的试剂，尤其是涉及一种用于HPLC检 测血液或尿液中儿茶酚胺浓度的试剂。
【背景技术】
[0002] 儿茶酚胺（catecholamines, CAs)是一类含有儿茶酚和胺基的神经类物质，也是 人体内一类重要的信号传递物质，均是在肾上腺髓质嗜铬细胞中的β_羟化酶催化下由苯 丙氨酸和酪氨酸合成而来的。最为重要的儿茶酚胺是多巴胺（dopamine，D0P)、肾上腺素 (adrenaline, ADR)和去甲肾上腺素（noradrenaline, N0R)。不少精神兴奋剂也是儿茶酚 胺的类似物。
[0003] 去甲肾上腺素和肾上腺素既是肾上腺髓质所分泌的激素，又是交感神经和中枢神 经系统中去甲肾上腺素能纤维的神经介质。去甲肾上腺素在中枢神经系统内分布广泛，含 量较多，而肾上腺素含量则较少。多巴胺主要集中在锥体外系部位，也是一种神经介质。它 们是重要的典型的肾上腺素受体激动剂。
[0004] 血液中儿茶酚胺主要来源于交感神经和肾上腺髓质，它们都由尿液排出。测定24 小时尿液中儿茶酚胺浓度可反映交感神经和肾上腺髓质的功能，且有昼夜规律性变化。
[0005] 血浆中儿茶酚胺生理水平很低，正常生理含量为pg( lpg=l(T12g)水平。血浆里儿茶 酚胺水平的变化显示不同的病态情形。一般通过不正常的儿茶酚胺水平能断定两个方面： 首先，涉及到肾上腺髓质瘤，这些瘤结合大量的儿茶酚胺导致循环失常；其次，涉及到心血 管系统。过多的儿茶酚胺分泌可能导致高血压和心肌梗塞，而低水平的儿茶酚胺可能引起 低血压、心肌缺血等症状的发生。儿茶酚胺含量水平的不同与心脏猝死、冠状心脏病和心脏 不充血等也有潜在联系。临床上，在神经源性、心源性、中毒源性休克的早期，医生们常用儿 茶酚胺来治疗病人以便增加收缩力和扩张外周血管改善微循环。此外，儿茶酚胺也可用于 治疗胃出血，通过在胃局部发挥作用导致胃黏膜血管收缩而产生止血效果。然而，儿茶酚胺 治疗也会产生不良反应，具体表现为：从血管漏出时会引发局部组织缺血坏死；剂量过大 时会引发急性肾功能衰竭。另外，突然停用儿茶酚胺可出现血压下降，因此需停用时，应先 逐渐减少剂量和减慢滴速，然后停止使用。
[0006] 鉴于儿茶酚胺不仅直接参与行为活动以及血压，心率呼吸和睡眠等植物神经功 能调控，而且还与许多功能性疾病如神经分裂症和忧郁症以及器官性病变相关联，因此有 必要对血液和尿液中的儿茶酚胺浓度进行检测，这不仅可以用于研究它们的生理功能及其 代谢变化，而且还可用于其他与儿茶酚胺相关的疾病的研究，特别有助于原发性高血压和 嗜铬细胞瘤的鉴别诊断，同时在利用儿茶酚胺进行休克和胃出血等疾病治疗时，实时监控 病人体内的儿茶酚胺水平变化也会尽可能低降低其不良反应。
[0007] 常用的儿茶酚胺检测方法包括荧光测定、分光光度检测、放射免疫测定、气相色谱 法和高效液相色谱法（HPLC)。其中，荧光测定主要涉及三羟基吲哚法，乙二胺缩合法，邻 苯二胺缩合法和2, 3-二氨基萘衍生化荧光测定法等(董捷，房刚，叶新强.儿茶酚胺类 物质的分析进展.化学分析计量，2001，10(6) :34-37)，都涉及利用加入与儿茶酚胺发生 反应的物质，从而产生荧光物质，通过检测特定波长处的荧光值来测定儿茶酚胺，但是它们 的灵敏度都不高，而且测定结果容易受到干扰物质的干扰，另外还有些方法只能检测样品 中ADR和NOR的总量，但不能检测DOP的总量。分光光度检测涉及先让样品中的儿茶酚胺 发生多种化学反应而产生颜色变化，然后利用紫外-可见光分光光度计在特定波长下检测 吸光值（Tayyebeh Madrakian, Abbas Afkhami, Lida Khalafi, et al. Spectrophotometric determination of catecholamines based on their oxidation reaction followed by coupling with 4-aminobenzoic acid. J. Braz. Chem. Soc. , 2006, 17 (7) : 1259?1265 ; J. J. Berzas Nevado, J. M. Lemus Gallego, P. Buitrago Laguna. Spectrophotometric determination of catecholamines with metaperiodate by flow-injection analysis. 1995:293-295)，该方法灵敏度不高，也容易受到样品中干扰物的 影响而导致测量结果发生偏差。放射免疫测定涉及使用放射性元素，容易对实验操作者造 成健康风险，同时也会污染环境。气相色谱法涉及把儿茶酚胺类物质制成硅烷化衍生物三 氯或五氟衍生物，然后用电子捕获器检测，虽然适合用于体液中微量儿茶酚胺类物质的分 析，但是它的缺点是需要制备衍生物，此外虽然衍生化反应速度较快，副产物不干扰测定， 但是衍生化试剂遇湿易水解。
[0008] HPLC是在经典液相色谱发展的基础上，引入了气相色谱法的理论和实验技术，以 高压输送流动相，采用高灵敏度检测器，发展而成的现代液相色谱分析方法。比较广泛应用 的方法就是将HPLC与电化学检测法、荧光检测法、质谱法、紫外检测法的组合应用。
[0009] 高效液相色谱-紫外检测法（HPLC-υν)虽能分别检测D0P、ADR和N0R，但是相对而 言，灵敏度还是偏低，不能达到生物样品检测目的。高效液相色谱-荧光检测法（HPLC-FD) 也能分别检测DOP、ADR和N0R，并且具有较好的线性关系，但是荧光检测前处理复杂，而且 不能将这三种成分完全分开。而高效液相色谱-电化学检测法（HPLC-E⑶）是将HPLC的 高压、高速、高效、高灵敏度和应用范围广等优点与具有高灵敏度和高选择性的电化学检测 器相结合，准确性好，灵敏度高，还具有重现性好、操作简便、离子对试剂使用量小和色谱 柱寿命长等优点，因而适用于生物组织和体液中微量儿茶酚胺的测定。因此本发明采用 HPLC-E⑶法进行检测样品中的儿茶酚胺。
[0010] 在利用HPLC-E⑶检测诸如血液和尿液之类的样品中的儿茶酚胺时，需要配置流 动相。为了除去干扰，降低杂峰的产生，所配置的流动相中应当加入一种离子对试剂，如辛 烷磺酸钠。王忠永、陶志华和杨建荣配置的l〇〇〇ml流动相含有648mg辛烷磺酸钠(王忠永， 陶志华，杨建荣.RP-HPLC-E⑶检测血浆尿液中儿茶酚胺及其临床应用.宁夏医学杂志， 2003, 25(8) :466-468)。但是辛烷磺酸钠具有刺激性，皮肤接触其蒸气或溶液，可引起皮 炎；眼睛接触时，可造成眼角膜损伤，因此有必要降低其使用量，同时又不会影响检测结果 准确性。
[0011] 再者，在利用HPLC-E⑶检测诸如血液和尿液之类的样品中的儿茶酚胺时，需要 对样品进行预处理。现有方法大多采用2~4ml血浆或尿液利用活性氧化铝吸附或活性氧 化铝微柱进行预处理，如王忠永、陶志华和杨建荣就分别选择2ml血浆和2ml尿液进行预 处理，预处理时使用30mg活性氧化铝吸附血浆和尿液中的儿茶酚胺，然后加入HC10 4溶液 将儿茶酚胺解离（王忠永，陶志华，杨建荣.RP-HPLC-ECD检测血浆尿液中儿茶酚胺及其 临床应用.宁夏医学杂志，2003，25(8):466-468)。廖瑛、单济川和余斌杰采用2ml尿 液进行预处理，预处理时使用自制的活性氧化铝微柱，活性氧化铝使用量在2(T40mg (廖 瑛，单济川，余斌杰.HPLC-E⑶检测尿儿茶酚胺方法的优化.中山医科大学学报，1994， 15 (3) : 227~231 )。袁倚盛、赵飞浪和杨巷菁等选择4ml尿液进行预处理，预处理时使用微型 氧化铝柱(袁倚盛，赵飞浪，杨巷菁等.双柱双泵高效液相色谱-电化学检测法测定尿中儿 茶酚胺.色谱，1987, 5(5) :311~313)。这些样品预处理方法样品用量和活性氧化铝用量都 较大，而氧化铝微柱成本高，难以常规检测和推广应用。此外，HC10 4溶液是一种具有极强氧 化性的强酸，具强腐蚀性、强刺激性，可致人体灼伤。另外，在采集血液时，需要加入防凝剂， 以便降低因血液凝固而造成的测量结果不准，而在采集尿液时，需要加入防腐剂，以便阻止 尿液中细菌滋生，从而降低因细菌生长导致尿液中的化学物质发生变化所造成的测量结果 不准。如王忠永、陶志华和杨建荣往采集的血液中加入肝素来防止血液凝固，往采集的尿液 中加入浓盐酸来阻止尿液中细菌生长(王忠永，陶志华，杨建荣.RP-HPLC-E⑶检测血浆尿 液中儿茶酚胺及其临床应用.宁夏医学杂志，2003, 25(8) :466-468)。但是血液中和尿液 中含有金属离子，这些离子会与流动相中的EDTA相结合，消耗流动相中的EDTA，从而导致 检测结果发生偏差。
【发明内容】
[0012] 本发明提供一种用于HPLC检测样品中儿茶酚胺浓度的试剂，所述试剂包括流 动相，用于样品预处理的活性氧化铝、〇. 2M HC1溶液和0. 01M EDTA-2Na溶液，其中，在每 1000ml所述流动相中，无水乙酸钠4. lg，EDTA-2Na 0. 05g，乙腈70?90ml，辛烷磺酸钠 0· 08 ?0· 10g，冰醋酸 7. 5ml，其余为 ddH20, pH 值 4. 0 ?4. 3。
[0013] 进一步地，所述HPLC检测的条件为C18反相色谱柱，流速：0. 2ml/min ;柱温：38°C; 参比电压ECDl=-100mV，工作电压ECD2=100mV，保护池电压Guard=350mV。
[0014] 进一步地，所述样品选自血液或尿液，当所述样品为尿液时，所述试剂还包括用于 样品预处理的浓盐酸。
[0015] 进一步地，所述用于样品预处理的0. 01M EDTA-2Na溶液与所述血液或尿液的体积 比为1:100。
[0016] 进一步地，当所述血液用量为0. 5ml或所述尿液用量为0. 2ml时，所述用于样品预 处理的活性氧化铝用量为20?25mg。
[0017] 进一步地，所述预处理过程如下所示： (1) 将所述用量的活性氧化铝加入到一个试管中，然后加入400 μ 1 Tris-HCl缓冲液； (2) 往0. 5ml血液加入0. 01M EDTA-2Na溶液5 μ 1，或者往0. 2ml尿液中加入20ml浓盐 酸和0. 01M EDTA-2Na溶液2 μ 1，经离心后，收集血浆或者尿液上清液； (3) 将（2)中收集的血浆或者尿液上清液加入到（1)中的试管内，然后振荡，离心后，移 除上清液； (4) 往试管中加 ddH20清洗，然后振荡，离心后，移除上清液，重复4次，然后再次离心 后，将试管中的水吸干； (5) 加入0.2MHC1溶液200 μ 1，然后振荡，离心后，取10 μ 1上清液作为上样液，准备上 机检测。
[0018] 进一步地，所述用于样品预处理的活性氧化铝用量为23mg。
[0019] 进一步地，所述流动相中辛烧磺酸钠的用量为0. 08g。
[0020] 进一步地,所述流动相中乙腈的用量为80ml。
[0021] 进一步地，所述流动相中的pH值为4. 0。
[0022] 进一步地，每1000ml所述流动相中，无水乙酸钠4. lg，EDTA_2Na 0. 05g，乙腈 80ml，辛烷磺酸钠0· 08g，冰醋酸7. 5ml，其余为ddH20, pH值4· 0。
[0023] 本发明的有益效果：本发明采用HPLC-ECD检测诸如血液和尿液之类的样品中的 儿茶酚胺浓度，只需使用〇. 5ml血液，0. 2ml尿液，就可准确获得检测结果，同时利用本发明 的样品预处理方法，调整活性氧化铝用量，用盐酸替代HC104溶液，并调整流动相配方、流动 相流动速度、流动相洗脱过程和柱温等参数，从而显著地降低样品用量和辛烷磺酸钠用量， 从而提高了检测准确性，灵敏度，降低了检测时间，而且简便易操作，成本下降，同时降低环 境污染。
[0024] 再者，通过分别往收集的血液和尿液中加入EDTA，不仅可以起到防止血液凝固的 作用，而且还可以与血液和尿液中的金属离子相结合，从而阻止这些金属离子消耗流动中 的EDTA组分，提高检测效果。
[0025] 此外，当利用经过预处理的样品上机进行HPLC-E⑶检测时，10 μ 1上样液先经过 保护池，在保护池电压的作用下，将样品中的干扰物质氧化，从而有助降低这些干扰物的影 响，提高检测结果的准确性。
【专利附图】
【附图说明】
[0026] 图1.流动相配方1时的谱图。谱图中，峰上方数值的表示分隔符，前面 的"1"、"2"和"3"分别代表去甲肾上腺素（N0R)、肾上腺素（ADR)和多巴胺（D0P)的峰， 后面的"1.917"、"2. 168"和"2. 908"分别代表去甲肾上腺素（N0R)、肾上腺素（ADR)和多 巴胺（D0P)的出峰时间。以下皆同。
[0027] 图2.流动相配方2时的谱图。
[0028] 图3.流动相配方3时的谱图。
[0029] 图4.流动相中辛烷磺酸钠（B8)=0. 06g时的谱图。
[0030] 图5.流动相中辛烷磺酸钠（B8)=0. 08g时的谱图。
[0031] 图6.流动相中辛烷磺酸钠（B8)=0. 10g时的谱图。
[0032] 图7.流动相中辛烷磺酸钠（B8)=0. 648g时的谱图。
[0033] 图8.流动相中乙腈用量为70ml时的谱图。
[0034] 图9.流动相中乙腈用量为80ml时的谱图。
[0035] 图10.流动相中乙腈用量为90ml时的谱图。
[0036] 图11.流动相pH=3. 4时的谱图。
[0037] 图12.流动相pH=4. 0时的谱图。
[0038] 图13.流动相ρΗ=4· 2时的谱图。
[0039] 图14.流动相ρΗ=4· 3时的谱图。
[0040] 图15.流动相ρΗ=4. 5时的谱图。
【具体实施方式】
[0041] 本发明利用HPLC-ECD法检测样品中的儿茶酚胺浓度，在检测中对样品预处理方 法和流动相配方进行优化，同时对检测时的相关参数进行调整。在这里，虽然用于预处理的 EDTA盐和流动相配置的EDTA盐均为乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na)，但是其他的EDTA盐也 可发挥类似的作用，尤其是乙二胺四乙酸二钾（EDTA-2K)，只要保证溶液中乙二胺四乙酸根 离子摩尔浓度保持不变即可。此外，用于样品预处理的浓盐酸为质量分数超过37%的HC1 溶液，本发明虽然优选质量分数为37. 5%的HC1溶液，但是其他的浓盐酸也能发挥类似的防 腐作用。
[0042] 下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明 的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，张庆合主编的《高效 液相色谱实用手册》和维诺尼卡R.迈耶（Veronika R. Meyer)编写的《实用高效液相色谱》 第五版，或者按照厂商所建议的步骤和条件。
[0043] 实施例1利用HPLC检测样品中儿茶酚胺浓度的试剂 用于HPLC检测样品中儿茶酚胺浓度的试剂，所述试剂包括流动相，用于样品预处理的 活性氧化铝、0. 2M HC1溶液和0. 01M EDTA-2Na溶液： 每1000ml所述流动相中，无水乙酸钠4. lg，EDTA_2Na 0. 05g，乙腈70?90ml, 辛烷磺酸钠0.08?0.10g，冰醋酸7. 5ml，其余为ddH20, pH值4.0?4. 3。其中乙腈 体积优选为80ml，辛烷磺酸钠用量优选为0. 08g，流动相pH值优选为4. 0。当所述样品为 尿液时，所述试剂还包括用于样品预处理的浓盐酸。所述浓盐酸优选质量分数为37. 5%的 HC1溶液。
[0044] 此外，所述试剂还可包括儿茶酚胺标准品、甲肾上腺素（N0R)标准品、肾上腺素 (ADR)标准品、多巴胺（D0P)标准品、内标准品和稀释液。
[0045] 稀释液：可选自ddH20、0. 1MHC1等溶液，这里优选0· 1MHC1溶液。
[0046] N0R标准品、ADR标准品、D0P标准品和儿茶酚胺标准品配置如下：去甲肾上腺素 (N0R)、肾上腺素（ADR)和多巴胺（D0P)购买自Sigma-Aldrich公司。分别称取一定重量的 NOR、ADR、D0P，加入到一定体积的0. 1MHC1溶液中，配置成所需浓度的N0R标准品、ADR标 准品和D0P标准品，需要时利用0. 1M HC1溶液加以稀释。将同等重量的N0R、ADR、D0P同时 加入到一定体积的〇. 1M HC1溶液中，配置成所需浓度的儿茶酚胺标准品，需要时利用0. 1M HC1溶液加以稀释。如lOOpprn (lppm=lmg/L)儿茶酚胺标准品，就是将20mg N0R、20mg ADR 和20mg D0P同时加入到200ml的(λ 1M HC1溶液中。
[0047] 内标准品配置：3, 4-二轻基节胺（DHBA)购买自Sigma-Aldrich公司。称取一定 重量的DHBA，加入到一定体积的0. 1M HC1溶液中，配置成所需浓度的DHBA内标准品，需要 时利用0. 1MHC1溶液加以稀释。
[0048] 实施例2血液预处理方法 (1)将20?25mg活性氧化错(购买自Sigma-Aldrich公司）加入到一个试管中，然后 加入400 μ 1 Tris-HCl缓冲液。
[0049] (2)往0· 5ml 血液中按 100:1 体积比例加入 0· 01MEDTA-2Na溶液 5μ 1，在 3500rpm 下离心10min后，收集血浆，待用时4°C保存。
[0050] (3)将⑵中收集的血浆加入到（1)中的试管内，先振荡5min，再在3500rpm下离 心lOmin，移除上清液； (4) 往试管中加 ddH20清洗，然后振荡2min，在3500rpm下离心3min，移除上清液，重复 4次，随后在3500rpm下再离心5min，用棉签将试管中的水吸干； (5) 往试管中加入0· 2M HC1 200μ 1，振荡5min，在3500rpm下离心lOmin，取10μ 1上 清液作为上样液，准备上机检测。
[0051] 实施例3尿液预处理方法 (1)将20?25mg活性氧化错（购买自Sigma-Aldrich公司）加入到一个试管中，然后 加入400 μ 1 Tris-HCl缓冲液。
[0052] (2)往0· 2ml尿液中按1:100体积比例加入20ml质量分数为37. 5%的盐酸溶液， 同时按100:1体积比例加入0. 01M EDTA-2Na溶液2μ 1，在3500rpm下离心lOmin后，收集 上清液。
[0053] (3)取⑵中收集的上清液200μ 1加入到（1)中的试管内，先振荡5min，再在 3500rpm下离心lOmin,移除上清液； (4) 往试管中加 ddH20清洗，然后振荡2min，在3500rpm下离心3min，移除上清液，重复 4次，随后在3500rpm下再离心5min，用棉签将试管中的水吸干； (5) 往试管中加入0. 2MHC1 200μ 1，振荡5min，在3500rpm下离心lOmin，获得上清液， 取10 μ 1上清液作为上样液，准备上机检测。
[0054] 实施例4 HPLC-ECD检测条件 色谱条件：C4、C8、C18反相色谱柱均可，如C18反相色谱柱可选择Thermo Fisher Scientific 公司的 Acclaim?RSLC 120 C18 2. 2Mm (2· 1 X 100mm)。
[0055] 流动相如实施例1所示。
[0056] 流速：0· 2ml/min。
[0057] 柱温：38 °C。
[0058] 电化学检测条件：参比电压E⑶l=-100mV，工作电压E⑶2=100mV，保护池电压 Guard=350mV。
[0059] 实施例5流动相配置 按照以下三种配方配置流动相： 配方1 :每l〇〇〇ml流动相中，无水乙酸钠4. lg，EDTA-2Na 0. 05g，乙腈70ml，辛烧磺酸 钠 0. 08g，冰醋酸 7. 5ml，ddH20 922. 5ml，pH 值 4. 0。0. 22 μ m 滤膜过滤，超声脱气 30min。
[0060] 结果分析：按照实施例1所示的方法配置lOOpprn的儿茶酚胺标准品，取10 μ 1上 机检测，所采用的仪器和检测条件如实施例4所示，所使用的流动相如配方1所示，检测结 果如图1所示。
[0061] 由图1可知，采用流动相配方1，能成功地分离NOR、ADR和D0P，同时NOR、ADR和 D0P的峰与溶剂峰完全分离。
[0062] 此外，在相同实验条件下，分别了检测2ppm和10ppm的儿茶酚胺标准品（按照实 施例1所示的方法配置），也均能成功地分离NOR、ADR和D0P，同时NOR、ADR和D0P的峰与 溶剂峰完全分离。
[0063] 配方2 :每1000ml流动相中，无水乙酸钠4. lg，EDTA-2NaO. 05g，乙腈80ml，辛烷磺 酸钠 0. 10g，冰醋酸 7. 5ml，ddH20 912. 5ml，pH 值 4. 2。0. 22 μ m 滤膜过滤，超声脱气 30min。
[0064] 结果分析：按照实施例1所示的方法配置lOOppm的儿茶酚胺标准品，取10 μ 1上 机检测，所采用的仪器和检测条件如实施例4所示，所使用的流动相如配方2所示，检测结 果如图2所示。
[0065] 由图2可知，采用流动相配方2,能成功地分离NOR、ADR和D0P，同时NOR、ADR和 D0P的峰与溶剂峰完全分离。
[0066] 此外，在相同实验条件下，分别了检测2ppm和lOppm的儿茶酚胺标准品（按照实 施例1所示的方法配置），也均能成功地分离NOR、ADR和D0P，同时NOR、ADR和D0P的峰与 溶剂峰完全分离。
[0067] 配方3 :每1000ml流动相中，无水乙酸钠4. lg，EDTA-2Na 0. 05g，乙腈90ml，辛烧磺 酸钠 0. 09g，冰醋酸 7. 5ml，ddH20 902. 5ml，pH 值 4. 3。0. 22 μ m 滤膜过滤，超声脱气 30min。
[0068] 结果分析：按照实施例1所示的方法配置lOOppm的儿茶酚胺标准品，取10 μ 1上 机检测，所采用的仪器和检测条件如实施例4所示，所使用的流动相如配方3所示，检测结 果如图3所示。
[0069] 由图3可知，采用流动相配方3,能成功地分离NOR、ADR和D0P，同时NOR、ADR和 D0P的峰与溶剂峰完全分离。
[0070] 在相同实验条件下，分别了检测2ppm和lOppm的儿茶酚胺标准品（按照实施例1 所示的方法配置），也均能成功地分离NOR、ADR和D0P，同时与溶剂峰完全分离。
[0071] 实施例6流动相分析 (1)离子对试剂辛烷磺酸钠 每1000ml流动相配置如下所示： 先加入912. 5ml ddH20,边搅拌边依次加入4. lg无水乙酸钠，0· 05g EDTA-2Na，一定量 的辛烷磺酸钠（B8)，7. 5ml冰醋酸，调pH至4. 0,再加入80ml乙腈，搅拌均匀后，0. 22 μ m 滤膜过滤，超声脱气30min，备用，其中辛烷磺酸钠的用量分别选择0. 06g，0. 08g，0. 10g和 0. 648g〇
[0072] 按照实施例1所示的方法配置lOOppm的儿茶酚胺标准品，进样量为10 μ 1，所采 用的仪器和检测条件如实施例4所示。作为儿茶酚胺标准品中的三种组分，去甲肾上腺素 (N0R)、肾上腺素（ADR)和多巴胺（D0P)的出峰时间分别如表1、图4、图5、图6和图7所示： 表1不同B8用量下的NOR、ADR和D0P出峰时间 _
【权利要求】
1. 一种用于HPLC检测样品中儿茶酚胺浓度的试剂，所述试剂包括流动相，用于样品预 处理的活性氧化铝、0. 2M HC1溶液和0. 01M EDTA-2Na溶液，其特征在于： 每1000ml所述流动相中，无水乙酸钠4. lg，EDTA-2Na 0. 05g，乙腈70?90ml，辛烧磺 酸钠 0. 08?0. 10g，冰醋酸7. 5ml，其余为ddH20, pH值4. 0?4. 3。
2. 如权利要求1所述的试剂，所述HPLC检测的条件为C18反相色谱柱，流速：0. 2ml/ min ;柱温：38°C ;参比电压ECDl=-100mV，工作电压ECD2=100mV，保护池电压Guard=350mV。
3. 如权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述样品选自血液或尿液，当所述样品为尿 液时，所述试剂还包括用于样品预处理的浓盐酸。
4. 如权利要求3所述的试剂，其特征在于，所述用于样品预处理的0. 01M EDTA-2Na溶 液与所述血液或尿液的体积比为1: 1〇〇。
5. 如权利要求3所述的试剂，其特征在于，当所述血液用量为0. 5ml或所述尿液用量为 0. 2ml时，所述用于样品预处理的活性氧化铝用量为20?25mg。
6. 如权利要求5所述的试剂，其特征在于，所述预处理过程如下所示： 将所述用量的活性氧化铝加入到一个试管中，然后加入400 μ 1 Tris-HCl缓冲液； 往0. 5ml血液加入0. 01M EDTA-2Na溶液5 μ 1，或者往0. 2ml尿液中加入20ml浓盐酸 和0. 01M EDTA-2Na溶液2 μ 1，经离心后，收集血浆或者尿液上清液； 将（2)中收集的血浆或者尿液上清液加入到（1)中的试管内，然后振荡，离心后，移除 上清液； 往试管中加 ddH20清洗，然后振荡，离心后，移除上清液，重复4次，然后再次离心后，将 试管中的水吸干； 加入0. 2M HC1溶液200 μ 1，然后振荡，离心后，取10 μ 1上清液作为上样液，准备上机 检测。
7. 如权利要求5所述的试剂，其特征在于，所述用于样品预处理的活性氧化铝用量为 23mg〇
8. 如权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述流动相中辛烷磺酸钠的用量为0. 08g。
9. 如权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述流动相中乙腈的用量为80ml。
10. 如权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述流动相中的pH值为4. 0。
【文档编号】G01N30/88GK104062388SQ201410194385
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2014年5月9日 优先权日:2014年5月9日
【发明者】阳愿望, 霍玉美, 潘超, 单洪波 申请人:广州艾迪康医学检验所有限公司