专利名称：水中不同极性有机物同柱萃取再分级分离的方法
技术领域：
本发明涉及一种不同污染程度水体有机物毒性鉴别及毒性来源分析的前处理方法，更具体的说是一种用于含有PCB, OCs， PAH， NP, OP， BPA, TBBPA, E2
等常见不同极性有机污染物的复杂环境水样的同柱萃取再分级分离的方法。
背景技术：
随着城市化、工业化水平的提高，大量有机物随生活污水及工业废水进入到环境中，使环境水体受到严重污染，这些有机物浓度低毒性大，在环境中存在时间长，而且可能对水生生物及人体产生慢性毒性，甚至导致癌症的高发。虽然我国政府已经投入大量的人力、物力和资金用于水质的常规检测、饮用水的常规处理、消毒等安全保障技术的研究。但是，常规的化学检测只能反映污染的水平，无法满足人们巳益提高的对于健康保证的要求，为了维护社会的稳定和谐发展，势必要关注水质的毒性鉴定及毒性来源追踪。
长期以来，针对于水中的PCBs， PAH和酚类等多种不同极性的有机物的提取，人们往往需要选取不同的萃取柱分别富集纯化，这样的前处理方法不仅费时间，而且费试剂、费样品，还不利于化学分析与毒性效应评价的有效结合。
《Environmental Contamination and Toxicology》2005年第49期上408页公开了一篇有关污水处理厂处理过程中水毒性鉴定的文章《Assessing theDetoxication Efficiencies of Wastewater Treatment Processes Using a Batteryof Bioassays/Biomarkers》，其中叙述的方法是用Oasis HLB cartridges的固相萃取柱富集水中的有机物，并用硅胶/氧化铝柱分级分离成三个组分并进行毒性来源的探讨。该方法相对于以前的方法进步不少，可以同时提取水中不同极性的有机物并做到毒性的鉴定及追踪，但该方法使用单一的二氯甲烷作为固相萃取柱的洗脱溶剂使得实验对于极性物质的回收率低，且其运用硅胶作为填料干扰较大，对于目标化合物的分组效果不明显，只能用于高污染水体的分析，无法应用于人们日益关注的低污染水体中有机物的提取及分离。
通过检索发现国内外文献没有关于这种针对各种污染程度水体的不同极性
3有机物同柱萃取再分级分离的前处理方法的报道。所以有关的研究进入了江苏省
科技计划项目(BS2007050)和江苏省普通高校研究生科研创新计划资助项目(CX07B一170z)。
发明内容
1. 发明要解决的技术问题
针对人们日益关注的低污染水体中有机物的提取及分离中存在的问题，本发明提供集同柱富集、分级分离于一体的不同污染程度水体有机化合物提取分离的水中不同极性有机物同柱萃取再分级分离的方法，可用于慢性毒性鉴定及毒性来源分析。
2. 技术方案
本方案的原理由于水环境样品中化合物浓度相对较低，检测前必须进行必要的提取浓縮。本方法采用固相萃取进行水样中有机物的富集，柱的固定相为C化键合硅胶，使用非极性的疏水性的固定相从极性的样品溶液，即水样中富集有机物，用少量有机溶剂将分析物从固定相上洗脱下来可进行总毒性测定。再采用吸附柱层析法进行不同极性有机物的分离，利用混合物中各组分在吸附剂上吸附一解吸附能力的差异而达到分离目的，常用的吸附剂有弗罗里硅土和硅胶。
本发明的技术方案如下
水中不同极性有机物同柱萃取再分级分离的方法，其主要包括以下步骤
(1) 水样通过滤膜过滤后，以3 5mL/min的速度通过固相萃取柱进行富集，萃取柱使用前分别用甲醇和蒸馏水活化，萃取完毕后，萃取柱负压真空干燥，
(2) 依次用2 6mL正己垸，4 8mL甲醇仁氯甲烷(2~4: 1)的溶剂洗脱步骤(1)中的萃取柱，将洗脱液分别浓縮，二氯甲烷定容至1mL，
(3) 称取8~10g弗罗里硅土，利用正己垸湿法填柱于玻璃管中，加入无水N32S04干燥，将浓縮的样品溶液加入弗罗里硅土柱分离，先后用正己垸、正己烷/二氯甲烷(2~4: 1)和二氯甲垸/甲醇(1~2: 1)连续洗脱，将三份流出液分别收集并浓縮，-2(TC保存备用。
本发明步骤(1)中滤膜为0.45|jm滤膜。采用C18富集柱作为固相萃取柱。一般取水样体积为5L。发明中用到的正己烷、二氯甲烷及甲醇均为农残级。步骤(2)得到的有机提取物可以用DMSO溶剂替换后进行总毒性的测试，也
可用于进一步的分级分离。
步骤(3)中玻璃管内径为1cm，各种洗脱体积及配比是获得的优化条件，分
级分离后的洗脱液浓縮可先用旋转蒸发仪浓缩至1mL左右，再用N2缓缓吹扫溶
剂，最后DMSO定容用于毒性鉴定，或用正己烷/甲醇定容后进行化学分析。3.有益效果
本发明提供了一种水中不同极性有机物同柱萃取再分级分离的方法，试剂消耗少，成本低，步骤少却能较好富集不同污染水平水体中的有机物，并分离为不同极性的组分(F1, F2， F3)，其弱极性组分F1中28种PCB与中极性组分F2中PAH及F2中PAH与F3中的5种酚类基本达到完全分离。F1中PCB的加标回收率达到80%以上，F2中PAH的回收率在70%以上，F3中几种酚类的回收率为80%以上。本发明可以与报告基因实验、斑马鱼胚胎实验、彗星实验等多种毒性鉴定技术相结合，具有普适性。该技术可以将分级分离后样品通过生物毒性先导，发现致毒组分，缩小仪器分析追踪有机污染物的范围，能够较快地找出关键毒物，另外当致毒组分中预期的目标污染物不存在时，也可以同时追踪检测其它潜在的有毒物质。
具体实施例方式
以下通过实例进一步说明本发明。
本发明的实施也是完成江苏省普通高校研究生科研创新计划资助项目(CX07BJ70z)和江苏省科技计划项目(BS2007050)的过程。
实施例1 :
准确配制含有28种PCB (CB-8， CB-18,CB-28, CB-52, CB-44, CB-66,CB-81, CB-77, CB-101, CB-123, CB-118, CB-114, CB-105, CB-126, CB-153,CB-138, CB-128, CB-167, CB-156, CB-157, CB-169, CB-187, CB-180,CB-170, CB-189, CB-195, CB-206, CB-209，浓度均为20 ng/L)， 8种OCs (a陽六六六，(3-六六六，Y-六六六，5-六六六，p,p'DDE， o，p'-DDT， p,p'-DDD， p,p'-DDT，浓度均为50 ng/L)， PAH (二氢苊、芴、菲、蒽、荧蒽、芘、苯并[a]蒽、屈、苯并[b]荧蒽、苯并[k]荧蒽、苯并[a]芘、茚并[1,2,3-c,d]芘，浓度均为200 ng/L)，NP (200ng/L)， OP (200ng/L)， BPA (200ng/L)， TBBPA (200ng/L)， E2(200 ng/L)的水样5L，通过0.45|jm滤膜过滤后，以4mL/min的速度通过C18固相萃取柱富集。萃取柱使用前用10ml甲醇和10ml蒸馏水活化。富集后萃取柱负压真空干燥，以脱去大部分水分，接着用氮气吹干。随后用8mL正己烷进行洗脱，控制流速为2mL/min，每2mL收集洗脱液，分别在轻柔氮气流中吹至0.1mL，使用GC-ECD进行测定。分析条件如下PCBs与OCs类——GC-ECD
程序升温起始温度8CTC，升温速率2(TC/min至ij 165°C，再以2"/min升温
到220'C，以4。C/min升温到28CTC，保持6min;进样口温度280°C， He不分流进样，1.0mL/min;色谱柱DB-5,30mx250|jmx0.25|jm;
进样量1 [JL;不分流进样；
检观幡温度320。C; makeup flow: N2
观察发现，正己烷体积为4 mL时PCBs与OCs这两类物质的回收率范围为82% 117%之间，当正己垸体积增加时回收率无显著提高。
实施例2:
采用实施例1中的方法配置水样，过滤后以4mL/min的速度通过C18固相萃取柱富集，柱负压真空干燥后用氮气吹干。随后使用4mL正己烷进行洗脱，接着用甲醇/二氯甲垸(4: 1) 8 mL洗脱，控制流速为2 mL/min，每2 ml收集洗脱液，分别在轻柔氮气流中吹至0.1 ml;重复以上富集实验，使用4ml正己垸进行洗脱后用甲醇/二氯甲垸(2: 1) 10mL洗脱固相萃取柱，每2ml收集洗脱液。使用GC-FID进行PAH测定，极性化合物用HPLC(DVD/FLD)分析，分析条件如下
PAHs类——GC-FID
程序升温起始温度4CTC，以8.0°C/min的速率升温至190°C，再以4.0°C/min的速率升温至210°C,再以8.(TC/min的速率升温至250°C/min，再以4.0°C/min的速率升至300°C，保持10min;
进样口温度28CTC;进样量2(J|，不分流进样； 检测器温度320°C。
极性化合物类HPLC(DVD/FLD)
流动相0-5min， 80%甲醇&20%水;5-11 min， 100%甲醇;流量1 ml/min;
柱温3crc。
检测器TBBPA: UVD检测器，检测波长A=210 nm; BPA:FLD检观i藩，0-5min， AEx=228 nm， AEm=315 nm; E2:FLD检测器，5-7min， AEx=224 nm， AEm = 316 nm; OP，NP: FLD检测器，7-"min， AEx=226 nm， AEm = 314 nm。
分析结果显示，甲醇/二氯甲垸(4: 1)6mL时便可将PAH， NP， 0P， BPA， TBBPA， E2洗脱下来，而甲醇/二氯甲垸(2: 1)需要10mL，而回收率基本相 同。所以选择甲醇/二氯甲垸(4: 1)作为PAH， NP， OP， BPA， TBBPA， E2
的洗脱溶剂更佳。
实施例3:
准确称取8g弗罗里硅土 (60-100目，65CTC灼烧5h，使用前于130'C活化 4-6h)， 1g无水Na2S04，湿法填柱至内径为1cm的玻璃管中，用胶皮管敲打管 壁以除去玻璃柱中的气泡，使弗罗里硅土在玻璃柱内填实。萃取柱用10mL左右 正己烷淋洗两次，以除去柱内不纯物质。将用实施例2的富集法得到的浓縮的样 品溶液加于弗罗里硅土柱顶部，至样品渗入柱内时，用60mL正己烷溶液淋洗柱 内被吸附的污染物质，并将洗脱液收集入100mL梨形瓶中，再用正己烷溶液洗 脱，每20mL收集一次，洗脱液分别先用旋转蒸发仪浓縮至1mL左右，再用N2 缓缓吹扫溶剂，浓縮并用正己烷溶剂定容。随即用GC-ECD进行测定，分析条 件如实施例1。分析结果显示，60mL正己垸已经能收集到部分PCB，直至ij 120mL 正己垸淋洗时PCB累计回收率达到83%-111%。随后继续用120mL正己烷/二 氯甲垸(4:1 )继续淋洗，浓缩后分析得到第二组分中PAH的回收率为35%-80%。
实施例4:
准确称取10g弗罗里硅土 (60-100目，65(TC灼烧5h，使用前于130。C活
7化4-6h)， 1g无水Na2SCU，湿法填柱至内径为化m的玻璃管中，用胶皮管敲 打管壁以除去玻璃柱中的气泡，使弗罗里硅土在玻璃柱内填实。萃取柱用10mL 左右正己垸淋洗两次，以除去柱内不纯物质。将用实施例2的富集法得到的浓缩 的样品溶液加于弗罗里硅土柱顶部，至样品渗入柱内时，用60mL正己烷溶液淋 洗柱内被吸附的污染物质，并将洗脱液收集入100mL梨形瓶中，再用正己烷溶 液洗脱，每20mL收集一次，洗脱液分别先用旋转蒸发仪浓縮至1mL左右，再 用N2缓缓吹扫溶剂，浓縮并用正己垸溶剂定容。随即用GC-ECD进行测定，分 析条件如实施例1。分析结果显示，直到100mL正己烷淋洗时PCB累计回收率 达到80%-110%。随后继续用100mL正己垸/二氯甲烷(4: 1)继续淋洗，浓縮 后分析得到PAH的回收率为79%-115%，分析条件如实施例2，并且该组分中 无PCB检出。继续用40mL正己垸/二氯甲垸(4: 1)淋洗，经GC-FID检测该 40mL中无PAH检出，两组分完全分离。
实施例5:
准确称取10g弗罗里硅土 (60-100目，650'C灼烧5h，使用前于130。C活 化4-6h)， 1g无水Na2S04，湿法填柱至内径为1cm的玻璃管中，用胶皮管敲 打管壁以除去玻璃柱中的气泡，使弗罗里硅土在玻璃柱内填实。萃取柱用10mL 左右正己垸淋洗两次，以除去柱内不纯物质。将用实施例2的富集法得到的浓縮 的样品溶液加于弗罗a 圭土柱顶部，至样品渗入柱内时，用100mL正己烷溶液 淋洗柱内被吸附的污染物质，并将洗脱液收集入100mL梨形瓶中，再用100mL 正己烷/二氯甲垸(4: 1)洗脱，随后用80mL二氯甲烷/甲醇(1: 1)淋洗，继 续用二氯甲烷/甲醇(1: 1)溶液洗脱，每20mL收集一次，洗脱液分别先用旋 转蒸发仪浓缩，用HPLC(DVD/FLD)分析。分析结果显示，直到120mL 二氯甲 烷/甲醇(1:1)时，累计NP、 0P、 BPA、 TBBPA、 E2回收率达到81%-98%。 再加入二氯甲烷/甲醇(1: 1)淋洗弗罗里硅土柱已无NP、 OP、 BPA、 TBBPA、 E2检出，三个组分都达到完全分离。
实施例6:
准确配制含有28种PCB (CB-8， CB-18,CB-28, CB-52, CB-44, CB-66, CB-81, CB-77, CB-101, CB-123, CB-118, CB-114, CB-105, CB-126, CB-153,
8CB-138, CB-128, CB-167, CB-156, CB-157, CB-169, CB-187, CB-180, CB-170, CB-189, CB-195, CB-206, CB-209,浓度均为20 ng/L)' 8种OCs (a-六六六，(3-六六六，y-六六六，5-六六六，p,p'DDE， o,p'-DDT， p，p'-DDD， p,p'-DDT， 浓度均为50 ng/L)， PAH (二氢苊、笏、菲、蒽、荧蒽、芘、苯并[a]蒽、屈、 苯并[b]荧蒽、苯并[k]荧蒽、苯并[a]芘、茚并[1，2，3-c,d]芘，浓度均为200 ng/L)， NP (200ng/L)， OP (200ng/L)， BPA (200ng/L)， TBBPA (200ng/L)， E2 (200 ng/L)的蒸馏水样5L，以3 5ml/min的速度通过C18固相萃取柱富集。 萃取柱使用前用10ml甲醇和10ml蒸馏水活化。富集后萃取柱负压真空干燥， 以脱去大部分水分，接着用氮气吹干。使用4ml正己烷进行洗脱，接着用甲醇/ 二氯甲烷(4: 1) 6mL洗脱，控制流速为2 ml/min。将洗脱液混合，并用旋转 蒸发浓縮至1-2mL。
准确称取10g弗罗里硅土 (60-100目，65(TC灼烧5h，使用前于130'C活 化4-6h)， 1g无水Na2S04，湿法填柱至内径为1cm的玻璃管中，用胶皮管敲 打管壁以除去玻璃柱中的气泡，使弗罗里硅土在玻璃柱内填实。萃取柱用10mL 左右正己烷淋洗两次，以除去柱内不纯物质。将固相萃取柱萃取浓縮的样品溶液 加于弗罗里硅土柱顶部，至样品渗入柱内时，用100mL正己烷溶液淋洗柱内被 吸附的污染物质，并将洗脱液收集入100mL梨形瓶中，再用100mL正己烷/二 氯甲烷(4: 1)洗脱，随后用120mL二氯甲烷/甲醇(1:1)淋洗，洗脱液分别 收集并先用旋转蒸发仪浓縮至1mL左右，再用N2缓缓吹扫溶剂，非极性组分与 中等极性组分用正己烷定容，极性组分用甲醇定容，并采用实施例1与实施例2 中的分析条件对PCB, OCs, PAH, NP, OP, BPA, TBBPA, E2进行分析。
分析结果显示第一组分中28种PCB的回收率为65%-103%， ct-六六六和 p,p'-DDE的回收率分别为81%和99%;第二组分中PAH的回收率为 54%-124%，其余OCs回收率为91%-114%;第三组分中NP, OP, BPA， TBBPA， E2的回收率也可达到70%-98%。
实施例7:
在镇江化学工业园污水处理厂采集出水15L,通过0.45um滤膜过滤后，以 3 5ml/min的速度每5L通过一个C18固相萃取柱进行现场富集，带回实验室。 萃取柱使用前用10ml甲醇和10ml蒸馏水活化。富集后萃取柱负压真空干燥，以脱去大部分水分，接着用氮气吹干，冷冻保存。采用实施例6中的方法进行有 机物富集，将富集后的有机溶剂等体积分为三份，分别用于总毒性测试(A组)、
毒性追踪(B组)与化学分析(C组)。对A组利用报告基因试验进行毒性测试， 发现出水有机提取物具有强的雌激素活性达到35.1 ng/L当量浓度的E2 (文献 显示1 ng/L的E2已经可以影响鱼的激素分泌)，同时具有强的抗雄激素活性。 为了对毒性进行追踪，对B组与C组两份有机提取物分别进行分级分离，采用 实施例6中的方法，每组都得到三个次组分(F1， F2, F3)。分别对B组的三个 次级组分进行毒性测定，发现抗雄激素活性来自F1组分，而雌激素活性来自F3 组分。再对F1及F3组分进行化学分析，发现F1中PCB浓度较低，均低于0.2 ng/L，但p,p'-DDE浓度较高为67.7pg/L，而p，p'-DDE可以导致强的抗雄激素 活性，是毒性的主要来源；F3中NP浓度较高为28.3|jg/L，是毒性的主要来源。 即污水处理厂出水中主要至毒物质为p，p'-DDE与NP。
实施例8:
在南京城南自来水厂采集进水15L，采用实施例7中的方法进行水样的过滤、 水中有机物的富集及分离等。通过总毒性的测试发现水样有机提取物具有弱的抗 雄激素活性。经分级分离后的毒性测试，发现极性组分与非极性组分没有毒性效 应，毒性来源于中等极性组分(F2)。所以只针对中等极性组分进行化学分析， 发现水厂进水中PAH浓度较高，ZPAH达158.3ng/L，是毒性的主要来源。
10
权利要求
1、一种水中不同极性有机物同柱萃取再分级分离的方法，其包括以下步骤(1)水样通过滤膜过滤后，以3～5mL/min的速度通过固相萃取柱进行富集，萃取柱使用前分别用甲醇和蒸馏水活化，萃取完毕后，萃取柱负压真空干燥；(2)依次用2～6mL正己烷，4～8mL体积比为2～4∶1的甲醇与二氯甲烷混和溶剂洗脱步骤(1)中的萃取柱，将洗脱液分别浓缩，二氯甲烷定容至1mL；(3)将浓缩的样品溶液加入弗罗里硅土柱分离，先后用正己烷、体积比为2～4∶1的正己烷与二氯甲烷混合溶剂和体积比为1～2∶1二氯甲烷与甲醇混合溶剂连续洗脱，将三份流出液分别收集并浓缩，-20℃保存备用。
2、 根据权利要求1所述的水中不同极性有机物同柱萃取再分级分离的方法，其特征在于步骤(1)中滤膜为0.45|jm滤膜。
3、 根据权利要求2所述的水中不同极性有机物同柱萃取再分级分离的方法，其特征在于步骤(1)中固相萃取柱为C18富集柱。
4、 根据权利要求2所述的水中不同极性有机物同柱萃取再分级分离的方法，其特征在于步骤(2)中得到的有机提取物可以用DMSO溶剂替换后进行总毒性的测试。
5、 根据权利要求3所述的水中不同极性有机物同柱萃取再分级分离的方法，其特征在于步骤(3)中弗罗里硅土柱通过以下方法制备称取8~10g弗罗里硅土，利用正己烷湿法填柱于玻璃管中，加入无水Na2S04干燥。
全文摘要
本发明公开了水中不同极性有机物同柱萃取再分级分离的方法。其主要包括以下步骤水样通过滤膜过滤后，通过固相萃取柱进行富集，萃取完毕后，萃取柱负压真空干燥；依次用正己烷，甲醇/二氯甲烷的溶剂洗脱步骤萃取柱，将洗脱液分别浓缩，定容；称取弗罗里硅土填柱于玻璃管中，干燥，将浓缩的样品溶液加入弗罗里硅土柱分离，先后用正己烷、正己烷/二氯甲烷和二氯甲烷/甲醇连续洗脱，将三份流出液分别收集并浓缩，-20℃保存备用。本发明试剂消耗少，成本低，步骤少却能较好富集不同污染水平水体中的有机物，并分离为不同极性的组分。
文档编号B01D15/08GK101537265SQ20091003030
公开日2009年9月23日 申请日期2009年3月18日 优先权日2009年3月18日
发明者于红霞, 薇 史, 福 曹, 王晓祎 申请人:南京大学