一种血液灌流用甲壳素/碳纳米管复合吸附剂及其制备方法与流程

本发明属于天然高分子生物医用材料领域，涉及一种甲壳素/碳纳米管复合吸附剂及其制备方法，应用于血液灌流清除血液中的毒素以及治疗各种肝脏疾病。

背景技术：

肝癌，重症肝炎和肝功能衰竭，是目前严重威胁人民健康的危重疾病，该病发病率高，病情险恶，传统治疗的病死率高，尚无治疗良策，是临床上急待解决的问题。该病的特征在于肝脏功能发生严重障碍，引起体内代谢紊乱，使得大量毒素无法代谢而蓄积在体内，对各个器官产生毒性，引发严重并发症。其中胆红素(Bilirubin BR)是最主要的毒素物质，当肝脏对胆红素的摄取、代谢或者排泄功能发生障碍时，血液中胆红素的浓度会急剧升高，并会沉积在体内各个组织器官中，造成巩膜、皮肤等黄染、肝胆系统的损害甚至导致多器官衰竭，而且胆红素还会透过血-脑屏障，造成大脑神经的不可逆损伤，引发肝性脑病，甚至危害病人生命。因此有效清除患者体内过量的胆红素对肝病治疗至关重要。

肝移植是唯一可治愈严重肝脏疾病的方法，但供体匮乏是肝移植的主要问题。体外人工肝脏支持系统已成为治疗肝病的重要措施，它可作为肝移植过渡支持手段，担负起暂时辅助或代替严重病变的肝脏的功能，清除血液中的各种毒性物质和致病因子，代偿肝脏的代谢功能，保护残留的正常肝细胞，缓解病情，争取更多的治疗时间，并促进肝细胞的再生，直至自体肝脏恢复或等待肝脏移植，使之更好地耐受手术，提高重型肝病患者的生存率与临床疗效。人工肝脏支持系统应用于肝移植术后，还能够帮助患者度过原发性移植肝无功能、移植肝排斥反应、肝移植术后合并多器官功能衰竭等诸多难关，给术后肝细胞功能的恢复创造有利体内环境，促进病人康复，挽救病人生命。

血液灌流是人工肝脏技术的重要组成部分，它有赖于体外吸附系统直接清除血液中的毒素和致病因子，快速有效缓解病情，具有操作方便、安全性高、效果好、价格相对较低的特点。该技术的关键在于选择和设计具有选择性吸附能力强，吸附效率高、生物相容性和血液相容性好的吸附剂材料，而这仍然是急待解决的一项技术难题。

现阶段应用于高胆红素血症的血液灌流吸附剂大多为大孔型阴离子交换树脂。这些树脂带有强碱性基团，吸附效率高，但是其血液相容性差，会引起血液中电解质和凝血系统的紊乱，因此只能采用血浆灌流，不仅增加治疗成本，而且安全性差。市场上大部分血液灌流器的吸附剂材料使用的是聚苯乙烯树脂，该材料原料制备过程会造成环境污染，而且该材料使用后不易自然降解，对环境造成严重破坏。少数可应用于全血灌流的大孔中性树脂，其胆红素清除率极低，无实际应用价值。目前尚没有一种吸附效果优异，选择性清除胆红素能力强，且生物相容性和血液相容性好，可用于全血灌流，价格合理的吸附剂材料。临床急需这类高效友好型吸附剂材料来减轻广大患者的痛苦，降低整体治疗费用，增加治疗的安全性，以使血液灌流技术更广泛有效的应用于疾病的治疗。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种血液灌流用甲壳素/碳纳米管复合吸附剂及其制备方法。

本发明所解决的关键技术问题在于，克服现有吸附剂材料的不足，采用具有良好生物相容性和血液相容性的天然高分子材料甲壳素为载体，通过冷冻解冻的方法，溶解于碱/尿素水体系中，并通过静电、氢键以及亲水疏水相互作用，包覆在碳纳米管表面，使碳纳米管均匀分散于甲壳素的碱尿素水体系中。通过乳化和热诱导自组装过程，可形成甲壳素纳米纤维与甲壳素包覆的碳纳米管交织的多孔纤维网络微球。

本发明的血液灌流用甲壳素/碳纳米管复合吸附剂，为甲壳素纳米纤维与甲壳素包覆的碳纳米管交织的多孔纤维网络微球，微球的粒径在0.1～1mm，纳米纤维尺寸为10～50nm，孔径分布为4～40nm，最可几孔隙分布为5～15nm，比表面积为200～500m²/g，碳纳米管含量1～10％。

该微球具有多尺度多层次的纤维网状结构，以及丰富的适合胆红素自由扩散的通孔孔道，而且富含具有高吸附性能的碳纳米管，对结合与非结合胆红素都具有良好的吸附效果，且该材料具有良好的生物相容性和血液相容性，因此可用于全血灌流的胆红素吸附剂。

该微球表面还可固定一定有效量的活性配基，活性配基的含量为1～1000mg/g。可进一步提高吸附剂的胆红素清除能力以及生物相容性。

所述的活性配基可以是：氨基酸、多肽或者蛋白质。所述活性配基材料是赖氨酸、精氨酸和白蛋白。

该发明吸附剂较之传统胆红素吸附剂，还具有制备工艺简单，成本低，无毒无污染，原料便宜易得，可大规模生产，对胆红素的吸附效率高，选择性强，生物相容性和血液相容好，无凝血及电解质紊乱风险，对血液成分无影响，不仅可用于血浆灌流，也可用于全血灌流清除胆红素，治疗各种肝脏疾病。

所述的血液灌流用甲壳素/碳纳米管复合吸附剂的制备方法，制备步骤为：

(1)、将一定量的甲壳素粉末分散在氢氧化钠、尿素和去离子水组成的溶剂中，加入酸化处理的碳纳米管，酸化碳纳米管的加入量是甲壳素重量的1％～10％，并在零下10℃至零下30℃下冷冻，然后在室温下搅拌解冻，冷冻-解冻3个循环后，在0～5℃条件下，离心脱泡并去掉未溶解的杂质，得到均匀的甲壳素/碳纳米管复合溶液，并保存在0～5℃备用；

(2)、将一定量分散剂加入到有机相中并在0℃条件下搅拌10～120分钟；

(3)、将步骤(1)所配制的溶液倒入步骤(2)的溶液中，在0℃条件下以10～1300转/分钟搅拌10～120分钟；

(4)、撤去冰浴，将步骤(3)中溶液的温度升高到60～100℃，并保持反应1～30分钟；

(5)、将稀酸滴加到步骤(4)的混合液中至pH中性，并保持反应1～30分钟，静置分层，回收上层油相，并将下层甲壳素/碳纳米管复合纳米纤维微球倒入凝固浴中静置，用无水乙醇和去离子水反复洗涤以去掉其中的分散剂和有机相。

所述甲壳素为虾壳蟹壳经过一定的纯化步骤后获得的甲壳素初产品，或者为经过一定的步骤纯化漂白该初产品而获得的纯化甲壳素。其分子量为10000～500000，其加入量是所加入溶剂质量的3％～7％。

所述碳纳米管可为多壁碳纳米管，单壁碳纳米管等，所述碳纳米管为多壁碳纳米管，其直径为10～50nm，长度为0.1～30μm，纯度>95％，比表面积100～150m²/g。

所述酸化处理的方法为：将一定量的碳纳米管加入到浓度为70～98wt％的浓硫酸中搅拌均匀，再加入浓度为50～70wt％的浓硝酸，并在40～80℃条件下加热回流1～8h，冷却后倒入至大量去离子水中稀释，静置12小时，弃上清液，将底部黑色沉淀装入规格为5000～10000Da的透析袋中，透析2～5天，置换掉其中的小分子，使其表面得到平衡，获得可长期稳定分散的水性碳纳米管分散液。然后进行冷冻干燥，制得酸化的碳纳米管粉末。所述甲壳素/碳纳米管复合纳米纤维微球中酸化碳纳米管的加入量是甲壳素重量的1％～10％。

所述碳纳米管酸化中，浓硫酸与浓硝酸体积比为1～3:1。

所述氢氧化钠、尿素的加入量分别是溶剂总质量的2％～20％和1％～10％。

所述分散剂为吐温、油酸、或者司班，其加入体积是有机相体积的1％～20％。

所述有机相是液体石蜡或者异辛烷，其体积与甲壳素/碳纳米管复合溶液体积的比例是0.5～3:1。

所述凝固浴为水，20～100wt％乙醇，酮，酯，1～20wt％NaSO4的水溶液，1～20wt％(NH4)SO4的水溶液，或(CH3)2CO等，凝固时间为0.5～8h，凝固温度为0～40℃。

优选地，所述甲壳素/碳纳米管复合吸附剂的粒径在0.1～1mm，可适用于血浆灌流和全血灌流等不同的血液灌流治疗方案。

如果制备含活性配基的甲壳素/碳纳米管复合吸附剂，还包括如下步骤：

(6)、在步骤(5)所得的微球上固定一定量的氨基酸或者白蛋白，装入5000～10000Da的透析袋中，用去离子水透析3天，去掉其中未反应的小分子，然后用置换液置换其中的水分，经液氮淬冷后冷冻干燥，获得氨基酸或者白蛋白包覆的甲壳素/碳纳米管复合纳米纤维微球吸附剂；所述氨基酸或者白蛋白的固载量为1～1000mg/g微球。

所述置换液可为低沸点，易挥发的醇类、酮类、醚类、酯类等。所述置换液为：乙醇、叔丁醇、丙酮等。

所述氨基酸或者白蛋白的固化方法为：将步骤(5)制备的微球浸泡在浓度为0.1～5mg/mL氨基酸或者白蛋白水溶液中，浸泡1～4小时，回收未反应的溶液，加入浓度为0.025％～1％交联剂水溶液，在10～40℃下反应1～4小时，过滤，回收未反应交联剂溶液，再向微球中加入一定量的氨基酸或者白蛋白水溶液，反应1～4小时。

所述固化反应所用交联剂可为环氧氯丙烷，戊二醛，京尼平，二环己基碳二亚胺/4-二甲氨基吡啶(DCC/DMAP)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚/N-羟基琥珀酰亚胺(EDC/NHS)等。交联剂的浓度为0.01～5％。

所述氨基酸或者白蛋白的固化方法还可以为：将步骤(5)制备的微球置于0.1～5M NaOH溶液中，加入环氧氯丙烷，于20～60℃条件下反应1～5小时，得到活化后的微球。将活化的微球与氨基酸在pH大于8的碱性溶液中，于20～80℃条件下反应4～24小时。水洗后，加入乙醇胺溶液在室温下反应1～6小时封闭未反应的环氧基团，水洗去掉多余的乙醇胺。

所述氨基酸为赖氨酸，精氨酸等。

所制备的微球吸附剂具有多孔纳米纤维网状结构，有利于胆红素吸附。该微球的基本载体为甲壳素，该材料的特性使得甲壳素/碳纳米管复合纳米纤维微球对白蛋白及血小板的吸附量小。且由于甲壳素具有良好的生物相容性，该微球在血液中孵育无溶血现象，与红细胞的相容性好，且对人体血管内皮细胞和人肝细胞无毒，对血液中的凝血系统和电解质体系无影响。既可用于血浆灌流清除胆红素，也可用于全血灌流。细胞培养实验还显示，细胞在甲壳素/碳纳米管复合纳米纤维微球表面可大量粘附生长，因此可以作为肝细胞的培养载体，用于生物型人工肝设备，或者作为吸附材料和培养载体协同使用。

本发明的优点如下：首先，所采用的原材料价廉，为可再生资源；其次，制备方法简单，无需额外耗能，大大减少环境污染，降低生产成本，易于推广应用；此方法通过物理溶解的方法，使甲壳素溶解于碱/尿素水溶液中，并通过静电、氢键以及亲水疏水相互作用，与碳纳米管结合，使碳纳米管均匀分散在甲壳素溶液中，该方法避免了对甲壳素和碳纳米管结构的破坏，保持其优良的特性。该微球的尺寸及孔径可调节，有利于制备合适的吸附材料用于对各种毒素的吸附。所制备的甲壳素/碳纳米管复合纳米纤维微球具有优越的吸附性能及良好的生物相容性和血液相容性，动物实验表明，此类吸附剂无毒无副作用，无热源，对血液中各种成分如：红细胞、白细胞、血小板、白蛋白等均无影响。且对凝血系统和电解质平衡等均无影响。可以直接用于全血灌流来治疗高胆红素血症，是一种良好的医用血液净化吸附材料，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1是甲壳素/碳纳米管复合纳米纤维微球的SEM图。

图2是甲壳素/碳纳米管复合纳米纤维微球表面放大的SEM图。

图3是不同吸附剂对人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)的毒性实验。

图4是不同吸附剂对人正常肝细胞(L-02)的毒性实验。

图5是人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)附着在甲壳素/碳纳米管复合纳米纤维微球上生长的SEM图。

图6是不同吸附剂对血浆中总胆红素的清除率测试结果图。

具体实施方式

以下结合具体的实施例对本发明的技术方案和应用作进一步说明。

实施例1甲壳素/碳纳米管复合纳米纤维微球的制备

甲壳素/NaOH/尿素水溶液的制备方法为现有技术，按照ZL200310111566.3公开的方法使用。将4g甲壳素粉末分散在96g NaOH/尿素水溶液中搅拌10min(NaOH：尿素＝11:4)，在-35℃下冷冻4小时，然后在室温下搅拌解冻。冷冻/解冻3个循环后得到澄清透明的重量百分浓度为4％的甲壳素溶液，将此甲壳素溶液在4℃，7000rad/min条件下离心10min，脱泡并去掉未溶解的杂质，得到甲壳素溶液备用。

将1g购买的碳纳米管加入到150mL浓硫酸中，磁力搅拌30min，加入50mL浓硝酸，60℃回流条件下磁力搅拌2h，冷却后倒入至大量去离子水中稀释，静置12小时，去上层清液，将底部黑色沉淀装入8000Da的透析袋，用去离子水中透析3天，置换掉其中的小分子，使其表面得到平衡，获得可长期稳定均匀分散的碳纳米管水性分散液。该碳纳米管水性分散液可用旋蒸仪进行浓缩，至一定浓度备用，或者进行冷冻干燥，获得酸化的碳纳米管粉末，置于干燥器中备用。碳纳米管购买自中科时代纳米成都有机化学所，所购碳纳米管为多壁碳纳米管，其直径为10～30nm，长度为10～30μm，纯度>95％，比表面积100～150m²/g。

将4g甲壳素粉末和0.04g酸化的碳纳米管粉末分散在96g 11wt％NaOH/4wt％尿素/85wt％水的混合物中搅拌10min，置于-35℃冷阱中冷冻4小时，然后在室温下搅拌解冻。冷冻/解冻3个循环后得到溶解分散均匀的甲壳素/碳纳米管复合溶液，然后在4℃，7000rad/min条件下离心10min，脱泡并去掉未溶解的杂质，得到甲壳素/碳纳米管复合溶液备用。将5mL司班85加入到100mL异辛烷中，在0℃下，800rad/min搅拌1h，再加入100mL甲壳素/碳纳米管复合溶液继续搅拌1h，撤去冰浴，将水浴锅温度升高至80℃，保持搅拌速度和热水浴温度持续搅拌10分钟，滴加10％的稀盐酸调节混合液的pH值至7.0。静置，待混合物体系分成二层，倒掉上层有机相异辛烷和多余乳化剂，下层甲壳素/碳纳米管复合纳米纤维微球倒入低速搅拌的无水乙醇中固化分散1h，静置，弃去上层无水乙醇，另用干净无水乙醇浸泡24h，再用蒸馏水多次漂洗后得到再生甲壳素/碳纳米管复合纳米纤维微球，在20％乙醇溶液中在0-5℃条件下保存，或者用叔丁醇反复置换微球中水分，并用液氮淬冷后冷冻干燥保存。通过扫描电子显微镜观察，所制备的甲壳素/碳纳米管复合纳米纤维微球的平均粒径约为200μm，如图1所示，而且微球的表面呈现甲壳素纳米纤维与甲壳素包覆的碳纳米管交织的多孔纤维网络结构，如图2所示。通过氮气吸附(BET)实验结果显示，该复合微球的比表面积为291m²/g，平均孔体积0.60cm³/g，平均孔径9nm。

实施例2甲壳素/碳纳米管复合纳米纤维微球的制备

将4g甲壳素粉末和0.2g酸化的碳纳米管粉末分散在96g 11wt％NaOH/4wt％尿素/85wt％水的混合物中搅拌10min，置于-35℃冷阱中冷冻4小时，然后在室温下搅拌解冻。冷冻/解冻3个循环后得到溶解分散均匀的甲壳素/碳纳米管复合溶液，加入2mL环氧氯丙烷，在0℃下搅拌30分钟，然后在4℃，7000rad/min条件下离心10min，脱泡并去掉未溶解的杂质，得到甲壳素/碳纳米管复合溶液并置于4℃冰箱2小时备用。将5mL司班85加入到100mL异辛烷中，在0℃下，800rad/min搅拌1h，再加入100mL环氧氯丙烷交联的甲壳素/碳纳米管复合溶液继续搅拌1h，撤去冰浴，将水浴锅温度升高至80℃，保持搅拌速度和热水浴温度持续搅拌10分钟，再滴加10％的稀盐酸调节混合液的pH值至7.0。静置，待混合物体系分成二层，倒掉上层有机相异辛烷和多余乳化剂，下层甲壳素/碳纳米管复合纳米纤维微球倒入低速搅拌的无水乙醇中固化分散1h，静置，弃去上层无水乙醇，另用干净无水乙醇浸泡24h，再用蒸馏水多次漂洗后得到再生甲壳素/碳纳米管复合纳米纤维微球，在20％乙醇溶液中在0-5℃条件下保存，或者用叔丁醇反复置换微球中水分，并用液氮淬冷后冷冻干燥保存。制得的甲壳素/碳纳米管复合纳米纤维微球平均粒径为230μm，比表面积为291m²/g，平均孔体积0.60cm³/g，平均孔径9nm。

实施例3甲壳素/碳纳米管复合纳米纤维微球的制备

将50g碳纳米管分散液加入到100g甲壳素溶液中，并在冰浴中1200rad/min搅拌1h，将混合液在-35℃下冷冻4小时，然后在室温下搅拌解冻，低温离心脱泡并去掉未溶解的杂质，得到碳纳米管分散均匀的甲壳素/碳纳米管混合溶液。将10mL司班85加入到100mL异辛烷中，在0℃下，800rad/min搅拌1h，再加入150mL甲壳素/碳纳米管复合溶液继续搅拌1h，撤去冰浴，将水浴锅温度升高至80℃，保持搅拌速度和热水浴温度持续搅拌10分钟，再滴加10％的稀盐酸调节混合液的pH值至7.0。静置，待混合物体系分成二层，倒掉上层有机相异辛烷和多余乳化剂，下层甲壳素/碳纳米管复合纳米纤维微球倒入低速搅拌的无水乙醇中固化分散1h，静置，弃去上层无水乙醇，另用干净无水乙醇浸泡24h，再用蒸馏水多次漂洗后得到再生甲壳素/碳纳米管复合纳米纤维微球，在20％乙醇溶液中在0-5℃条件下保存，或者用叔丁醇反复置换微球中水分，并用液氮淬冷后冷冻干燥保存。制得的甲壳素/碳纳米管复合纳米纤维微球平均粒径为240μm，比表面积为302m²/g，平均孔体积0.65cm³/g，平均孔径9nm。

实施例4赖氨酸包覆甲壳素/碳纳米管复合微球的处理方法

将50mL甲壳素/碳纳米管复合纳米纤维微球分散在250mL浓度为1mg/mL的赖氨酸溶液中，室温震荡吸附4小时，静置，回收上层溶液，再向其中加入100mL浓度为0.25％的戊二醛溶液，40℃条件下反应4小时，冷却过滤，回收交联剂溶液，并用去离子水反复洗涤微球，再加入至100mL浓度为1mg/mL的赖氨酸溶液中，室温震荡反应4小时，用去离子水反复洗涤微球，在20％乙醇溶液中在0-5℃条件下保存，或者用叔丁醇反复置换微球中水分，并用液氮淬冷后冷冻干燥保存。

实施例5细胞毒性实验

将冷冻干燥的微球用无菌PBS置换多次，并配成浓度为5mg/mL的混合液，并高压灭菌备用。将200μL人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)或者人正常肝细胞(L-02)按照10000个细胞/孔数量加入到96孔板中，然后置于37℃，5％CO2环境下用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基培养24h，更换新鲜培养基并加入微球混合液(20μL/孔)，同时把培养基作为对照组。细胞培养24h后在每孔中加入20μL CCK8溶液，然后置于培养箱中在同样条件下放置2h。取每孔上清液150μL于新的96孔板中，在450nm波长下测定其吸光度值A。细胞成活率(cell viability)可以按照下面公式进行计算：Cell viability(％)＝Atest/Acontrol x 100％(Atest和Acontrol分别代表测试组和对照组的吸光度值)。细胞毒性实验显示甲壳素微球材料具有很好的生物相容性，该材料与细胞工培养后，细胞的成活率接近100％，显示该材料没有毒性，如图3和4所示。然而单纯的碳纳米管显示具有较强的毒性，因此，甲壳素的引入，可大大改善材料的生物相容性和安全性。

实施例6细胞培养实验

将冷冻干燥的微球用无菌PBS置换多次，并配成浓度为5mg/mL的混合液，并高压灭菌，将50μL微球PBS混合液转移到24孔培养板中。将1mL人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)或者人正常肝细胞(L-02)悬浮液(50000cells/mL的细胞密度)加入到每个试样中，然后置于37℃，5％CO2环境下用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基培养48h。使用DAPI染料对细胞核进行染色：吸掉培养基，并用PBS洗涤两遍，每孔加入300μL DAPI染色液(碧云天)避光室温下染色15min，吸掉染色液，加入PBS，轻轻缓慢清洗细胞3次，再用1mL 4％多聚甲醛室温固定10-15min，加入PBS清洗2遍，最后加入1mLPBS，利用荧光显微镜在相应激发波长(Ex/Em＝484/501nm)下观察和拍摄荧光染色处理的微球和细胞。将固定后的细胞，用梯度的叔丁醇脱水，用液氮淬冷，冷冻干燥后，喷金，并用扫描电镜观察微球和细胞的形貌。结果显示甲壳素微球具有非常好的细胞亲和性，细胞能在微球表面黏附生长，表明甲壳素具有很好的生物相容性，如图5所示。

实施例7胆红素水溶液中的静态吸附实验

1、胆红素水溶液的配制：在避光的条件下，称取不同质量20mg的胆红素，用2mL 0.1mol/L的NaOH溶液溶解，转移至100mL容量瓶中，用pH＝7.4PBS磷酸缓冲溶液稀释至刻度混匀，配制浓度为200mg/L的胆红素吸附液。

2、胆红素蛋白溶液的配制：在避光的条件下，向200mg/L的胆红素吸附液中加入200mg牛血清白蛋白，配制成蛋白浓度为1mg/mL的胆红素吸附液。

3、胆红素的吸附实验：分别准确称取干燥的10mg吸附材料，加入10mL浓度为200mg/L的胆红素溶液，在37℃恒温下避光振荡3h，取上层清液，用总胆红素试剂盒检测吸附材料的吸附率E。吸附率：E＝(C0-C1)/C0*100％；吸附量：Q＝(C0-C1)/C0*V/(1000*m)。式中C0、C1分别为吸附前及吸附达平衡后溶液中胆红素的质量浓度(mg/L)，m为吸附材料的质量(g)，V为移取的胆红素吸附液体积(mL)。结果显示赖氨酸包覆的甲壳素/碳纳米管微球的胆红素吸附量达107mg/g。

实施例8血浆中胆红素的静态吸附实验

抽取总胆管结扎2d后的黄疸动物模型的新鲜兔血，按照血：枸橼酸钠＝9:1抗凝，将血液标本经过2000r/min离心10min，取上清液得到黄疸血浆，分装保存于-20℃冰箱，用于血浆吸附试验。称取10mg微球样品，加入2mL血浆，37℃吸附4h后，取上清液于自动生化仪上检测血浆中谷丙转氨酶(ALT)，谷草转氨酶(AST)，总胆红素(TBIL)，直接胆红素(DBIL)，乳酸脱氢酶(LDH)，总蛋白(TP)的含量，结果显示赖氨酸包覆的甲壳素/碳纳米管微球对血浆中胆红素的清除率达到37％，如图6所示，而且对总蛋白基本无影响。