本发明属于生物技术领域中的蛋白质复性技术，具体为一种α-丁酮酸修饰的接枝聚乙烯亚胺的壳聚糖微球及其制备方法，以及在蛋白质复性中的应用。
背景技术：
随着基因重组技术的快速发展，以重组蛋白质为主要成份的基因工程药物已逐步占据医药领域的重要位置。但重组蛋白质在宿主细胞中的高表达常常导致其发生错误折叠和聚集，错误折叠和聚集的蛋白质不具有生物活性，必须在体外对其进行溶解变性使其肽链伸展，然后在合适的溶液环境下使其恢复其天然构型和生物活性。使蛋白质恢复其天然构型和生物活性的过程称为蛋白质的体外再折叠或复性。在蛋白质复性过程中，疏水作用引发的蛋白质分子内的折叠与分子间的聚集为动力学竞争过程，后者的发生会导致复性收率的降低。因此，如何有效地抑制蛋白质聚集，是实现高效复性的关键。
传统的抑制蛋白质复性过程中的蛋白质聚集的方法有：稀释复性、可溶性添加剂辅助复性以及色谱复性等。稀释复性操作简单，但若复性系统混合不利，会使局部蛋白质浓度过高，从而引起蛋白质复性收率下降。可溶性添加剂辅助复性中，多数添加剂能够有效地抑制蛋白质聚集、提高复性收率，但是添加剂的加入往往会在复性体系中引入新的杂质，在后续的分离过程中必须去除。色谱复性可以同时实现目标蛋白质的(部分)分离纯化以及复性，还可以通过调节变性剂或添加剂的浓度来优化色谱复性过程。但是，色谱复性设备昂贵，且操作条件需要严格的优化和控制，才能达到较好的复性效果。
近来有报道提出利用与蛋白质带有同种电荷的微球抑制蛋白质聚集、促进蛋白质复性的方法(mono-sizedmicrospheresmodifiedwithpoly(ethylenimine)facilitatetherefoldingoflike-chargedlysozyme.reactiveandfunctionalpolymers,2012,72(11):889-896)。该方法中与蛋白质带有同种电荷的微球能够诱导表面电荷分布不均的蛋白质分子以相反电荷朝向荷电微球表面的形式在微球表面附近发生定向排列。这种定向排列会增大蛋白质分子间的静电排斥作用，从而抑制蛋白质聚集、促进蛋白质复性。与传统的复性方法相比，与蛋白质带有同种电荷的微球辅助蛋白质复性方法操作简单、不会对蛋白质造成污染、微球回收方便且无需昂贵的大型设备。
壳聚糖(chitosan，cs)是一种无毒性的天然碱性多糖，分子中含有伯胺及羟基基团。聚乙烯亚胺(poly(ethylenimine)，pei)是一种阳离子聚电解质，分子上含有大量伯胺、仲胺及叔胺基团，完全质子化时电荷密度可高达23.3meq/g。按照中国发明专利(cn104258830b)所述方法，利用乳化交联法制备交联壳聚糖微球并对其表面进行醛基化，在表面醛基化的交联壳聚糖微球表面接枝聚乙烯亚胺制备得到接枝聚乙烯亚胺的壳聚糖微球cs-pei。该cs-pei微球是一种阴离子交换微球，其表面的伯胺、仲胺及叔胺等弱碱性基团，可通过质子化而带正电荷，因此可以辅助在复性条件下带正电荷的蛋白质复性。但是，由于cs-pei微球表面只含有弱碱性基团，只能通过质子化而带正电荷，所以在辅助带正电荷的蛋白质复性后不能对带正电荷的蛋白质进行吸附提取(静电吸附作用只发生在带相反种类电荷的物质之间)；而且，由于cs-pei微球只含有弱碱性基团，所以也不能辅助在复性条件下带负电荷的蛋白质复性。
技术实现要素：
本发明的目的在于针对当前技术中存在的不足，提供一种α-丁酮酸(α-ketobutyricacid，ka)修饰的接枝聚乙烯亚胺的壳聚糖微球，并将其应用于蛋白质复性中，可辅助蛋白质复性并对蛋白质进行吸附提取。该方法选用α-丁酮酸作为修饰剂，并通过对物料配比、浓度以及相关参数的研究，制备得到了一种既含有弱碱性基团又含有弱酸性基团的两性离子交换微球。
本发明的技术方案为：
一种α-丁酮酸修饰的接枝聚乙烯亚胺的壳聚糖微球(cs-pei-ka)，该微球为表面接枝聚乙烯亚胺的壳聚糖微球(cs-pei)，表面再修饰有α-丁酮酸(ka)，其中，微球上接枝的聚乙烯亚胺的量以阴离子交换容量计为918～1275μmol/g，修饰的α-丁酮酸的量以阳离子交换容量计为612～1860μmol/g，微球的等电点值为5.5～10.0。
所述的α-丁酮酸修饰的接枝聚乙烯亚胺的壳聚糖微球的制备方法，包括以下步骤：
将cs-pei微球置于锥形瓶中，加入浓度为0.5～5g/l的α-丁酮酸溶液，使微球在反应体系中的浓度为80～100g/l，并用naoh溶液调节体系ph值为4～6，然后将体系置于空气振荡器中，在温度为25～30℃、转速为120～170rpm条件下反应6～8h；再将微球用去离子水，在转速为5000～8000rpm条件下离心水洗干净后，加入0.5～0.6g/lnabh4溶液，使微球在体系中的浓度为80～100g/l，并用hcl溶液调节体系ph值为7～8，然后将体系置于空气振荡器中，在温度为25～30℃、转速为120～170rpm条件下反应12～24h；反应结束后，将微球用去离子水，在转速为5000～8000rpm条件下离心水洗，得到α-丁酮酸修饰的接枝聚乙烯亚胺的壳聚糖微球(cs-pei-ka)。
所述的naoh溶液的浓度为0.1～0.5mol/l，hcl溶液的浓度为0.1～0.5mol/l。
所述的α-丁酮酸修饰的接枝聚乙烯亚胺的壳聚糖微球的应用，用于辅助蛋白质复性并对蛋白质进行吸附提取。首先要测定上述在不同制备条件下制备得到的cs-pei-ka微球的阳离子交换容量和等电点值，将具备适宜等电点值的cs-pei-ka微球加入到蛋白质复性缓冲液中，然后加入变性蛋白质溶液进行蛋白质复性，复性完成后，调节溶液ph值对蛋白质进行吸附提取。
复性和吸附完成后离心收集微球，用nacl溶液解吸并离心，收集上清液经透析脱盐后为蛋白质溶液，收集微球经离心水洗后可回收利用。
所述的应用方法包括如下步骤：
1)确定待复性及吸附提取的蛋白质的等电点值，然后将其与下一步将要使用的复性缓冲液的ph值相比；如果蛋白质的等电点值大于复性缓冲液的ph值，则从所述的α-丁酮酸修饰的接枝聚乙烯亚胺的壳聚糖微球中选取等电点值也大于复性缓冲液的ph值的微球；如果蛋白质的等电点值小于复性缓冲液的ph值，则从所述的α-丁酮酸修饰的接枝聚乙烯亚胺的壳聚糖微球中选取等电点值也小于复性缓冲液的ph值的微球；
所述的复性缓冲液中含有1～2mol/l尿素、20～50mmol/ltris–hcl及1～3mmol/ledta，溶剂为去离子水，且ph值为7.0～9.0；
2)将cs-pei-ka微球加入到复性缓冲液中，使复性体系中微球浓度为100～150g/l；上述混合物置于空气振荡器中，在温度为25～30℃、转速为120～170rpm条件下振荡预平衡直至温度恒定；然后向其中加入待复性的浓度为10～20g/l变性蛋白质溶液，使复性体系中蛋白质浓度为0.5～2g/l；混合均匀后，置于空气振荡器中，在转速为120～170rpm条件下复性3～12h，复性温度与此前复性缓冲液预平衡的温度相同；
所述的变性蛋白质溶液的制备方法为：将蛋白质溶解于变性缓冲液中，使蛋白质浓度为10～20g/l，于25～40℃变性3～24h；
所述的变性缓冲液中含有8mol/l尿素、20～50mmol/ltris–hcl及1～3mmol/ledta，溶剂为去离子水，且ph值为7.0～9.0；
3)复性完成后，用0.1～0.5mol/l的naoh溶液或0.1～0.5mol/l的hcl溶液调节上述体系ph值为6.0～10.0，从而将步骤2)中的复性缓冲液变为吸附缓冲液，将体系置于空气振荡器中，在温度为25～30℃、转速为120～170rpm条件下吸附3～12h。
所述步骤3)中，吸附缓冲液ph值为介于步骤2)中cs-pei-ka微球的等电点值及蛋白质的等电点值之间的ph值。
所述的蛋白质为在复性过程中易发生聚集的蛋白质，优选为溶菌酶、牛碳酸酐酶ii(caii)或重组人γ-干扰素。
对于含有二硫键的蛋白质复性，所述的变性缓冲液中还可以含有浓度为10～20mmol/l二硫苏糖醇(dtt)，所述的复性缓冲液中还可以含有浓度为2～5mmol/l氧化型谷胱甘肽(gssg)和6～15mmol/l还原型谷胱甘肽(gsh)。
所述回收利用cs-pei-ka微球的方法为：复性和吸附完成后，在转速为5000～8000rpm条件下离心收集微球，将收集到的微球加入到浓度为1～2mol/l的nacl溶液中，使微球浓度为10～50g/l，在温度为25～30℃、转速为120～170rpm条件下解吸3～12h，然后在转速为5000～8000rpm条件下离心，收集上清液经透析脱盐后为蛋白质溶液，收集微球在转速为5000～8000rpm条件下反复离心水洗，制备得到再生微球。
本发明的实质性特点为：
1)本发明制备了一种既含有弱碱性基团又含有弱酸性基团的两性离子交换微球。在按照先前专利(cn104258830b)所述方法制备得到含有弱碱性基团的阴离子交换cs-pei微球基础上，本发明进一步在cs-pei微球表面修饰α-丁酮酸，制备得到的cs-pei-ka微球上既含有弱碱性基团又含有弱酸性基团。2)之前的只含有弱碱性基团的阴离子交换cs-pei微球只能辅助在复性条件下带正电荷的蛋白质复性，不能辅助在复性条件下带负电荷的蛋白质复性，而且在辅助带正电荷的蛋白质复性后不能吸附提取蛋白质。本专利在不同的制备条件下可制备得到具有不同等电点值的cs-pei-ka微球，根据待复性及吸附提取的蛋白质的等电点值和复性缓冲液的ph值，选用具有适宜等电点值的cs-pei-ka微球，对在复性条件下带正电荷的蛋白质或带负电荷的蛋白质均能有效地辅助复性，且在复性完成后可通过调节溶液ph值而吸附提取蛋白质。
本发明的有益效果为：
本发明所述的α-丁酮酸修饰的接枝聚乙烯亚胺的壳聚糖微球应用于蛋白质复性具有以下优点：
第一，本发明的两性离子交换微球弥补了只含有碱性/酸性基团的阴离子交换/阳离子交换微球在辅助蛋白质复性后不能吸附提取蛋白质方面的不足。之前的阴离子交换cs-pei微球表面只含有弱碱性基团，质子化后带正电荷，能够辅助在复性条件下带正电荷的蛋白质复性，但是在复性后不能吸附提取带正电荷的蛋白质。按照本发明方法制备阴离子交换容量为1275±37μmol/g、阳离子交换容量为966±28μmol/g、等电点值为9.0±0.2的两性离子交换cs-pei1275-ka966-9微球，其在ph8.0下辅助带正电荷的等电点值为11.0的碱性蛋白质溶菌酶复性的复性收率为92.2±3.1％，与阴离子交换容量为1275±37μmol/g的阴离子交换cs-pei1275微球辅助溶菌酶复性的复性收率(94.6±4.4％)相近，远高于不添加微球的溶菌酶复性收率(54.6±2.4％)。在复性完成后，调节体系ph值至9.8，阴离子交换cs-pei1275微球完全不能吸附提取溶菌酶，活性回收率为0％，而本发明的cs-pei1275-ka966-9微球能够对溶菌酶进行吸附提取，溶菌酶活性回收率高达60.1±2.6％。所以按照本发明方法制备并选用具有适宜等电点值的两性离子交换cs-pei-ka微球，其在复性ph值下能够辅助蛋白质复性，在吸附ph值下能够吸附提取蛋白质，这就弥补了只含有碱性/酸性基团的阴离子交换/阳离子交换微球在辅助蛋白质复性后不能吸附提取蛋白质方面的不足。
第二，本发明的两性离子交换微球弥补了只含有碱性/酸性基团的阴离子交换/阳离子交换微球只能辅助与微球带有同种电荷的蛋白质复性方面的不足。之前的cs-pei微球表面只含有弱碱性基团，质子化后带正电荷，能够辅助在复性条件下带正电荷的蛋白质复性，但不能辅助在复性条件下带负电荷的蛋白质复性。如之前的阴离子交换容量为918±40μmol/g的阴离子交换cs-pei918微球，在ph7.5下辅助带负电荷的等电点值为5.9的酸性蛋白质牛碳酸酐酶ii(caii)复性的复性收率为13.2±1.2％，低于不添加微球的caii复性收率(53.5±3.1％)，即cs-pei918微球不能辅助caii复性。按照本发明方法制备阴离子交换容量为918±40μmol/g、阳离子交换容量为928±36μmol/g、等电点值为7.0±0.1的两性离子交换cs-pei918-ka928-7微球，其辅助caii复性的复性收率为93.4±4.5％，远高于不添加微球的caii复性收率(53.5±3.1％)，即cs-pei918-ka928-7微球可有效地辅助caii复性。所以按照本发明方法制备并选用具有适宜等电点值的两性离子交换cs-pei-ka微球，对在复性条件下带正电荷(如溶菌酶)或负电荷(如caii)的蛋白质都能有效地辅助复性，这就弥补了只含有碱性/酸性基团的阴离子交换/阳离子交换微球只能辅助与微球带有同种电荷的蛋白质复性方面的不足。
第三，与辅助蛋白质复性的其他可溶性添加剂相比，本发明的cs-pei-ka微球作为固相存在于复性体系中，不会污染复性体系。
第四，cs-pei-ka微球在辅助蛋白质复性和吸附提取蛋白质后易于回收，经nacl溶液解吸后可再生。例如应用于溶菌酶复性的cs-pei1275-ka966-9微球，在经过5次辅助复性-吸附提取-解吸再生循环之后，对溶菌酶的复性收率和活性回收率比初次使用时分别降低了11.7％和14.3％，在经过15次以上辅助复性-吸附提取-解吸再生循环之后，复性收率和活性回收率才会分别降至初次使用时的复性收率和活性回收率的50％以下，表明cs-pei-ka微球具有良好的重复使用性。
第五，cs-pei-ka微球的制备工艺简单、成本较低。
附图说明
图1：实施例1、实施例2及实施例3中不同α-丁酮酸浓度下制备的cs-pei918-ka微球的阳离子交换容量和等电点值。
图2：实施例4、实施例5及实施例6中不同α-丁酮酸浓度下制备的cs-pei1275-ka微球的阳离子交换容量和等电点值。
图3：实施例7中的cs-pei1275-ka966-9微球辅助溶菌酶复性的复性收率及经微球吸附提取后溶菌酶的活性回收率。
图4：实施例8中的cs-pei918-ka928-7微球辅助牛碳酸酐酶ii复性的复性收率及经微球吸附提取后牛碳酸酐酶ii的活性回收率。
具体实施方式
下面的实例将对本发明提供的方法予以进一步的说明。
本发明所述制备接枝聚乙烯亚胺的壳聚糖微球(cs-pei)的方法为公知技术，具体参见文献(中国发明专利：cn104258830b)。
实施例1：
按照文献(中国发明专利：cn104258830b)所述方法制备阴离子交换容量为918±40μmol/g的cs-pei微球(命名为cs-pei918)，在cs-pei918微球表面修饰α-丁酮酸制备得到的两性离子交换微球命名为cs-pei918-ka。
将经g3漏斗抽干的1.8g上述cs-pei918微球置于锥形瓶中，加入20ml浓度为0.7g/l的α-丁酮酸溶液，使微球在反应体系中的浓度为90g/l，并用0.3mol/l的naoh溶液调节体系ph值为4，然后将体系置于空气振荡器中，在温度为25℃、转速为120rpm条件下反应6h；再将微球用去离子水，在转速为5000rpm条件下离心水洗干净后，加入20ml浓度为0.5g/l的nabh4溶液，使微球在体系中的浓度为90g/l，并用0.3mol/l的hcl溶液调节体系ph值为7，然后将体系置于空气振荡器中，在温度为25℃、转速为120rpm条件下反应18h；反应结束后，将微球用去离子水，在转速为5000rpm条件下离心水洗，制备得到cs-pei918-ka微球的阳离子交换容量为612±24μmol/g，等电点值为9.9±0.2，以其阴离子交换容量、阳离子交换容量以及等电点值命名为cs-pei918-ka612-9.9(图1)。
实施例2：
将经g3漏斗抽干的1.8g上述cs-pei918微球置于锥形瓶中，加入20ml浓度为2.0g/l的α-丁酮酸溶液，使微球在反应体系中的浓度为90g/l，并用0.3mol/l的naoh溶液调节体系ph值为4，然后将体系置于空气振荡器中，在温度为25℃、转速为120rpm条件下反应6h；再将微球用去离子水，在转速为5000rpm条件下离心水洗干净后，加入20ml浓度为0.5g/l的nabh4溶液，使微球在体系中的浓度为90g/l，并用0.3mol/l的hcl溶液调节体系ph值为7，然后将体系置于空气振荡器中，在温度为25℃、转速为120rpm条件下反应18h；反应结束后，将微球用去离子水，在转速为5000rpm条件下离心水洗，制备得到cs-pei918-ka微球的阳离子交换容量为928±36μmol/g，等电点值为7.0±0.1，以其阴离子交换容量、阳离子交换容量以及等电点值命名为cs-pei918-ka928-7(图1)。
实施例3：
将经g3漏斗抽干的1.8g上述cs-pei918微球置于锥形瓶中，加入20ml浓度为4.2g/l的α-丁酮酸溶液，使微球在反应体系中的浓度为90g/l，并用0.3mol/l的naoh溶液调节体系ph值为4，然后将体系置于空气振荡器中，在温度为25℃、转速为120rpm条件下反应6h；再将微球用去离子水，在转速为5000rpm条件下离心水洗干净后，加入20ml浓度为0.5g/l的nabh4溶液，使微球在体系中的浓度为90g/l，并用0.3mol/l的hcl溶液调节体系ph值为7，然后将体系置于空气振荡器中，在温度为25℃、转速为120rpm条件下反应18h；反应结束后，将微球用去离子水，在转速为5000rpm条件下离心水洗，制备得到cs-pei918-ka微球的阳离子交换容量为1276±22μmol/g，等电点值为5.5±0.1，以其阴离子交换容量、阳离子交换容量以及等电点值命名为cs-pei918-ka1276-5.5(图1)。
由图1可知，在阴离子交换容量为918±40μmol/g的cs-pei918微球表面修饰ka，当反应体系中ka浓度分别为0.7g/l、2.0g/l及4.2g/l时，所对应合成的两性离子交换cs-pei918-ka微球的阳离子交换容量分别为612±24μmol/g、928±36μmol/g及1276±22μmol/g。两性离子交换微球的等电点值由其阴离子交换容量和阳离子交换容量共同影响，当反应体系中ka浓度分别为0.7g/l、2.0g/l及4.2g/l时，所对应合成的两性离子交换cs-pei918-ka微球的等电点值分别为9.9±0.2、7.0±0.1及5.5±0.1。可见，在cs-pei918微球表面修饰ka，在一定的ka浓度范围内，cs-pei918-ka微球的等电点值随着反应体系中ka浓度的增加而降低。
实施例4：
按照文献(中国发明专利：cn104258830b)所述方法制备阴离子交换容量为1275±37μmol/g的cs-pei微球(命名为cs-pei1275)，在cs-pei1275微球表面修饰α-丁酮酸制备得到的两性离子交换微球命名为cs-pei1275-ka。
将经g3漏斗抽干的2.0g上述cs-pei1275微球置于锥形瓶中，加入20ml浓度为0.9g/l的α-丁酮酸溶液，使微球在反应体系中的浓度为100g/l，并用0.5mol/l的naoh溶液调节体系ph值为4.5，然后将体系置于空气振荡器中，在温度为30℃、转速为170rpm条件下反应8h；再将微球用去离子水，在转速为8000rpm条件下离心水洗干净后，加入20ml浓度为0.6g/l的nabh4溶液，使微球在体系中的浓度为100g/l，并用0.5mol/l的hcl溶液调节体系ph值为8，然后将体系置于空气振荡器中，在温度为30℃、转速为170rpm条件下反应24h；反应结束后，将微球用去离子水，在转速为8000rpm条件下离心水洗，制备得到cs-pei1275-ka微球的阳离子交换容量为784±30μmol/g，等电点值为10.0±0.1，以其阴离子交换容量、阳离子交换容量以及等电点值命名为cs-pei1275-ka784-10(图2)。
实施例5：
将经g3漏斗抽干的2.0g上述cs-pei1275微球置于锥形瓶中，加入20ml浓度为1.8g/l的α-丁酮酸溶液，使微球在反应体系中的浓度为100g/l，并用0.5mol/l的naoh溶液调节体系ph值为4.5，然后将体系置于空气振荡器中，在温度为30℃、转速为170rpm条件下反应8h；再将微球用去离子水，在转速为8000rpm条件下离心水洗干净后，加入20ml浓度为0.6g/l的nabh4溶液，使微球在体系中的浓度为100g/l，并用0.5mol/l的hcl溶液调节体系ph值为8，然后将体系置于空气振荡器中，在温度为30℃、转速为170rpm条件下反应24h；反应结束后，将微球用去离子水，在转速为8000rpm条件下离心水洗，制备得到cs-pei1275-ka微球的阳离子交换容量为966±28μmol/g，等电点值为9.0±0.2，以其阴离子交换容量、阳离子交换容量以及等电点值命名为cs-pei1275-ka966-9(图2)。
实施例6：
将经g3漏斗抽干的2.0g上述cs-pei1275微球置于锥形瓶中，加入20ml浓度为4.8g/l的α-丁酮酸溶液，使微球在反应体系中的浓度为100g/l，并用0.5mol/l的naoh溶液调节体系ph值为4.5，然后将体系置于空气振荡器中，在温度为30℃、转速为170rpm条件下反应8h；再将微球用去离子水，在转速为8000rpm条件下离心水洗干净后，加入20ml浓度为0.6g/l的nabh4溶液，使微球在体系中的浓度为100g/l，并用0.5mol/l的hcl溶液调节体系ph值为8，然后将体系置于空气振荡器中，在温度为30℃、转速为170rpm条件下反应24h；反应结束后，将微球用去离子水，在转速为8000rpm条件下离心水洗，制备得到cs-pei1275-ka微球的阳离子交换容量为1860±38μmol/g，等电点值为5.5±0.1，以其阴离子交换容量、阳离子交换容量以及等电点值命名为cs-pei1275-ka1860-5.5(图2)。
由图2可知，在阴离子交换容量为1275±37μmol/g的cs-pei1275微球表面修饰ka，当反应体系中ka浓度分别为0.9g/l、1.8g/l及4.8g/l时，所对应合成的两性离子交换cs-pei1275-ka微球的阳离子交换容量分别为784±30μmol/g、966±28μmol/g及1860±38μmol/g。两性离子交换微球的等电点值由其阴离子交换容量和阳离子交换容量共同影响，当反应体系中ka浓度分别为0.9g/l、1.8g/l及4.8g/l时，所对应合成的两性离子交换cs-pei1275-ka微球的等电点值分别为10.0±0.1、9.0±0.2及5.5±0.1。可见，在cs-pei1275微球表面修饰ka，在一定的ka浓度范围内，cs-pei1275-ka微球的等电点值随着反应体系中ka浓度的增加而降低。
实施例7：
溶菌酶分子中含有4对二硫键，等电点值为11.0，其复性时复性缓冲液的ph值为8.0。由于溶菌酶的等电点值(11.0)大于其复性时复性缓冲液的ph值(8.0)，所以选用实施例5中制备的等电点值(9.0)也大于复性缓冲液的ph值(8.0)的cs-pei1275-ka966-9微球辅助溶菌酶复性，并且以相同条件下不添加微球和添加阴离子交换cs-pei1275微球的溶菌酶复性为对照。
变性溶菌酶溶液的制备：将溶菌酶溶解于含有8mol/l尿素、20mmol/l二硫苏糖醇(dtt)、20mmol/ltris–hcl及3mmol/ledta，溶剂为去离子水，且ph值为8.0的变性缓冲液中，使溶菌酶浓度为20g/l，于40℃还原变性3h。配制含有1.0mol/l尿素、2.5mmol/l氧化型谷胱甘肽(gssg)、6.5mmol/l还原型谷胱甘肽(gsh)、20mmol/ltris–hcl及3mmol/ledta，溶剂为去离子水，且ph值为8.0的复性缓冲液。
对于不添加微球的溶菌酶复性，复性缓冲液直接置于空气振荡器中，在温度为25℃、转速为120rpm条件下振荡预平衡直至温度恒定，预平衡好后，向其中加入变性溶菌酶溶液使体系中溶菌酶浓度为1g/l，然后将该复性体系置于空气振荡器中，在温度为25℃、转速为120rpm条件下复性3h，复性完成后测定溶菌酶的活性。
添加cs-pei1275微球或cs-pei1275-ka966-9微球的溶菌酶复性方法相同：在复性缓冲液中加入cs-pei1275或cs-pei1275-ka966-9微球，使微球浓度为150g/l，置于25℃和120rpm的空气振荡器中振荡混合预平衡直至温度恒定，预平衡好后，向其中加入变性溶菌酶溶液使体系中溶菌酶浓度为1g/l，然后将该复性体系置于空气振荡器中，在温度为25℃、转速为120rpm条件下复性3h，复性完成后测定溶菌酶的活性。
(说明：等电点值是指，在某一ph值的溶液中，蛋白质或者两性离子交换微球解离成阳离子和阴离子的趋势或程度相等，呈电中性，净电荷为零，此时溶液的ph值称为该蛋白质或者两性离子交换微球的等电点值。所以等电点值本质也是ph值，二者可以比较。)
溶菌酶的活性是以溶壁微球菌为底物测定的。称取一定量的溶壁微球菌溶于浓度为60mmol/l且ph值为6.2的磷酸缓冲液中，制得0.25g/l溶壁微球菌悬浮液。在1.4ml的上述溶壁微球菌悬浮液中加入0.1ml溶菌酶酶液，在25℃下测定混合液在450nm的吸光度随时间变化曲线，以其斜率表征酶活。复性结束后，取一小部分复性体系混合物在8000rpm下离心2min并取上清液用上述磷酸缓冲液进行适当稀释后测定溶菌酶活性，复性收率用复性后复性体系中的溶菌酶活性与变性前的天然溶菌酶活性之比表示。
复性完成后，用0.5mol/l的naoh溶液分别调节添加cs-pei1275微球或cs-pei1275-ka966-9微球的体系ph值至9.8，分别将各体系置于空气振荡器中，在温度为25℃、转速为120rpm条件下吸附4h。吸附完成后，在转速为8000rpm条件下分别离心收集各微球，将收集到的微球分别加入到1mol/l的nacl溶液中，使微球的浓度为20g/l，分别置于空气振荡器中，在温度为25℃、转速为120rpm条件下解吸4h，然后分别在转速为8000rpm条件下离心，收集各上清液经透析脱盐后即为溶菌酶溶液，测定各脱盐上清液中的溶菌酶活性，经吸附提取后溶菌酶活性回收率用该脱盐上清液中的溶菌酶活性与复性后复性体系中溶菌酶活性之比表示。收集各微球在转速为8000rpm条件下反复离心水洗，制备得到再生微球。
cs-pei1275-ka966-9微球辅助溶菌酶复性的复性收率及经微球吸附提取后溶菌酶的活性回收率如图3所示。由图可知，对于不添加微球的复性，溶菌酶复性收率为54.6±2.4％，而在复性体系中分别添加cs-pei1275及cs-pei1275-ka966-9微球时，溶菌酶复性收率分别为94.6±4.4％及92.2±3.1％。溶菌酶等电点值为11.0，在复性ph8.0下带正电荷。在复性条件下阴离子交换cs-pei1275微球也带正电荷，微球与溶菌酶所带电荷种类相同，故cs-pei1275微球辅助溶菌酶复性的复性收率(94.6±4.4％)高于不添加微球的溶菌酶复性收率(54.6±2.4％)。cs-pei1275-ka966-9微球辅助溶菌酶复性的复性收率(92.2±3.1％)与cs-pei1275微球辅助溶菌酶复性的复性收率(94.6±4.4％)相近，表明在复性条件下，cs-pei1275-ka966-9微球同样能够高效地辅助溶菌酶复性。由图3可知，复性完成后调节体系ph值为9.8，分别利用各微球对溶菌酶进行吸附提取，cs-pei1275及cs-pei1275-ka966-9微球对溶菌酶的活性回收率分别为0％和60.1±2.6％。表明只有本专利制备的两性离子交换cs-pei1275-ka966-9微球，能够在辅助溶菌酶复性后吸附提取溶菌酶，而cs-pei1275微球不能在辅助溶菌酶复性后吸附提取溶菌酶。
由上述结果可知，在ph8.0下，cs-pei1275-ka966-9微球可以辅助溶菌酶复性；在ph9.8下，cs-pei1275-ka966-9微球可以吸附提取溶菌酶。在复性时，溶菌酶等电点值(11.0)及cs-pei1275-ka966-9微球等电点值(9.0)均大于复性缓冲液ph值(8.0)，此时溶菌酶和cs-pei1275-ka966-9微球均带正电荷，所以此时cs-pei1275-ka966-9微球能够辅助溶菌酶复性。复性完成后，调节体系ph值为9.8，此时溶菌酶等电点值(11.0)大于溶液ph值(9.8)，溶菌酶带正电荷，而cs-pei1275-ka966-9微球等电点值(9.0)小于溶液ph值(9.8)，微球带负电荷，此时cs-pei1275-ka966-9微球与溶菌酶间产生静电吸附作用，因而cs-pei1275-ka966-9微球能够吸附提取溶菌酶。
之前的cs-pei微球是一种阴离子交换微球，其表面含有伯胺、仲胺及叔胺等弱碱性基团，本发明利用带羰基的酸——α-丁酮酸与cs-pei上的伯胺基团发生反应,在cs-pei微球上进一步引入羧基，制备得到了一种既含有弱碱性基团又含有弱酸性基团的两性离子交换cs-pei-ka微球。由于弱碱性基团的质子化程度和弱酸性基团的解离程度都与溶液ph值相关，所以cs-pei-ka微球的荷电性质随着溶液ph值的变化而变化。按照本发明方法制备具有不同等电点值的两性离子交换cs-pei-ka微球，根据蛋白质的等电点值及其复性缓冲液ph值选取cs-pei-ka微球应用于辅助蛋白质复性并对蛋白质进行吸附提取，如果蛋白质的等电点值大于复性缓冲液的ph值，则选取等电点值也大于复性缓冲液的ph值的cs-pei-ka微球；如果蛋白质的等电点值小于复性缓冲液的ph值，则选取等电点值也小于复性缓冲液的ph值的cs-pei-ka微球。这样在复性条件下cs-pei-ka微球与蛋白质所带电荷种类相同，能够辅助蛋白质复性；复性完成后调节体系ph值使其介于cs-pei-ka微球等电点值与蛋白质等电点值之间，此时cs-pei-ka微球与蛋白质所带电荷种类相反，能够吸附提取蛋白质。这就弥补了只含有碱性/酸性基团的阴离子交换/阳离子交换微球在辅助蛋白质复性后不能吸附提取蛋白质方面的不足。
实施例8：
牛碳酸酐酶ii(caii)分子中不含二硫键，等电点值为5.9，其复性时复性缓冲液的ph值为7.5。由于caii的等电点值(5.9)小于其复性时复性缓冲液的ph值(7.5)，所以选用实施例2中制备的等电点值(7.0)也小于复性缓冲液的ph值(7.5)的cs-pei918-ka928-7微球辅助caii复性，并且以相同条件下不添加微球和添加阴离子交换cs-pei918微球的caii复性为对照。
变性caii溶液的制备：将caii溶解于含有8mol/l尿素、50mmol/ltris–hcl及1mmol/ledta，溶剂为去离子水，且ph值为7.5的变性缓冲液中，使caii浓度为10g/l，于25℃还原变性12小时。配制含有1.2mol/l尿素、50mmol/ltris–hcl及1mmol/ledta，溶剂为去离子水，且ph值为7.5的复性缓冲液。
对于不添加微球的caii复性，上述复性缓冲液直接置于空气振荡器中，在温度为30℃、转速为170rpm条件下振荡预平衡直至温度恒定，预平衡好后，向其中加入变性caii溶液使体系中caii浓度为0.5g/l，然后将该复性体系置于空气振荡器中，在温度为30℃、转速为170rpm条件下复性4h，复性完成后测定caii的活性。
添加cs-pei918微球或cs-pei918-ka928-7微球的caii复性方法相同：在复性缓冲液中加入cs-pei918或cs-pei918-ka928-7微球，使微球浓度为120g/l，置于30℃和170rpm的空气振荡器中振荡混合预平衡直至温度恒定，预平衡好后，向其中加入变性caii溶液使体系中caii浓度为0.5g/l，然后将复性体系置于空气振荡器中，在温度为30℃、转速为170rpm条件下复性4h，复性完成后测定caii的活性。
caii的活性是以4-硝基苯基乙酸酯(4-npa)为底物进行测定的。用浓度为50mmol/l且ph值为7.5的tris–hcl缓冲液稀释4-npa，使4-npa最终浓度为2mmol/l。用移液管取3ml上述4-npa溶液置于紫外石英皿中，加入0.1mlcaii酶液，快速混合，在25℃下测定混合液在400nm处吸光值随时间的变化，作图后用其斜率表征酶活。复性结束后，取一小部分复性体系混合物在5000rpm下离心2min并取上清液用上述tris–hcl缓冲液进行适当稀释后测定caii活性，caii复性收率用复性后复性体系中的caii活性与变性前的天然caii活性之比表示。
复性完成后，用0.3mol/l的hcl溶液分别调节添加cs-pei918微球或cs-pei918-ka928-7微球的体系ph值至6.5，分别将各体系置于空气振荡器中，在温度为30℃、转速为170rpm条件下吸附6h。吸附完成后，在转速为5000rpm条件下分别离心收集各微球，将收集到的微球分别加入到1.2mol/l的nacl溶液中，使微球的浓度为30g/l，分别置于空气振荡器中，在温度为30℃、转速为170rpm条件下解吸6h，然后分别在转速为5000rpm条件下离心，收集各上清液经透析脱盐后即为caii溶液，并测定各脱盐上清液的caii活性，经吸附提取后caii的活性回收率用该脱盐上清液的caii活性与复性后复性体系中caii活性之比表示。收集各微球在转速为5000rpm条件下反复离心水洗，制备得到再生微球。
cs-pei918-ka928-7微球辅助牛碳酸酐酶ii复性的复性收率及经微球吸附提取后牛碳酸酐酶ii的活性回收率如图4所示。由图可知，对于不添加微球的复性，caii复性收率为53.5±3.1％，而在复性体系中分别添加cs-pei918及cs-pei918-ka928-7微球时，caii复性收率分别为13.2±1.2％及93.4±4.5％。阴离子交换cs-pei918微球表面只含有弱碱性基团，在复性ph7.5下弱碱性基团发生质子化而带正电荷，而caii等电点值为5.9，在ph7.5下带负电荷，所以在复性过程中cs-pei918微球会吸附caii折叠中间体，干扰caii分子的正常折叠，从而引起caii复性收率的降低，即cs-pei918微球不能辅助caii复性。而cs-pei918-ka928-7微球辅助caii复性的复性收率高达93.4±4.5％，远高于不添加微球时的复性收率(53.5±3.1％)，即cs-pei918-ka928-7微球可以有效地辅助caii复性。由图4可知，复性完成后调节体系ph值为6.5，分别利用各微球对caii进行吸附提取，cs-pei918及cs-pei918-ka928-7微球对caii的活性回收率分别为5±0.3％和63.8±3.2％。表明只有本专利的两性离子交换cs-pei918-ka928-7微球，能够在辅助caii复性后有效地吸附提取caii。
由上述结果可知，在ph7.5下，cs-pei918-ka928-7微球可以辅助caii复性；在ph6.5下，cs-pei918-ka928-7微球可以吸附提取caii。在复性时，caii等电点值(5.9)及cs-pei918-ka928-7微球等电点值(7.0)均小于复性缓冲液ph值(7.5)，此时caii和cs-pei918-ka928-7微球均带负电荷，所以此时cs-pei918-ka928-7微球能够辅助caii复性。复性完成后，调节体系ph为6.5，此时caii等电点值(5.9)小于溶液ph值(6.5)，caii带负电荷，而cs-pei918-ka928-7微球等电点值(7.0)大于溶液ph值(6.5)，微球带正电荷，此时cs-pei918-ka928-7微球与caii间产生静电吸附作用，因而cs-pei918-ka928-7微球能够吸附提取caii。
所以按照本发明方法制备并选用具有适宜等电点值的的两性离子交换cs-pei-ka微球，对在复性条件下带正电荷(如溶菌酶)或负电荷(如caii)的蛋白质都能有效地辅助复性，这就弥补了只含有碱性/酸性基团的阴离子交换/阳离子交换微球只能辅助与微球带有同种电荷的蛋白质复性方面的不足。
本发明未尽事宜为公知技术。