光介导的聚合酶链式反应扩增和产物检测系统及其使用方法与流程

本公开涉及高通量、光介导的聚合酶链式反应(pcr)扩增和产物检测系统及其使用方法。该系统允许在整合的高通量系统中的逐反应(reaction-by-reaction)、水性油基质的快速和均匀光子加热并且结合温度监测和pcr产物检测。

背景技术

通过聚合酶链式反应(pcr)的dna扩增是分子生物学的基础技术。通过pcr的核酸分析需要样品制备、扩增和产物分析。尽管这些步骤通常是顺序地进行的，但扩增和分析可以同时进行。dna染料或荧光探针可以在扩增之前添加至pcr混合物中，并且在扩增期间用于分析pcr产物。样品分析与扩增在相同的仪器内的相同的管中同时发生。这种组合的方法减少了样品处理、节省了时间、并大大降低了后续反应产品污染的风险，因为无需从封闭器皿中取出样品进行进一步分析。将扩增与产物分析相组合的概念已被称为“实时”pcr。参见，例如美国专利号6,174,670。

目前，在高通量pcr测定中处理多核苷酸样品存在许多关键缺点。这些关键缺点包括导致高试剂成本、高消耗成本、以及高度易受污染的劳动密集型方案和过程的体积尺寸。这些问题中的一些可以通过在一种或多种不可混溶的油中包封水性液滴来解决，该水性液滴含有pcr反应试剂、多核苷酸样品、引物和探针。产生这些水性油基质减小了体积尺寸和污染风险。水性油基质的形成已在专利文献中描述，例如，在美国专利号8,465,707中。

采用恒温区使水性油基质经受pcr热循环的可用系统在提供均匀的加热温度方面显示出显著的问题，并且可以经受从相对远的加热源到样品的缓慢的热传递。使用流动的载体油流将水性油基质输送通过系统的其他系统在控制载体油的流速和深度方面显示出显著的问题。其他方法使用基于微型化高通量的pcr芯片，该pcr芯片在基板内包含加热器和/或温度传感器。然而，此技术需要复杂的芯片设计和制造。

因此，仍然需要用于pcr扩增样品的系统和方法，这些系统和方法是高通量的、降低了成本、提供了更大分析灵活性、减少了周转时间并改善了数据质量。

技术实现要素：

本公开的一个方面的特征在于聚合酶链反应(pcr)扩增和产物检测系统，其包含组装子系统，该组装子系统包括多个容器和一个或多个液体分配构件，配置该一个或多个液体分配构件以组装一组水性油基质，各水性油基质包含：1)包含一定体积多核苷酸样品和试剂的水性反应混合物；以及2)一种或两种选自由以下组成的组的不可混溶的油：包封油、载体油、以及包封油和载体油两者。因此，水性反应混合物的组分不与一种或两种不可混溶的油混合。在此实施例中，各水性油基质被一个或多个液体分配构件分配到容器中用于pcr扩增和产物检测。

该系统还包含多个加热位置、温度监测位置、和pcr产物检测位置。此外，该系统包括包含多个电磁辐射源的逐反应光驱动光子加热子系统，其中每个容器在其处于加热位置时与电磁辐射源光学连通，并且所述电磁辐射源对所述容器发射电磁辐射；包含多个热检测装置的逐反应温度监测子系统，其中每个容器在其处于温度监测位置时与热检测装置相对应，并且其中检测装置被配置成当所述容器处于温度监测位置时提供取决于所述水性油基质的温度的测量信号；与光子加热子系统和温度监测子系统两者通信连接的微控制器温度反馈和光源控制子系统，其中所述微控制器温度反馈和光源控制子系统被配置为调节输出控制所要求的能量输入、以及所述电磁辐射源通过反应温度循环所发射的电磁能量的持续时间；以及荧光检测子系统。进一步，该荧光检测子系统包含：i)一个或多个荧光激发光源；ii)一个或多个荧光发射光感测装置；iii)与一个或多个荧光激发光源光学连通的多个第一光学构件，其中每个第一光学构件被配置成当含有所述水性油基质的所述容器处于pcr产物检测位置时，向具有第一光谱波长的荧光激发光提供从所述一个或多个荧光激发光源到所述容器之一的光路，其中所述水性反应混合物的体积包含第一试剂，当所述第一试剂与所述多核苷酸样品杂交时所述第一试剂能够被所述具有第一光谱波长的荧光激发光激发，并且其中每个第一光学构件进一步被配置成向荧光发射光提供从所述水性反应混合物到所述一个或多个荧光发射光感测装置的光路；以及iv)在pcr产物检测位置处的主动或被动冷却机构，由此冷却pcr产物检测位置处的每个容器。

还提供了与定位装置以及与组装子系统通信连接的机械和电子控制系统，其中机械和电子控制系统使所述组装子系统在所述多个容器中组装所述水性油基质，并且其中所述机械和电子控制系统使所述定位装置将所述多个容器从所述组装子系统移动至所述加热位置、温度监测位置和pcr产物检测位置中的每个位置。

在另一方面，本文提供了利用pcr扩增和产物检测系统用于光介导的pcr扩增和产物检测的方法。在此方面中，该方法包括通过吸出一种或多种不可混溶的油来组装一组水性油基质，该吸出步骤包括：(i)从包封油输入物中吸出包封油；(ii)从载体油输入物中吸出载体油；或者(iii)从包封油输入物中吸出包封油并从载体油输入物中吸出载体油。该方法还包括从多核苷酸样品输入物中吸出一定体积多核苷酸样品；从pcr试剂混合物输入物中吸出一定体积试剂；将所述体积的多核苷酸样品、所述体积的试剂和一种或多种不可混溶的油分配到多个容器中，其中所述体积的多核苷酸样品和所述体积的试剂形成水性反应混合物，并且其中水性反应混合物的组分不与一种或多种不可混溶的油混合；其中步骤1)、2)、和3)以任何顺序或同时进行，并且其中步骤1)、2)、和3)在步骤4)之前进行。该方法还包括均匀地加热各水性油基质的体积，其中该加热包含：1)将电磁辐射源定位成与含有水性油基质的每个容器光学连通；2)加热所述水性油基质的体积直至其达到在约50℃至约65℃范围内的温度；3)进一步加热所述水性油基质的体积直至其达到约65℃至约75℃范围内的温度；以及4)进一步加热所述水性油基质的体积直至其达到在约90℃至约99℃范围内的温度。在此实施例中，方法中的另外的步骤包括通过将每个容器定位在冷却机构附近来冷却各水性油基质直至水性油基质达到约55℃至约65℃范围内的温度。

另外的步骤包括测量来自含有水性油基质的每个容器的荧光发射，其中该测量包含：1)将第一光学构件定位成与含有水性油基质的每个容器光学连通，其中每个第一光学构件被配置成当含有所述水性油基质的所述容器处于pcr产物检测位置时，向具有第一光谱波长的荧光激发光提供从所述一个或多个荧光激发光源到所述容器之一的光路，其中所述水性反应混合物的体积包含第一试剂，当所述第一试剂与所述多核苷酸样品杂交时所述第一试剂能够被所述具有第一光谱波长的荧光激发光激发，并且其中每个第一光学构件进一步被配置成向荧光发射光提供从所述水性反应混合物到所述一个或多个荧光发射光感测装置的光路；以及2)测量由所述一个或多个荧光发射光感测装置产生的、来自至少一个水性反应混合物的信号。在具体的方面，加热、冷却和测量荧光步骤重复预定数量的另外的循环。

附图说明

图1描绘了两种油水性油基质的实施例的截面视图。

图2描绘了示出示例性配置的截面视图，其中电磁辐射源和至少一个检测器位于容器的顶部的相同位置。

图3描绘了示出示例性配置的截面视图，其中电磁辐射源和至少一个检测器位于相同位置，其中电磁辐射源位于容器的底部，并且至少一个检测器位于容器的顶部。

图4a描绘了示例性带装置的侧视图。

图4b描绘了示例性带装置的俯视图。

图5描绘了示出配置的示例性实施例的截面视图，其中电磁辐射源和至少一个检测器在不同位置。

图6a描绘了示例性光子加热子系统的主视图。

图6b描绘了示例性光子加热子系统的侧视图。

图6c描绘了示例性光子加热子系统的俯视图。

图7描绘了光子加热子系统和移动带的实施例的侧视图。

图8描绘了pcr扩增和产物检测系统的实施例的侧视图。

图9描绘了pcr扩增和产物检测系统的实施例的侧视图。

图10描绘了pcr扩增和产物检测系统的实施例的侧视图。

图11描绘了机械、电子、和软件控制系统的框图。

图12显示了光加热的水性油基质的输出功率和记录的温度。上图显示了温度随时间的变化。v轴表示摄氏度，并且x轴表示时间(以秒为单位)。下图显示了led功率随时间的变化。v轴以百分比脉宽调制(pwm)表示led功率，并且x轴表示时间(以秒为单位)。pmw是每秒电源开启的时间的百分比的度量，所述时间是由这一秒期间的一系列功率脉冲产生。脉冲频率可以是可调节的，而脉冲长度是取决于每秒所需的总能量而可调节的。

图13显示了本发明的实施例中的孔中的组分。

图14显示了本发明的实施例中的多孔板和表面安装的led的结构。

图15显示了本发明的实施例中的用于为led供电的电子电路。

图16显示了本发明的实施例中用于独立控制96个led的印刷电路板的示意图。

图17显示了使用本发明的实施例在40个pcr循环后从16个反应孔中观察到的荧光。

具体实施方式

将在下文中参考附图更全面地描述本文的公开内容，其中示出了一些但不是所有的可能的实施例。实际上，公开内容可以以许多不同的形式体现，并且不应被解释为局限于本文所阐述的实施例；而是提供这些实施例，使得本公开能满足适用的法律要求。

所公开的装置、系统和方法所涉及的领域中的技术人员将考虑到，本文所公开的许多修改和其他实施例具有前述描述和相关附图中呈现的教导的益处。因此，应当理解，这些公开内容不限于所公开的特定实施例，并且修改和其他实施例旨在包括在所附权利要求的范围内。尽管本文中采用了具体的术语，但这些术语仅在一般性和描述性意义上使用而并非用于限制目的。

本说明书中提到的所有出版物和专利申请都表明本发明所属领域的技术人员的水平。将所有出版物和专利申请通过引用并入本文，其程度就像明确且个别指出通过引用将每一篇个别出版物或专利申请并入一样。

还应当理解，本文使用的术语仅用于描述特定方面的目的，而不是限制性的。如在说明书和权利要求中使用的，术语“包含”解释为明确说明所述提及的特征、整数、步骤、或组分的存在，但是不预先排除一个或多个特征、整数、步骤、组分或其组的存在或添加。因此，例如，包含一对核酸引物的水性反应混合物体积可具有两对或更多对核酸引物。另外，术语“包含”旨在包括由术语“基本上由……组成”和“由……组成”涵盖的实施例。类似地，术语“基本上由……组成”旨在包括由术语“由……组成”涵盖的实施例。

除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与所公开的组合物和方法所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。在本说明书和下面的权利要求书中，将参考本文中所定义的若干术语。

术语“约”是指由于用于获得该测量的装置的典型误差率，测量值(例如温度、长度、宽度、高度、波长等)的变化。在一个实施例中，术语“约”意指在报告的数值的5％以内。

本文提供了用于光介导的聚合酶链式反应(pcr)扩增和产物检测的系统和方法，其中将直接、均匀加热应用于包含多核苷酸样品和pcr试剂、引物、和探针的水性反应混合物体积。优选地，水性反应混合物体积位于(即，包封)不可混溶的油，并且在一些实施例中，另外地位于第二不可混溶的油的自由表面上。在具体的实施例中，水性反应混合物体积不与不可混溶的油混合，并且水性反应混合物体积与一种不可混溶的油或两种不可混溶的油的组合将形成本文中称为“组装的水性油基质”或“水性油基质”的布置(参见图1)。水性油基质能够有效加热非常小的水性反应混合物体积而不会引起水蒸发。适用于本发明的方法和系统的水性反应混合物体积可以低至10μl或更低，并且在一些情况下，可以使用低至5nl的水性反应混合物体积。更重要的是，添加一种或两种不可混溶的油提供了污染屏障，这允许重复使用微量滴定皿和其他容器器皿，其中实验之间的多核苷酸交叉污染风险很小。

在具体的方面，使用多个能量源将光介导的加热直接应用于水性水反应混合物体积、水性油基质或含有水性油基质的容器中，该多个能量源在本文有时称为“光子加热”的过程中发射电磁辐射。合适的能源包括卤素灯、激光器和其他光发射装置。在具体的实施例中，使用多个能量源将均匀加热直接应用于水性反应混合物体积，该能量源发射红外光，该红外光具有约1,300nm至约2,200nm的光谱波长。在此波长范围的红外被水性反应混合物体积中的水分子高度吸收，并使水性反应混合物反应体积的温度迅速升高。在另一个实施例中，经由光子-电子-光子耦合的等离子体光热光-热转换实现直接和均匀加热(参见hoson等人，2015，light：scienceappl.[光科学与应用]4：e280，其内容通过引用以其整体结合在此)。在这样的实施例中，将具有约100nm至约500nm的光谱波长的紫外光或可见光直接应用于等离子体可激发金属(如薄金膜)，其又反过来将热实施至水性油基质和/或水性反应混合物体积。因此，本系统和方法允许以非常小的水性体积有效且均匀地加热大量pcr反应，从而节省能量、生物材料和pcr试剂。

本文提供了部分自动或全自动和受控制的系统，以及使用该系统的方法。在具体的方面，该系统包含多个整合的子系统，其执行用于进行dna样品的pcr扩增和检测所得pcr产物的一种或多种功能。在此类方面，该系统包含用于在适于pcr过程的容器或器皿中分配水性水油基质的组装子系统；被配置成向单个容器发射电磁辐射的包含多个光源的逐反应光驱动、或光子加热子系统；被配置成监测每个容器中的水性油基质和/或水性反应混合物体积的温度的逐反应温度监测子系统；温度反馈子系统(例如，经由微控制器)，其响应于每个单独的容器的温度读数控制每个单独的光驱动加热源的能量输出；被配置成监测由pcr产物产生的荧光发射的荧光检测子系统；机械、电子、和软件控制系统，其被配置成控制组装系统并经由定位装置(如在由浅凹或孔(充当容器)构成的移动带上)将含有水性油基质的容器穿过系统的多个子系统和容器站。该温度反馈子系统和机械、电子、和软件控制系统有时在本文中统称为“控制系统”。在一些实施例中，本系统可以包括用于传送容器、多核苷酸样品数据、pcr试剂数据的，并用于将荧光数据转换为遗传信息的实验室信息管理系统(lims)。

水性油基质的组装

在某些方面，本系统包括用于将水性反应混合物体积和不可混溶的油分散在容器中的组装子系统或流体处理站，其将从组装子系统移动到光子加热、温度监测、和荧光检测子系统。在一个实施例中，在本系统和方法中分析包含分离的核酸(例如，基因组dna、cdna、和mrna)的生物样品。在一些实施例中，该样品包含使用本领域已知的任何合适的提取技术从例如生物组织提取的分离的基因组dna，将该样品与包括一种或多种核酸探针的pcr试剂混合，该核酸探针被设计与靶dna序列特异性杂交。例如，可能需要确定特定的多态性等位基因的存在。在此类方面中，可以使用等位基因特异性探针检测多态性的特定的等位基因的存在，其中每个等位基因特异性探针在严格杂交条件下与多态性等位基因的一种特异性杂交。典型地，此检测方法可以包括分离基因组dna、扩增涵盖多态性基因座的基因组dna、并检测扩增的多态性等位基因。pcr、rt-pcr和lcr是用于目的核酸的扩增的常用的扩增和扩增-检测方法。关于这些和其他扩增方法的这些用途的细节在本领域是熟知的并可以在各种标准本文和许多参考文献中找到，如mullis等人(1987)美国专利4,683,202；arnheim和levinson(1990)c&en36-47；kwoh等人(1989)procnatlacadsciusa[美国国家科学院院刊]86：1173；guatelli等人(1990)procnatlacadsciusa[美国国家科学院院刊]87：1874；lomell等人(1989)jclinchem[临床化学杂志]35：1826；landegren等人(1988)science[科学]241：1077-1080；vanbrunt(1990)biotechnology[生物技术]8：291-294；wu和wallace(1989)gene[基因]4：560；barringer等人(1990)gene[基因]89：117；以及sooknanan和malek(1995)biotechnology[生物技术]13：563-564。

在某些实施例中，每个水性反应混合物体积包括多核苷酸样品和pcr试剂混合物。在此类实施例中，该pcr试剂将包括一种或多种核酸探针和一种或多种核酸引物。在优选的实施例中，该pcr试剂混合物包括至少两种不同的核酸探针，该核酸探针被设计与不同的多态性等位基因特异性杂交，即，设计为与含有不同的等位基因的序列特异性杂交的探针。此外，等位基因-特异性核酸探针可以与能够使用本领域可获得的检测技术区分的不同的可检测标记缀合或共价连接。适合于与核酸探针使用的可检测标记包括，例如通过荧光发射光感测装置可检测的任何组合物。用于标记核酸的标记策略及其相应的检测策略可以例如在haugland(1996)handbookoffluorescentprobesandresearchchemicals[荧光探针和研究化学品手册]第六版，由分子探针公司(molecularprobes，inc.)(eugene，or)；或haugland(2001)handbookoffluorescentprobesandresearchchemicals[荧光探针和研究化学品手册]第八版，由分子探针公司(mo1ecularprobes，inc.)(eugene，or)。在优选的实施例中，提供了试剂(例如，核酸探针)，其中每个试剂与荧光团共价连接。

在优选的实施例中，该可检测标记也可以包括报告基因-淬灭剂对，如在分子信标和探针中使用的。报告基因可以是用合适的连接基团修饰的荧光有机染料用于连接寡核苷酸，例如末端3′碳或末端5′碳。猝灭剂也可以是有机染料，其可以是或可以不是荧光的。通常，无论猝灭剂是荧光的还是仅通过非辐射衰变从报告基因释放转移的能量，猝灭剂的吸收带应该至少基本上与报告基因的荧光发射带重叠以优化猝灭。非荧光猝灭剂或暗猝灭剂通常通过从激发的报告基因吸收能量起作用，但不会辐射释放能量。

可以根据已知的技术选择用于特定探针的合适的报告基因-淬灭剂对。例如在berlman，handbookoffluorescencespectraofaromaticmolecules[芳香族分子的荧光光谱手册]，第2版，美国学术出版社(academicpress)，纽约，1971(其内容通过引用结合在此)中列出并描述了荧光和暗猝灭剂及其相关的光学性质，其中可以选择例性报告基因-淬灭剂对。可以例如在haugland(2001)handbookoffluorescentprobesandresearchchemicals[荧光探针和研究化学品手册]第八版，由分子探针公司(molecularprobes，inc.)(eugene，or)(其内容通过引用结合在此)中发现经由可以添加到本发明的寡核苷酸中的常见反应基团来修饰用于共价连接的报告基因和淬灭剂的实例。

报告基因(如荧光团)的合适的实例可以选自染料，如sybrgreen、5-羧基荧光素(5-fam^tm，从加利福尼亚州的福斯特市的应用生物系统公司(appliedbiosystems)可得)、6-羧基荧光素(6-fam)、四氯-6-羧基荧光素(tet)、2，7-二甲氧基-4，5-二氯-6-羧基荧光素、六氯-6-羧基荧光素(hex)、6-羧基-2′，4，7，7′-四氯荧光素(6-tet^tm，从应用生物系统公司(appliedbiosystems)可得)、羧基-x-若丹明(rox)、6-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基荧光素(6-joe^tm，从应用生物系统公司(appliedbiosystems)可得)、vic^tm染料产物(从分子探针公司(molecularprobes，inc.)可得)、ned^tm染料产物(从应用生物系统公司(appliedbiosystems)可得)等。淬灭剂的合适的实例可以选自6-羧基-四甲基-若丹明、4-(4-二甲基氨基苯基偶氮)苯甲酸(dabyl)、四甲基若丹明(tamra)、bhq-0^tm、bhq-1^tm、bhq-2^tm、和bhq-3^tm(其每个从加利福尼亚州的诺瓦托市的生物搜索技术公司(biosearchtechnologies，inc.)可得)、qsy-7^tm、qsy-9^tm、qsy-21^tm和qsy-35^tm(其每个分子探针公司(molecularprobes，inc.)可得)等。

在某些方面，水性反应混合物位于不可混溶的油(如包封油或载体油)内。应理解，水性反应体积将具有与包封油和/或载体油不同的密度。在一个实施例中，水性反应混合物和包封油分散在容器内，其中水性反应混合物将具有范围在约900kg/m³至约1,200kg/m³的值内的密度(例如，具有大约1,000kg/m³的总密度的分离的dna样品和pcr试剂的水性基溶液)，然而包封油将具有范围在约700kg/m³至约990kg/m³的值内的密度，其条件是水性反应混合物与包封液体的密度不重叠。合适的包封液体包括但不限于具有大约920kg/m³的密度的苯基甲基聚硅氧烷(硅油)。在另一个实施例中，水性反应混合物体积和载体油分散在容器内，其中水性反应混合物体积将具有范围在约900kg/m³至约1,200kg/m³的值内的密度(例如，具有大约1,000kg/m³的总密度的分离的dna样品和pcr试剂的水性基溶液)，然而载体油将具有范围在约1,300kg/m³至约2,000kg/m³的值内的密度。在一些实施例中，载体油是具有大约1,900kg/m³的密度的氟代烃油(例如，fluorinert^tmfc-40)或全氟化的油胺。在还另一个实施例中，将水性反应混合物定位于不可混溶的包封油(例如，密度略大于或等于水但小于载体油的硅油)中并进一步定位于相互不混溶的载体油(例如，fluorinert^tmfc-40)的自由表面上。在优选的实施例中，水性反应混合物包含f样品多核苷酸和pcr试剂的水性溶液，该水性溶液具有在载体油与包封油的密度之间的密度。对于这些流体的合适的密度范围在以下值：约1,300kg/m³至约2,000kg/m³的载体油、约700kg/m³至约990kg/m³的包封油、以及约900kg/m³至约1,200kg/m³的水性反应混合物。合适的载体油包括但不限于fluorinertfc-40^tm、fluorinertfc-70^tm、fluoridrop40^tm、fluoridrop7500^tm、krytoxglp-100^tm、krytoxglp-104^tm和krytoxglp-105^tm。适用于本系统和方法的载体油的密度可取决于制剂和温度而变化，但通常在1,700kg/m³与1,900kg/m³之间。合适的包封油通常是纯硅油(聚二甲硅氧烷[pdms])并且包括但不限于sigmaaldrich硅油(5cst、10cst、100cst或1000cst)、clearcopsf-20cst^tm、dowcorning200^tm、xiameterpmx-200^tm、gesf96^tm、shin-etsukf-96^tm、microlubrolmlt8^tm和superlube56104^tm。适用于本系统和方法的包封油的密度可取决于制剂和和温度而变化，但通常在700kg/m³与1100kg/m³之间。

在某些实施例中，样品和包封油和/或载体油将被分配在适合的体积的容器或孔(例如，具有1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm、11mm、12mm、13mm、14mm、15mm、或更大的直径)中，如在pcr管或管条(tube-strip)、标准微量滴定板(例如，96孔、192孔、和384孔微量滴定板)、或array连续聚合物条等(由玻璃或塑料制成的)。在这样的布置中，可以加热非常小水性反应混合物体积而没有显著的水分子蒸发，并且不需要盖子、盖玻片或其他材料来覆盖容器或孔的开口。使用较小的水性反应混合物体积，可以降低应用进行多核苷酸样品的pcr扩增所需的热所需的能量。虽然本系统和方法可以使用大于10μl的水性反应混合物体积，但适用于本系统和方法中的水性体积可以小至10μl、9μl、8μl、7μl、6μl、5μl、4μl、3μl、2μl、1μl、0.9μl、0.8μl、0.7μl、0.6μl、0.5μl、0.4μl、0.3μl、0.2μl、0.1μl或更小。经由标准微量移液装置将此类小水性反应混合物体积分散在本公开的容器内。此外，使用声学液滴注射可以将小至100nl、90nl、80nl、70nl、60nl、50nl、40nl、30nl、20nl、10nl、9nl、8nl、7nl、6nl和5nl的水性反应混合物体积分散在本公开的容器内，如公开在ellson等人(2003)jala8：29-34中，其内容通过引用以其整体结合在此。

如图1所示，流体的不同密度将使得能够形成示例性水性油基质。在图1中，容器101含有水性油基质，该水性油基质包括载体油(例如，氟代烃油)102、包封油(例如，硅油)、和水性反应混合物体积104(例如，含有分离的多核苷酸、引物、探针、和其他pcr试剂的水性体积)。如其中所示，水性反应混合物体积104位于包封油103内。此外，在包封油中的水性反应混合物位于载体油102的自由表面上。由于水性油基质形成，水性反应混合物体积104在容器101中居中。载体油102和包封油103防止水性反应混合物体积104中的水分子的蒸发，甚至当水性反应混合物体积(例如，小于或等于10μl)经受直接加热时。水性油基质配置还防止容器101的污染，因为含有例如核酸的水性反应混合物由于载体油102和包封油103的性质和涉及的表面张力不可能与容器101的壁接触。在优选的实施例中，可以从容器101中吸出整个水性油基质，从而允许再利用容器101而几乎没有交叉污染的风险。由于水性油基质中心在水性反应混合物体积104，以促进物理操作和观察水性反应混合物体积104为目的(如荧光检测)的能力极大地改进。

在另一个实施例中，将聚山梨醇酯添加剂添加至包封油中。在这样的实施例中，聚山梨醇酯添加剂具有在2至8范围内的亲水亲油平衡值。适用于本系统和方法中的示例性聚山梨醇酯添加剂包括但不限于80、65和20(聚山梨酯-20)。在包封油中的这些添加剂为混合物的约0.001％至约10％的范围。

如上指出，本公开的包封油和/或载体油允许使用非常小的水性反应混合物体积(例如，小于或等于10μl)。结果，能以电磁辐射的形式施加热以迅速且均匀地升高水性反应混合物体积的温度，而不需要大的能量输入。例如，升高1μl体积的水的温度所需的能量仅需要毫瓦(mw)的激光输出。

本文还提供了流体排放构件(例如，微量移液器、声学液滴注射器)，其配置成排放或分配容器或孔中的水性反应混合物体积和一种或两种不可混溶的油用于pcr扩增。在优选的实施例中，提供了组装子系统，其中一种或多种流体排放构件是完全自动的并被编程以分配所需体积的液体。自动移液和其他类似的液体处理系统在本领域中是熟知的，并且在预选的容器或器皿集合之间执行程序化的液体转移。在一些实施例中，组装子系统包含一个或多个液体排放构件用于将水性反应混合物体积、包封油和载体油的一种或多种分配到容器中。在一个实施例中，一组水性油基质的范围为2个-1,000个水性油基质、或更多(例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、48个、60个、72个、84个、96个、108个、120个、132个、144个、156个、168个、180个、192个、204个、216个、228个、240个、252个、264个、276个、288个、300个、312个、324个、336个、348个、260个、372个、384个、396个、408个、420个、432个、444个、456个、458个、460个、472个、484个、496个、508个、520个、532个等)组装在容器中用于pcr扩增和检测。对于高通量液体处理，可能需要将系统配置成使用国际配置标准来组装和处理容器，该国际配置标准包含装在和处理含有12排水性油基质的容器，然而，本系统和方法可以容易地适应以调节其他所希望的配置(例如，2排、3排、4排、5排、6排、7排、8排、19排、10排、11排、13排、14排、15排、16排、17排、18排、19排、20排、21排、22排、23排、24排、25排、26排、27排、28排、29排、30排或更多排容器)。在一些实施例中，一个或多个液体排放构件包含用于液体转移的移液头(例如，多通道或单通道移液头)。在一些实施例中，将一个或多个移液头放置在基于伺服电动机或步进电动机的自动轴系统上，其中可以将该一个或多个移液头定位于含有输入流体的器皿上，用于吸出流体，并然后定位于容器上，用于将抽出的输入流体分配到容器中。液体排放构件可以配置成用于大量分配液体或与一次性吸头拟合，用于单个或多个通道的液体分配。

在一个具体的实施例中，一组液体排放构件配置成从包封输入器皿中吸出包封油然后自动定位在一排容器上，其中该组液体排放构件将包封油分配在容器中。在另一个实施例中，一组液体排放构件配置成从载体输入器皿中吸出载体油，并然后自动定位在一排容器上，其中该组液体排放构件将载体油分配在容器中。在还另一个实施例中，一组液体排放构件配置成从样品输入器皿中吸出多核苷酸样品(例如，目的dna样品)，并然后自动定位在一排容器上，其中该组液体排放构件将多核苷酸样品分配在容器中。在还其他实施例中，一组液体排放构件配置成从pcr试剂输入器皿中吸出一定体积pcr试剂(例如，盐、缓冲液、酶、dntp)，并然后自动定位在一排容器上用于将试剂分配到孔中。在此类实施例中，合适的扩增引物和等位基因-特异性核酸探针也可以包括在pcr试剂输入中。在其他情况下，配置另外的一组液体排放构件用于吸出以及分配引物和探针。应当理解，可以将水性反应混合物体积的组分(即，多核苷酸样品、引物、探针、和pcr试剂)通过相同或不同的液体排放构件以及以任何顺序预混合、吸出并分配。此外，可以通过液体排放构件将多核苷酸样品与引物、探针和pcr试剂预混合、并然后吸出用于在一个或多个容器中分配。可替代地，可以将液体排放构件配置成分别地分配多核苷酸样品以及引物/探针/pcr试剂。本公开的组装子系统可以被编程为以任何顺序组装水性油基质，并且用于多核苷酸样品和引物/探针/pcr试剂的任何组合，例如，用于对使用一个或多个不同组的引物/探针组合的一种或多种多核苷酸样品上的pcr扩增和检测。使自动移液和其他液体处理系统适应任何数量的可编程液体组装操作的工作空间完全在普通技术人员的技能范围内，并且此类液体处理系统可从原始设备制造商(oem)、商业产品和自动化/集成提供商(包括但不限于3dispense、accel生物科技有限公司(accelbiotech，inc.)、安捷伦科技有限公司(agilenttechnologies，inc.)、美杏高德公司(apricotdesigns)、asystek、欧罗拉生物公司(aurorabiomed)、贝克曼库尔特公司(beckmancoulter)、赛多利斯公司(biohit(sartorius))、bionexsolutions、美国伯腾公司(biotek)、cybio(analyticjena)、dispendix、动态设备公司(dynamicdevices)、fluidx、formulatrix、gilson、hamilton、htz、hudsonrobotics、integrabiosciences、kawator、labcyte、nanoscreen、珀金埃尔默公司(perkinelmer)、rainin、scineon、seyonic、synchron、tecan、xantus、xiril(sias)、和zinssernorthamerica)可获得。

在具体的实施例中，引物、探针和pcr试剂被优化用于检测具体的多态性标记并组合在单个输入中。在这样的实施例中，布置四组液体排放构件，使得载体油和包封油大量分配到一排容器中，然后分配多核苷酸样品，并然后分配具体的标记检测所需的pcr试剂(参见例如，图9)。虽然不可混溶的油、多核苷酸样品体积、引物、探针、和pcr试剂的一种或两种能以任何顺序分配到容器中，但是优选地在分配多核苷酸之前将一种或两种不可混溶的油分配至容器中以防止容器的污染。在一些实施例中，配置多组排放构件以匹配一排中的容器的数量，例如，液体排放构件配置有12个移液吸头，其间隔等于每排中的容器的间隔。

用于含有合适的容器的水性油基质包括但不限于96孔微量滴定板(具有在约15μl至约100μl范围内的可工作体积以及约3mm至约6mm的直径)、384孔微量滴定板(具有在约2μl至约40μl范围内的体积以及在约2mm至约4mm范围内的直径)、384孔或1536孔array(具有在约0.5μl至约2μl范围内的容器体积以及在约0.5mm至约3mm范围内的直径)、或在轨道组件上的浅凹的孔带或链(具有在约1μl至约20μl范围内的容器体积以及在约0.5mm至约4mm范围内的直径)(参见图4a和4b)等。优选地，本文使用的容器是透明的并由塑料或玻璃制成。

光子加热子系统

在本公开的某些方面，逐反应光介导的加热、或光子加热应用至每个容器和/或直接应用至每个水性反应混合物体积中以增加水性反应混合物体积的温度(根据具体的pcr温度循环所需的时间和温度)，应当理解，术语“逐反应”是指对每个单独的水性反应混合物体积和/或水性油基质应用电磁辐射(和温度测量)，与在单一控制下利用恒定温度区域或同时地通过单个光源的多个反应的光子加热的系统相反。本领域熟知的，双链dna的pcr扩增需要dna的初始变性(“热启动”)，然后进行多个循环的退火、延伸和变性。用于变性步骤的合适的温度在约90℃至约99℃的温度范围，例如，约90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃或99℃。优选地，变性温度是约95℃。在dna变性之后，例如经由散热器或应用冷空气使温度低至退火温度，该退火温度优化用于引物和标记的探针与靶多核苷酸链的杂交。在优选的实施例中，探针与能够通过具有某个光谱波长的电磁辐射激发的荧光团共价连接。典型地，使用本领域熟知的技术基于引物和/或探针的长度和核酸组成来优化退火温度。例如，热熔点(tm)可以从meinkoth等人，anal.biochem.[分析生物化学]138：267-284(1984)的等式粗略估计：tm＝81.5℃+16.6(logm)4-0.41(％gc)-0.61(％form)-500/l；其中m为单价阳离子的摩尔浓度，％gc为dna中鸟苷和胞嘧啶核苷酸的百分比，％form为杂交溶液中甲酰胺的百分比，并且l为杂合体的碱基对长度。tm是温度(在定义的离子强度以及ph下)，在该温度下50％的互补靶序列杂交到完全配对的探针上。对于每1％的错配，tm降低约1℃；因此，可调整tm杂交条件以与所期需同一性的序列杂交。例如，如果查找具有≥90％同一性的序列，该tm可以降低10℃。通常，将严格条件选择为比特定序列及其互补序列在所限定的离子强度和ph下的tm低约5℃。

用于退火步骤的合适的温度在约50℃至约70℃的温度范围，例如约50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃或70℃。优选地，该退火温度在约50℃至约65℃的范围。更优选地，该退火温度在约55℃至约65℃的范围内。在引物和探针与其靶多核苷酸序列退火后，升高温度以允许从杂交的引物中延伸新的多核苷酸链。用于延伸步骤的合适的温度是在约65℃至约75℃的范围，例如65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃或75℃。优选地，该延伸步骤在约70℃的步骤进行。在初始变性步骤(即，“热启动”)之后，本公开的系统和方法包含多个pcr温度循环，这些温度循环范围从2个至60个或更多个，例如2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个或更多个循环，其中每个pcr温度循环包含退火步骤、延伸步骤、和变性步骤。在每个pcr温度循环之后，在开始下一个退火步骤之前，将各水性油基质温度冷却至约55℃至约65℃的温度范围，例如55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃或65℃。水性油基质可通过主动或被动冷却机构冷却，如被动金属散热器、主动循环空气流、被动循环空气流、珀尔帖(peltier)装置、循环液体或其任何组合。

本公开的一个方面是提供足够小(例如，10μl或更小)的水性反应混合物体积以允许经由电磁辐射源进行有效和直接的加热，使得仅需几秒钟来实现每个循环的退火、延伸、和变性温度。在一些实施例中，pcr循环需要应用电磁辐射持续20秒、19秒、18秒、17秒、16秒、15秒、14秒、13秒、12秒、11秒、10秒、9秒、8秒、7秒、6秒、5秒、4秒、3秒、2秒、1秒或更少的时间。

取决于所发射的电磁辐射的类型，辐射通过水性反应混合物体积中水分子的热吸收或通过吸热颜料、热致变色染料、等离子体激发材料或其组合的热吸收来加热水性反应混合物体积。应当理解，吸热颜料、热致变色染料、和/或等离子体激发材料可以设置在容器的壁上或分配在容器内和/或水性反应混合物体积内。适用于本系统和方法中的示例性电磁辐射源包括激光器、卤素灯、激光二极管和发光二极管。含有水性油基质的容器的位置(其中电磁辐射源施加电磁辐射)有时在本文中称为“加热位置”。在一些实施例中，该电磁辐射源发射具有范围约100nm至约350nm的光谱波长的紫外辐射。在其他实施例中，该电磁辐射源发射具有范围约380nm至约700nm的光谱波长的可见光。在优选的实施例中，该电磁辐射源发射具有范围约350nm至约500nm的光谱波长的蓝光。在更优选的实施例中，该电磁辐射源发射具有范围约350nm至约450nm的光谱波长的蓝光。在甚至更优选的实施例中，该电磁辐射源发射具有约450nm的光谱波长的蓝光。在还其他实施例中，该电磁辐射源发射具有范围约1,200nm至约2,200nm的光谱波长的红外辐射。在优选的方面，该电磁辐射源发射具有范围约1,450nm至约1,600nm(例如，约1,550nm)的光谱波长的红外辐射。因此，适用于本系统和方法的电磁辐射源将具有在约100nm至约2,200nm范围内的光谱波长。

在一些实施例中，该电磁辐射源是激光二极管。激光二极管相对便宜、小巧且可靠、具有非常长的使用寿命长。适用于本系统和方法中的固体激光二极管类似于许多常见电子装置(例如光盘和数字多功能光盘播放器或光纤通信)中的那些。来自这种激光二极管的能量输出可以聚焦在非常小的区域上(例如，经由准直透镜)，并且激光二极管以各种光谱输出波长和瓦数可商购。此外，升高具有非常小体积(例如，大约5μl、1μl或更小)的水性反应混合物的温度所需要的能量是非常小的。因此，适用于本系统的激光二极管所需的能量输出非常小，例如，约10mw到约500mw，这取决于容器的热质量和油基质体积。在一个方面，提供电磁辐射源(例如，激光二极管)用于将具有在约1,200nm至约2,200nm范围的光谱波长的红外辐射发射至含有水性油基质的容器，其中一定体积水性反应混合物包含待通过pcr基因分型分析的多核苷酸样品(例如，用于末期pcr产物检测或实时pcr产物检测)。通过选择被水性反应混合物体积中的水分子而不是被包封和/或载体油和/或容器材料(例如，玻璃或塑料)优先吸收地光谱波长，能量输出可以集中在水性油基质中的水性反应混合物体积。

在优选的实施例中，水性反应混合物体积在水性油基质中句中，并且红外辐射的光谱波长是约1,550nm。在此类方面，用于发射红外辐射的激光二极管可以位于容器上方或容器下方。在本领域中已知红外辐射容易被水分子吸收。因此，红外辐射可以直接聚焦在水性反应混合物体积上，其中热容易被内部的水分子吸收以直接加热水性反应混合物。应当理解，激光二极管放置在靠近容器的范围内，其距离可以取决于红外光的聚焦方式而变化。配置用于发射红外辐射的示例性激光二极管将包含电源和可选的透镜或可选的准直器用于调节红外光束的焦点。在一些实施例中，激光二极管可包含一根或多根光纤或光管用于为红外辐射提供光学路径，并允许激光二极管相对于容器的定位的灵活性。对于水性反应混合物体积的直接加热，激光二极管可以放置在离容器的顶部或容器的底部1cm、2cm、3cm、4cm、5cm、6cm、7cm、8cm、9cm、10cm、11cm、12cm、13cm、14cm、15cm、16cm、17cm、18cm、19cm、20cm、21cm、22cm、23cm、24cm、25cm、26cm、27cm、28cm、29cm、30cm或更多，并且可以使用透镜或准直器将红外辐射聚焦在水性反应混合物体积上。为了均匀和有效地加热水性反应混合物，将红外光束聚焦使得光束的尺寸大约等于水性反应混合物体积的尺寸。

可以基于水的比热(即，4.184j/g℃)和用于激光的功率输出以及材料和容器的散热率来计算每个pcr循环加热样品所需的时间的量。例如，取决于具体的总热质量和散热性质，由50mw供电的1550nm激光二极管可以聚焦在体积为约1μl的水性反应混合物上。因此，可以将水性反应混合物的温度在大约1秒内从环境温度或室温加热至约60℃，并然后在另一个0.8秒内加热至约70℃，并然后在仅仅2秒内加热至约95℃。因此，可以使用激光二极管发射红外辐射以在约3.3秒通过一个pcr温度循环来加热所述体积的水性反应混合物。每个单独的pcr温度循环可以在具有一个激光二极管的水性反应混合物体积上进行。然而，对于较大的水性反应混合物体积(例如，5μl)和使用低能量输入(例如，约80mw至约200mw)的红外光-发射激光二极管，在通过水吸收红外光和传导到周围的包封流体和/或载体流体中甚至进入容器壁的热中都会出现低效率。此时，从水性反应混合物体积传导到油和玻璃中的热可以平衡通过激光二极管放入水性反应混合物体积中的能量，并导致温度升高的抑制。然而，应当理解，取决于包封流体或载体流体选择的材料，所述体积的水性反应混合物和激光的功率输出，优化所使用的系统完全在普通技术人员的技能范围内。例如，所述体积的水性反应混合物可以减少了约2倍至约100倍、或更多(例如，1,000倍，经由声传递)，增加激光二极管的功率以将能量以大于损耗速率的速率传输到容器中，和/或可以改善可用光能量的吸收转换成热，使得热量传导到水性反应混合物体积中(与热损失率相比增加的比率)。在实施例中，使用吸热染料和颗粒改善热吸收，和/或将水性油基质用于使得能够使用较小体积的水性反应混合物(例如，小于5μl)。

图2中描绘的是本系统的示例性配置。在此实施例中，电磁辐射源201(例如，发射红外辐射的激光二极管)位于容器101的顶部。将电磁辐射通过光纤或光管203沿着光路传送、或传导，并经由准直器透镜204聚焦在水性反应混合物体积104上。

在可替代的实施例中，提供电磁辐射源(例如，发光二极管(led))用于将具有在约350nm至约450nm范围光谱波长的蓝光(或具有约100nm至约350nm的光谱波长的紫外线或紫光)发射至含有水性油基质的容器，其中水性反应混合物体积包含待通过pcr基因分型分析的多核苷酸样品。在优选的实施例中，水性反应混合物体积位于两种不可混溶的油内，如图1中描绘的示例性水性油基质。在这样的实施例中，led定位在与容器的光学连通内并发射具有约450nm的光谱波长的电磁辐射(即，蓝光)。在此类方面，用于发射蓝光的led可以位于容器顶部或容器的底部。虽然水分子不容易吸收蓝光辐射，但可以通过led光源使用水性反应混合物体积中的等离子体激发可激发颗粒均匀地加热水性反应混合物体积。容易吸收蓝光的等离子体可激发材料可通过本领域已知的方法发热，如通过光子-电子-声子耦合进行光热光向热转换。用于吸收蓝光辐射的合适的等离子体可激发颗粒是本领域已知的并包括但不限于包金、银、镍、铂或其组合的颗粒。优选地，该等离子体可激发材料是金。在光子pcr中使用金详细描述的hoson等人(2015)中，其内容通过引用以其整体结合在此。可替代地，可以通过电解或气相沉积将容器的选择的壁以等离子体可激发材料(例如，金颗粒)涂覆。在优选的实施例中，将包含等离子体可激发材料的薄膜或层分散在容器底部或容器底部附近的容器中，使得薄膜或层在水性油基质内，但在水性反应混合物内或下面(参见例如，图3)。在更优选的实施例中，将金的薄膜或层置于容器内部和容器底部，使得薄膜或层与水性油基质、以及水性反应混合物与容器的底部之间紧密接触。在一些方面，将包含金的薄层的聚酯薄膜(mylar)盘放置在容器中和容器的底部。在其他方面，将镀金的铝箔盘放置在容器底部的容器中。等离子体可激发材料的薄膜或层的厚度是约10nm至约100nm的范围，例如10nm、11nm、12nm、13nm、14nm、15nm、16nm、17nm、18nm、19nm、20nm、21nm、22nm、23nm、24nm、25nm、26nm、27nm、28nm、29nm、30nm、31nm、32nm、33nm、34nm、35nm、36nm、37nm、38nm、39nm、40nm、41nm、42nm、43nm、44nm、45nm、46nm、47nm、48nm、49nm、50nm、51nm、52nm、53nm、54nm、55nm、56nm、57nm、58nm、59nm、60nm、61nm、62nm、63nm、64nm、65nm、66nm、67nm、68nm、69nm、70nm、71nm、72nm、73nm、74nm、75nm、76nm、77nm、78nm、79nm、80nm、81nm、82nm、83nm、84nm、85nm、86nm、87nm、88nm、89nm、91nm、91nm、92nm、93nm、94nm、95nm、96nm、97nm、98nm、99nm或100nm。在其他实施例中，等离子体可激发材料的薄膜或层的厚度在约50nm至约500nm的范围，例如50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、200nm、300nm、400nm或500nm。金属材料的较厚的薄膜或层厚度约1mm或更厚，可以吸收光并将光能转换为热，但表面等离子体共振减少，这减缓了加热。在其他实施例中，涂覆有随后的金层(例如，聚酯薄膜、玻璃、铝箔或各种其他塑料)的材料可以构成容器的底部或者可以位于容器壁的底部。在一些实施例中，将led定位在容器的顶部或底部并且聚焦(例如，通过透镜或准直器)以在金层上发射蓝光辐射，以将热量传导到水性液滴中。

应当理解，led放置在靠近容器的范围内，其距离可以取决于蓝光的聚焦方式而变化。配置用于发射蓝光的示例性led将包含电源和透镜或准直器用于调节光束的焦点。在一些实施例中，led可包含一根或多根光纤或光管用于为led提供光学路径，并允许激光相对于含有样品的容器的定位的灵活性。在其他实施例中，led外壳的物理直径小于反应容器之间的距离，并且直接位于容器下方。在此类实施例中，小led将使用传统电路链接到电源，并且led将包含准直器以允许光束聚焦。对于水性液滴的均匀加热，本公开的led可以放置在里容器的顶部或容器的底部1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm、11mm、12mm、13mm、14mm、15mm、16mm、17mm、18mm、19mm、20mm、21mm、22mm、23mm、24mm、25mm、26mm、27mm、28mm、29mm、30mm，并且可以使用可选的透镜或准直器将光束聚焦在等离子体可激发材料(如金)的薄层上。为了均匀和有效加热水性反应体积，蓝光光束将聚焦在等离子体可激发材料上，使得光束的尺寸大约等于等离子体可激发材料的表面积。在优选的实施例中，将包含金的薄层(例如，厚度在约10nm与0.2mm之间)的聚酯薄膜盘放置在容器中，并且从led发射的蓝光辐射被聚焦，使得光束的尺寸大约相当于聚酯薄膜或铝箔盘和金的薄层的大小。

图3中描绘了包含用于发射可见光的电磁辐射源(例如，发射蓝光的led)的本公开的实施例。包含位于包封油303和载体油302中的水性反应混合物体积304的水性油基质。在此示例性实施例中，电磁辐射源309(例如，发射蓝光的led)定位成与容器301(例如，透明塑料容器)的底部光学连通。将等离子体可激发材料306的薄层分散在容器301中，使得等离子体可激发材料位于容器301的底部，该容器301在载体油302内或与载体油302接触、但在包封油303和水性反应混合物体积304下方。如本文所讨论的，等离子体可激发材料可以是金。任选地，将由本领域使用的任何合适的材料(例如，塑料、二甲基硅氧烷、或二氧化硅)制成的纯化层305设置在等离子体可激发材料306上以防止水性反应混合物体积304中的pcr反应组分同源等离子体可激发材料306发生反应。然而，水性油基质在水性反应混合物体积304与等离子体可激发材料306之间产生分离，并降低pcr反应组分与等离子体可激发材料的反应的可能性。取决于led与等离子体表面的尺寸和距离，可选的准直器透镜308能够将光束(虚线)聚焦在等离子体可激发材料306上，其然后将光能转换成均匀传导到水性反应混合物体积304的热。在一些实施例中，将检测器307定位成与容器301的顶部光学连通。检测器307可以包含用于检测水性反应混合物体积(虚线)发射的热辐射(例如，黑体红外辐射)和/或荧光的任何合适的检测装置，如本文其他地方将更详细地讨论的。

带定位装置

在某些方面，本系统和方法包括通过系统的各个子系统和系统的容器站用于离散地移动容器的定位装置(例如，逐步而不是连续移动)，该容器含有水性油基质。在一个实施例中，该定位装置是由多个容器(例如，孔或浅凹)组成的移动带，其中该容器将含有组装的水性油基质。该带可以由柔性塑料、热塑性聚合物(例如，聚丙烯、聚苯乙烯或聚碳酸酯)或类似于用于array的其他材料构成。在一些实施例中，将容器印压到带材料中以形成浅凹。每个孔的体积范围从0.2μl至约20μl，其中每个容器的直径在约0.5mm至约4mm范围内(取决于所希望的设计参数)。带和带内的容器可以由一种连续材料制成，或者可以制成小段，其中每个段包括一组配置的反应容器，并且其中段通过本领域中的任何合适的技术附接或链接在一起以构成带。在这样的实施例中，可以根据需要互换或替换这些段，以简化各种容器体积的最佳配置的创建和/或支持维护和/或修理。在优选实施例中，带将端对端地连接以形成环形结构，并且将经由通信连接到机械和电子控制系统的机动轨道操作，该机械和电子控制系统将驱动带以使得容器以不连续的步骤从装配子系统移动通过加热位置、温度监测位置、pcr产物检测位置的每个。在一些实施例中，在完成pcr扩增和pcr检测循环后，该带将容器移动到废物处理子系统。带的每次致动之后是停止(例如，逐步移动)以将每排容器定位在适当的容器站。如本文使用的术语“容器站”是指系统中的一排或一批容器的具体的物理位置。

在一些实施例中，容器站包含：1)水性油基质的组装，经由组装子系统；2)加热位置，经由光子加热子系统；3)温度监测位置，经由温度监测子系统；4)pcr产物检测位置，经由荧光检测子系统；以及5)任选地，废物处理，经由废物处理子系统。在其他实施例中，容器站包含：1)水性油基质的组装，经由组装子系统；2)加热位置(经由光子加热子系统)、温度监测位置(经由温度监测子系统)、和pcr产物检测位置(经由荧光检测子系统)；以及3)任选地，废物处理，经由废物处理子系统。在还其他实施例中，容器站包含：1)水性油基质的组装，经由组装子系统；2)加热位置，经由光子加热子系统；3)温度监测位置(经由the温度监测子系统)、和pcr产物检测位置(经由荧光检测子系统)；以及4)任选地，废物处理，经由废物处理子系统。在优选的实施例中，容器站包含：1)水性油基质的组装，经由组装子系统；2)加热位置(经由光子加热子系统)、和温度监测位置(经由温度监测子系统)；3)pcr产物检测位置，经由荧光检测子系统；以及4)任选地，废物处理，经由废物处理子系统。在还其他实施例中，系统中可以包括另外的容器站，如包含冷却位置(经由主动或被动散热器)和一个或多个热起始位置(经由光子加热)的容器站。

图4a和4b中描绘的是适用于本系统和方法的带设计的示例性实施例。在此实施例中，在每个末端，将带402设置在传动齿轮401上。在此实施例中，机械和电子控制系统将引起传动齿轮401的旋转(由箭头指示)，以使带能够以不连续的步骤移动每排容器通过每个容器站。带402包含适用于含有水性油基质的多个容器404。可以使用容器间距的任何变化。在优选的实施例中，容器间距可以为约1mm至约10mm或更大，例如1mm、1.5mm、2mm、2.5mm、3mm、35mm、4mm、45mm、5mm、55mm、6mm、65mm、7mm、75mm、8mm、8.5mm、9mm、9.5mm、10mm或更大。在更优选的实施例中，容器间距在约8mm至约10mm的范围。在最优选的实施例，容器的间距为约9mm以符合微量滴定板中的孔间距和多吸头移液器中的标准吸头间距的国际标准。在某些方面，该带将包含多排容器，其中每排将包括范围从2个至100个容器的任何数量的容器，或每排中更多个。更优选地，每排中的容器数量是2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、19个、10个、11个、13个、12个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个或更多个容器。图4b中显示的是最优选的实施例，其中带402中的每排容器包含12个容器。可以基于包封油体积设计每个容器的尺寸和形状，使得当位于载体油内时包封油基本上是静止的，从而保持水性反应混合物体积基本上在孔中居中。在此实施例中，在每个末端，将柔性带402设置在传动齿轮401上。在此实施例中，机械和电子控制系统将引起传动齿轮401沿箭头方向的旋转，以使该带能够以不连续的步骤移动每排容器通过每个容器站。

在一些实施例中，带的容器可以用等离子体可激发材料(如金)涂覆(例如，经由电解、气相沉积或乳胶涂覆)。在一些实施例中，将等离子体可激发材料作为聚酯薄膜、铝箔、或其他合适的薄材料载体涂覆的盘插入每个容器中。图4a还示出了多个，当在容器站内的每排容器靠近被动散热金属403时，用于处冷却每排容器的被动散热金属403。

温度监测子系统

虽然许多传统的pcr系统包括用于pcr热循环的恒温区，但本系统和方法提供了每个容器的直接加热和温度监测，使得能够优化和调节每个容器的pcr热循环条件。此外，本系统和方法可以编程为运行多种不同的pcr热循环条件，以使用具有不同引物、探针和pcr试剂的多种不同多核苷酸样品来扩增和检测pcr产物。由于必须监测容器中水性油基质的温度以使本系统能够调节从激光器提供的能量的量以将容器的温度改变为有效pcr热循环所希望的值，本文提供的是温度监测子系统。在一些实施例中，温度监测子系统在每个pcr温度循环期间、同时或之后从每个容器收集温度数据，这些数据可用于辅助质量控制。在其他实施例中，温度监测子系统在每个pcr温度循环期间收集来自每个容器的温度数据，这些数据可用于确定用于优化下一个加热循环的基线温度、或者可替代地用于标准化温度敏感的荧光团。未按预期改变温度的水性油基质(水性反应混合物体积)可指示装配子系统的不正确的体积分配或仪器故障。在某些实施例中，当系统运行时，温度测量信息每15秒或更短可用。此外，本系统的一些实施例并入软件功能，该软件功能警告实验室工作人员任何温度不准确。此类功能可以包括但不限于基于超出设定极限的温度的警告，在光子加热期间检测预期时间间隔内的预期温度变化的失败，或者不稳定或以意外方式变化的温度变化。提供此类功能的软件可以是定制编码的，或者可以使用公开或商业上可得的算法。含有水性油基质的容器的位置(在其中收集和监测温度或热信息)在本文中有时称为“温度监测位置”。

在某些方面，温度监测子系统包括多个热检测装置，每个热检测装置对应于含有水性油基质的容器。合适的热检测装置在本领域中是已知的，包括但不限于直接接触热敏电阻和/或热电偶、非接触式热成像仪、离散热电堆传感器、热电堆阵列、其他红外传感器、或光纤和/或与非接触式热红外感测装置光学连通的光纤阵列。在一些实施例中，温度监测子系统包含多个热检测装置(例如，热敏电阻或热电偶)，设置在含有水性油基质的每个容器内，并配置成经由常规电路或无线通信收集温度数据并将温度数据发送到温度监测子系统。在优选的实施例中，温度监测子系统包括与热红外感测装置(例如，热成像相机或红外传感器)光学连通的多个热检测装置(例如，光纤或光管)。在这样的实施例中，当容器处于温度监测位置时，每个热检测装置与含有水性油基质的每个容器光学连通，并且其中每个热检测装置被配置成提供测量信号，该测量信号取决于由水性油基质发射的黑体红外辐射的强度作为温度的指示。此外，每个热检测装置可以配置成提供从所述体积的水性油基质(或水性反应混合物体积)到热红外感测装置的热辐射路径，用于收集温度数据。在优选的实施例中，热检测装置是光纤或光管，其不分散在容器中并且不与水性油基质物理接触。在一些实施例中，这些热检测装置(例如，一根或多根光纤)检测来自各水性油基质(或水性反应混合物体积)的发射的黑体红外辐射，然后经由光纤阵列将其传送到热红外感测装置，如红外敏感相机或热成像仪。然后，热红外感测装置测量来自每个容器的黑体红外辐射信号的强度，并将强度转换为温度。在更优选的实施例中，来自各水性油基质的黑体辐射由位于反应体积附近的红外敏感相机或热成像仪直接检测，使得一个或多个反应体积的红外辐射同时被捕获在相机或成像仪的单个图像中。

在本公开的某些方面，当容器处于温度监测位置时，从含有水性油基质的每个容器获取温度测量。在一些实施例中，温度监测位置与加热位置在相同的位置。话句话说，热检测装置与电磁辐射源位于相同的位置(例如，相同的容器站)。在此类实施例中，电磁辐射源和热检测装置能以若干个合适的布置定位。在一些实施例中，电磁辐射源和热检测装置可以定位在含有水性油基质的容器顶部附近。图2中描绘的是本系统的实施例，其中电磁辐射源201(例如，激光二极管或led)和检测器202位于容器101上方。该检测器202可以是热红外感测装置和/或荧光检测装置。在一些实施例中，检测器202是热红外感测装置与荧光检测子系统的组合。电磁辐射从电磁辐射源201发射至位于包含包封油103和载体油102的水性油基质内的水性反应混合物体积104(虚线)。在此实施例中，将电磁辐射(如红外辐射)传送通过光纤或光管203沿着光路传送、或传导，并经由准直器透镜204聚焦在水性反应混合物体积104上。随着温度升高，水性反应混合物体积104发射黑体红外辐射(虚线)，其由光纤205传送检测器202的热红外感测装置。在其他实施例中，经由一束光纤和/或光纤阵列将黑体红外辐射传送到检测器202的热红外感测装置。然而，如果电磁辐射源201发射红外辐射，则电磁辐射源201和检测器202的热红外感测装置不能在没有热检测干扰的情况下同时操作。在这样的布置中，当检测器202的热红外感测装置打开时，必须关闭电磁辐射源201。如果系统被编程为“闪烁”电磁辐射源104和检测器202的热成像装置，则仍然可以实现近实时温度测量。闪烁在本领域中是熟知的，并且包含快速、交替的一系列短红外辐射脉冲，然后是热检测。

在一些实施例中，温度监测位置(例如，容器站)与加热位置是相同的位置，并且电磁辐射源定位在含有水性油基质的容器的底部附近，同时热检测装置被定位在含有水性油基质的容器的顶部。如图3所示的是其中电磁辐射源309位于容器底部、并且检测器307位于容器的顶部的配置。对于温度监测，检测器307可以是例如用于向热红外成像装置提供热辐射路径的红外传感器或一根或多根光纤。

在其他实施例中，温度监测位置(例如，容器站)与加热位置在不同的位置。图5所示的是当处于加热位置时电磁辐射源501位于容器101的顶部的配置。在此配置中，容器101移动到第二容器位置，其中当处于温度监测位置时，检测器502位于容器的顶部。检测器502可以是热红外感测装置或荧光检测装置。在一些实施例中，检测器502是热红外感测装置与荧光检测子系统的组合。电磁辐射从电磁辐射源501发射至位于包含包封油103和载体油102的水性油基质内的水性反应混合物体积104(虚线)。在此实施例中，将电磁辐射(如红外辐射)传送通过光纤或光管503沿着光路传送，并经由准直器透镜504聚焦在水性反应混合物体积104上。在加热步骤之后，容器101通过定位装置(例如，轨道装置上机动的带)移动到下一个容器站，其中检测器502的热红外感测装置测量来自水性反应混合物体积104的黑体红外辐射的发射。在一些实施例中，经由光纤和/或光纤阵列505将黑体红外辐射传送到检测器502的热红外传感。在其他实施例中，经由一束光纤和/或光纤阵列将黑体红外辐射传送到检测器502的热红外传感。在还其他实施例中，黑体红外辐射由非接触式红外传感器或热成像相机直接检测。在这些布置中，温度测量不能与光子加热的应用同时收集，但是可以用于在pcr循环之间确定水性油基质的基线温度，使得系统可以调节(例如微控制器)用于下一个pcr循环的水性反应混合物体积的加热所需的能量输出量。可替代地，温度测量可用于标准化温度敏感荧光团的荧光发射。

荧光检测子系统

在某些方面，本系统和方法包含荧光检测子系统，其配置成发射和检测荧光，用于检测一种或多种已经与靶多核苷酸样品杂交的荧光团标记的探针。在一些实施例中，荧光检测子系统包含一个或多个荧光激发光源、一个或多个荧光发射光源装置、以及一个或多个光学构件中的多个，该光学构件配置成提供用于将荧光激发光传导到pcr产物检测位置中的每个容器，并用于将荧光发射光从每个容器传导到一个或多个荧光发射感测装置的光路。一个或多个荧光激发光源与对应的容器之间的光路或光学连接可以包光学布置中的任一种，并且可以包括传统结构的各种光学器件。适用于本系统和方法的荧光发射光感测装置的非限制性实例包括，例如，电荷耦合装置(ccd)相机、互补金属氧化物半导体(cmos)相机、光电倍增管、和传感器阵列。此外，可以用于荧光检测子系统中的任何合适的荧光激发光源可以包括但不限于led、激光二极管、氩离子激光器、氙灯等。荧光激发光源可以配置发射具有范围约300nm至约1,200nm的合适的光谱波长的荧光，这取决于pcr反应中使用的一种或多种具体的荧光团。具有具体的激发/发射波长的荧光团和其他荧光可激发物质是熟知的并且可商购的。在表1中提供了适用于本系统和方法的示例性荧光团和荧光染料。

表1.常用的荧光团的非限制性列表。

可以调节沿每个光路的光学器件的具体的布置，以提供任何合适的间距比率以适合设计考虑。用于引导光的合适光学器件可包括以下的至少一个：一根或多根光纤、光纤阵列、或光管；包括聚光透镜、目标透镜、菲涅耳透镜、成像透镜、正透镜、向场透镜、或准直器透镜的透镜；反射器，如镜子或光束分离器；激发滤光器，如双向滤光器；以及发射光滤光器。这些光学器件和其他有用的光学器件在本领域中是熟知的并且是可商购的。安装此类光学器件的方法是本领域熟知的。在某些实施例中，使用光纤的灵活性允许本系统很多不同的布置。本文提供的荧光检测子系统被配置用于在对含有水性油基质的每个容器进行的pcr温度循环期间和/或之后连续或定期监测和测量反应产生的荧光。含有水性油基质的容器的位置(其中pcr产物检测由pcr产物检测子系统监测和测量)在本文中有时称为“pcr产物检测位置”。

在一些实施例中，荧光检测发生在pcr温度循环的最后。在优选的实施例中，pcr产物检测实时发生，其中在每个pcr温度循环之后测量荧光。在一些实施例中，荧光检测子系统配置成在每个单独的pcr温度循环之后检测来自每个单独的水性反应混合物的荧光，并且可以通过自动软件经由实验室信息管理系统(lims)分析和评估从pcr测量收集的数据。

用于荧光检测子系统的很多合适的配置适用于本系统和方法。在优选的实施例中，该水性反应混合物包含两种缀合至共价连接至荧光团的不同的核酸探针，该荧光团能够被具有具体的光谱波长或一定范围的光谱波长的荧光激发光激发，其中设计每个核酸探针以与多核苷酸样品的靶核酸序列(例如，多态性)特异性杂交。在此类实施例中，第一核酸探针包含能够通过具有第一光谱波长的荧光激发光激发的第一荧光团，第二核酸探针包含能够通过具有第二光谱波长的荧光激发光激发的第二荧光团。应当理解，第一光谱波长是与第二光谱波长不同的波长，使得第一核酸探针的存在可以与第二核酸探针的存在区分开。

在具体的实施例中，每个光学构件包括一根或多根光纤，当容器在pcr产物检测位置时，该光纤能够在荧光检测子系统和每个容器中的水性反应混合物体积之间提供荧光激发光和/或荧光发射光的光路。在一些实施例中，每个光学构件包含一束光纤。在其他实施例中，每个光学构件包含单根光纤，该光纤能够在每个容器与荧光检测子系统之间传送光。例如，荧光激发和荧光发射光通过顺序激发滤光器和具有对角光学馈源(diagonalopticalfeeds)的发射滤光器(例如，双向滤光器块)堆叠在光纤的单个阵列上，以检测发射至荧光发射光感测装置的荧光。

在某些实施例中，每个光学构件包含用于系统中使用的每个荧光波长的单独的光纤阵列。在此类实施例中，用于荧光检测的每根光纤阵列含有当容器处于pcr产物检测位置时与含有水性油基质的每个容器的光学连通的单独光纤，其中每个单独的光纤包含靠近含有水性油基质容器的一端，另一端在具有呈荧光激发光源和荧光发射感测装置的平面的有序的紧密捆扎阵列中。可以将激发滤光器(例如，类似于用于落散荧光显微镜中的双向滤光器)放置在阵列面与荧光激发光源之间的光路中，并且可以将发射滤光器放置在阵列面与荧光发射光感测装置之间的光路中。在一些实施例中，双向滤光器或滤光块包含激发滤光器和发射滤光器两者，并且被放置在光纤阵列面与荧光激发光源之间的、以及光纤阵列面与荧光发射光感测装置之间的光路中(参见例如，图8)。在具体的实施例中，将荧光发射光感测装置配置在光纤阵列面处收集图像并测量每个单独光纤的信号强度。

在另一个实施例中，荧光检测子系统应用有激光器提供的荧光激发光源(例如，氩离子激光器)，以发射具有在约350nm至约1,100nm范围内的光谱波长的荧光激发光。在此实施例中，使用多个光学构件(如光纤)，其中每根光纤与激光器光学连通，并且当处于pcr产品检测位置时，通过位于含有水性油基质的每个容器上的透镜插入提供光进出容器的光路。荧光激发光被引导通过光纤以激发水性反应混合物体积中的荧光团。来自水性反应混合物体积的发射通过光纤送回荧光发射光感测装置。相似的，荧光检测系统是可商购的，如abi检测系统(应用生物系统公司(appliedbiosystems))。在此实施例中，激光器能够发射具有一种或多种光谱波长的荧光激发光用于检测缀合至或共价连接至具有不同的激发/发射波长的不同荧光团的一种或多种标记的探针。可替代地，可以使用单独的激光器，每个激光器发射具有不同光谱波长的荧光激发光。在一些实施例中，当pcr产物检测位置(即，激发和发射荧光被堆叠在单根光纤上)，对应于每个容器的单根光纤可用于将所有荧光引导至每个容器和从每个容器引导所有荧光。在此类实施例中，具有对角光学馈源的顺序激发光滤光器(例如，双向滤光器块)可用于将荧光发射引导到荧光发射光感测装置。在其他实施例中，可以配置为光纤阵列的单根光纤用于为用于检测的每个荧光激发波长提供光路。

在实施例中，荧光检测子系统可以应用多个led或激光二极管用于发射荧光激发光。由于led或激光二极管的覆盖区非常小，不同波长的多个led或激光二极管可以集成到单个封装中，或者多个封装的led/激光二极管非常紧密地放置，以当在pcr产物检测位置时激发含有水性油基质的单个容器。在这样的实施例中，当容器处于pcr产物检测位置时，led/激光二极管可以位于容器正下方的一个或多个容器站处。具有这样的配置的荧光检测系统也可以在专利文献中找到，例如，美国专利号7,122,799，其内容通过引用以其整体结合在此。在其他实施例中，由led/激光二极管产生的荧光激发光可以通过多根光纤引导至容器，其中当容器处于pcr检测位置时，每根光纤通过透镜(例如，准直器透镜)插入并且位于容器的顶部或底部。

在另一个实施例中，荧光检测子系统可以应用多个led或激光二极管用于产生荧光激发光，其中用于荧光检测的一种或多种光纤阵列提供用于激发和发射荧光的光路。在具体的实施例中，将荧光检测子系统被配置成监测和测量来自核酸探针的荧光，每个核酸探针与不同的荧光团(例如，vic或fam)共价连接。在一些实施例中，适合于激发两种核酸探针的激发和发射荧光通过顺序激发/发射滤光器(例如，双向滤光器块)堆叠在光纤的单个阵列上，具有用于荧光发射光感测装置的对角光学馈源，例如，发射成像传感器或ccd相机。可替代地，使用两个光纤阵列，其中每根光纤阵列为激发和发射荧光提供适用于激发核酸探针之一的光路(参见例如，图8)。在这样的实施例中，每根光纤阵列包含多根光纤，其中当容器处于pcr产物检测位置时，每根光纤与含有水性油基质的容器光学连通。取决于具体的设计和空间要求，每个单独光纤的一端可以定位在容器的顶部或容器的底部上方。每个单独的光纤的另一端被设置在有序紧密捆绑的光纤阵列内，该光纤阵列具有与荧光激发光源(例如，led或激光二极管)和荧光发射感测装置(例如，单色ccd相机)光学连通的平面。可以将激发和/或发射滤光器(如双向滤光器)放置在光路内并与光纤阵列面和适当的荧光激发光源和/或荧光发射感测装置光学连通(参见例如，图8)。荧光发射感测装置收集光纤阵列面的图像，并通过检查图像中的目的区域来测量来自每个单独的光纤的信号强度。

在一些实施例中，提供了检测子系统，该子系统包含热红外成像装置和荧光检测子系统两者。这种布置通过利用单根光纤用于传送所有光(即，黑体红外辐射和荧光激发)，并在所有检测器(即，热红外感测装置和一种或多种荧光发射光检测器)与含有水性油基质的容器之间发射光。在其他实施例中，使用单独的光纤阵列用于热检测和每个荧光激发光波长。

在本公开的某些方面，当容器处于pcr产物检测位置时，从含有水性油基质的每个容器获取荧光测量。在一些实施例中，pcr产物检测位置(例如，容器站)与加热位置和温度监测位置处于相同的位置。在一些实施例中，电磁辐射源与热检测装置可以位于含有水性油基质的容器的顶部和/或与含有水性油基质的容器的顶部光学连通。图2中描绘的是本系统的实施例，其中电磁辐射源201(例如，激光二极管或led)和检测器202位于容器101的顶部和/或与容器的顶部光学连通。在实施例中，检测器202是热红外感测装置与荧光检测子系统的组合。电磁辐射从电磁辐射源201发射至位于包含包封油103和载体油102的水性油基质内的水性反应混合物体积104(虚线)。在此实施例中，将电磁辐射(如红外辐射)传送通过光纤或光管203沿着光路传送，并经由准直器透镜204聚焦在水性反应混合物体积104上。随着温度升高，水性反应混合物体积104发射黑体红外辐射(虚线)，其由一根或多根光纤205传送检测器202的热红外感测装置。在加热和温度监测步骤完成之后，关闭电磁辐射源201和检测器202的热红外感测装置以允许荧光检测。荧光激发光从检测器202的荧光检测子系统沿着一根或多根光纤205传送，并且通过透镜204聚焦在水性反应混合物体积104上。在吸收具有适当的波长的荧光时，与核酸探针共价连接的荧光团发射荧光，该荧光由一根或多跟光纤205收集并传导至检测器202的荧光发射光感测装置。在一些实施例中，通过单根光纤205将具有两种不同波长的荧光激发光在荧光检测子系统与水性反应体积104之间传送。在其他实施例中，经由一束光纤和/或一种或两种光纤阵列将具有两种不同波长的荧光激发光在荧光检测子系统与水性反应体积104之间传送。

在其他实施例中，pcr产物检测位置(例如，容器站)与加热位置在不同的位置。图5所示的是当处于加热位置时电磁辐射源501位于容器101的顶部的配置。在加热步骤之后，将容器101通过定位装置移动至下个容器站，其中当处于pcr检测位置时，检测器502位于容器101的顶部。荧光激发光从检测器502的荧光检测子系统沿着一根或多根光纤505传送，并且通过透镜506聚焦在水性反应混合物体积104上。在吸收具有适当的波长的荧光时，与核酸探针共价连接的荧光团发射荧光(虚线)，该荧光由一根或多跟光纤505收集并传导至检测器502的荧光发射光感测装置。在一些实施例中，通过单根光纤505将具有两种不同波长的荧光激发光在荧光检测子系统与水性反应体积104之间传送。在其他实施例中，经由一束光纤和/或一种或两种光纤阵列将具有两种不同波长的荧光激发光在荧光检测子系统与水性反应体积104之间传送。

包含整合的子系统与移动带配置的实施例

在一些实施例中，本系统和方法包含用于提供逐反应光驱动光子加热的子系统；逐反应温度监测；以及用于pcr扩增和产物检测的pcr产物的荧光检测的组合。在一些方面，本系统和方法另外地包含定位装置配置，以将一组水性油基质以不连续的步骤移动穿过多个容器站，其中这些容器站可以包括一个或多个子系统。在优选的实施例中，该定位装置包含柔性带(如描绘在图4a和4b中的带402)。在此实施例中，带402包含柔性材料(例如，热塑性聚合物)，该带形成围绕两个或更多个传动齿轮401的环结构，并且其中多个容器404内嵌在带402中。传动齿轮401旋转并引起带402将容器404从容器站移动至容器站。控制传动齿轮运动的机械、电子和软件系统在本文其他地方中更详细地描述。

图6a-6c中描绘的是光子加热子系统600(包含多个电磁辐射源602)和带402(用于将容器404从容器站移动至容器站的定位装置)的一个实施例。电磁辐射源602的数量可以取决于间距和设计参数改变。此外，电磁辐射源的尺寸和相关的电路和/或布线将确定具体的空间配置。尽管不旨在限制，当光子加热子系统600包括504个独立的电磁辐射源602和带402，其中将容器404以每行12个容器布置，间距为9mm以符合孔间距的国际标准。

为了减小光子加热子系统600的覆盖区，将电磁辐射源602垂直地堆放在位于带402的一面的42个模块601上，其中12个电磁辐射源602中的每个垂直堆叠(参见图6a和6b)。为了直接向含有水性油基质的每个容器404提供光子热，光子加热子系统600进一步配置成使得电磁辐射源602的布置对应于带402上的容器404的配置。因此，每个电磁辐射源602与光纤或光管603光学连通，其中每根光纤或光管603提供光路用于指导发射的电磁辐射至对应的容器404内(当该容器处于加热位置时)。此配置便于连接电路和其他布线。

靠近对应的容器404的每根光纤或光管603的末端终止于透镜，配置成将电磁辐射束聚焦水性反应混合物体积或等离子体可激发材料，这取决于使用的电磁辐射的具体波长。例如，当使用红外辐射时，将光束聚焦在水性反应混合物体积，并由水分子吸收以加热水性反应混合物。可替代地，如果使用可见光(如蓝光、紫光或紫外光)，则将光束聚焦在等离子体可激发材料(如金层状聚酯薄膜或铝箔盘)上以将光能转换成热能。利用这种配置，存在42堆电磁辐射源602以提供42个pcr温度循环加热位置，或者可替代地，两个“热启动”加热位置，接着是40个pcr温度循环加热位置。如图6b所示，每个模块601位于每隔一排容器404邻近以适应每个pcr温度循环之间的冷却和荧光检测位置。这些容器404由主动或被动冷却构件403冷却，如被动散热金属，其位于带402的环的顶侧下方。

在一些实施例中，每个电磁辐射源602在固定和恒定的瓦数输出操作，其中在计算机可编程控制下，每个电磁辐射源602可以被激活特定的时间段，以提供通过pcr温度循环加热每个水性反应混合物所需的所希望的能量。在其他实施例中，可以改变电磁辐射源602的瓦数输出。

图6a描绘了光子加热子系统600和带402的主视图，其中电磁辐射源602垂直堆叠在模块601上，其中12个电磁辐射源602中每个垂直堆叠。每根光纤和光管603从对应的电磁辐射源602延伸到带402的对应容器404的顶部。

图6c描绘了光子加热子系统600和带402的俯视图。每个电磁辐射源602与电子舱(electronicsbay)604电子连接。

在一些实施例中，将容器404用等离子体可激发材料(如金)涂覆以最大化光(例如，紫外线、紫色光或蓝色光)至热的转换。在其他实施例中，将金层状聚酯薄膜或铝箔盘设置在每个容器404内，以最大化光(例如，紫外线、紫色光或蓝色光)至热的转换。

本公开的一个方面是通过在每个pcr温度循环后测量荧光来提供实时定量pcr数据。图7描绘了示出pcr扩增和产物检测系统的实施例的侧视图。在此配置中，光纤阵列701在带402的容器与一组光检测器708之间转化光，光检测器包括荧光发射光检测器和热红外感测装置。光纤阵列701的使用允许检测器与容器之间的光学连通在很宽的区域上展开。例如，光纤阵列701的使用提供了在100mm×900mm区域上扩散的容器与仅占据仅10mm×15mm或更小的面积的小的有序光纤端面组之间的光的转化。光纤阵列是商业上可获得的并且通常用于凝聚来自微量滴定板孔的光学信号以通过ccd相机进行有效成像，如描述在飞博盖德公司(fiberguideindustries)，“whitepaper：2darrays[白皮书：2d阵列]”(在飞博盖德公司网站上可得)中，其内容通过引用以其整体结合在此。

如图7的示例性实施例所示，存在42堆电磁辐射源602，以提供两个“热启动”加热位置(由“d”表示)，接着是40个pcr温度循环加热位置。如图7所示，每个模块601位于带402的每隔一排容器邻近以适应每个pcr温度循环之间的温度监测位置和/或冷却和荧光检测位置。这些容器由主动或被动冷却构件403冷却，如被动散热金属，其位于带402的环的顶侧下方。如图7所示，当该容器处于pcr产物检测位置和温度监测位置时，光纤阵列701提供从带402的每个容器到光检测器708的光路。在此实施例中，光检测器708包括两个ccd相机(706、710)作为荧光发射光检测器、以及作为热红外感测装置的热成像仪704。仅用于说明目的，包括的是不同光谱波长的两种荧光激发光源705、707。

光纤阵列701包括三个单独的光纤阵列714、715、716，每个光纤阵列在分别连接到光纤阵列板713、712、709的一端紧密排列。光纤阵列中的两个(715、716)进行荧光激发/发射光用于荧光检测，而第三个光纤阵列714进行黑体红外辐射用于温度监测。此外，在此示例性实施例中用于荧光检测的每个光纤阵列715、716包含480个单独的光纤，当该容器处于pcr产品检测位置时，每根光纤的一端定位在容器上。在此示例性实施例中用于温度监测的光纤阵列714包括504个单独的光纤，当该容器是温度监测位置时，每个光纤的一端定位在容器上。第一温度监测位置在加热过程开始之前提供一排容器的基线温度读数(表示为“i”)。接下来的两个温度监测位置在热启动过程中提供温度读数。剩余的温度监测位置与被动散热金属403和pcr检测位置在相同的容器站。

对于荧光检测，激发光源707发射荧光激发光通过双向滤光块702至光纤阵列板709，该光纤阵列板709任选地连接至有序的紧密捆扎阵列，当容器处于pcr产物检测位置时，该有序的紧密捆扎阵列配置成沿着光纤阵列716向每个容器提供光路。此外，来自水性反应混合物体积的荧光发射光从容器沿着光纤阵列716传导至光纤阵列板709。光纤阵列板709通过会聚荧光发射光的光信号在其表面上产生图像阵列，并且ccd相机706收集图像并测量图像中每个单独光纤的信号强度。此外，激发光源705发射荧光激发光通过双向滤光块711至光纤阵列板712，该光纤阵列板712任选地连接至有序的紧密捆扎阵列，当容器处于pcr产物检测位置时，该有序的紧密捆扎阵列配置成沿着光纤阵列715向每个容器提供光路。此外，来自水性反应混合物体积的荧光发射光从容器沿着光纤阵列715传导至光纤阵列板712。光纤阵列板712通过会聚荧光发射光的光信号在其表面上产生图像阵列，并且ccd相机710收集图像并测量图像中每个单独光纤的信号强度。

对于温度监测，在每个“热启动”“d”之后并且在每个pcr产物检测步骤期间，在初始阶段“i”从各水性油基质发射的黑体红外辐射沿着光纤阵列714引导到光纤板713。通过热成像仪704测量光纤板713的面上的红外图像，该热成像仪704测量每个容器的信号强度并将强度转换成温度。在一些实施例中，将红外辐射滤光器703放置在光纤板713与热成像仪704之间。

在另一个实施例中，pcr扩增和产物检测系统另外地包含组装子系统，配置该组装子系统用于水性油基质的集合的可编程和自动组装。图8中描绘的是pcr扩增和产物检测系统的实施例的侧视图。在此实施例中，提供了包含液体排放构件801、802、803、804的组装子系统。在一些实施例中，液体排放构件801是配置用于分配载体油的12个吸头批量分配器，液体排放构件802是配置用于分配包封油的12个吸头批量分配器，液体排放构件803是配置用于分配包含多核苷酸样品的水性体积的自动移液器(例如，具有12个吸头的固定移液头)，以及液体排放构件804是配置用于分配包含pcr试剂、引物、和/或探针的水性体积的自动移液器(例如，单个吸头、非接触式移液头)。

图9中描绘的是pcr扩增和产物检测系统的实施例的侧视图。在图9的组装子系统中，系统控制使带402将一排12个容器移动到组装位置。基于来自每个操作模块的信号和完成带402上的最慢pcr加热步骤所需的时间，当在带402上的所有容器站处同时发生的所有操作完成时，带402前进一步(9mm)。例如，在实施例中，具有最长持续时间的pcr温度循环大约为15秒。因此，在带被编程以移动到下一步骤之前，所发生的过程不超过大约15秒来完成每个过程。在第一组装位置，12个吸头批量移液器801从载体油输入中吸入载体油并将载体油分配到一排容器中。带402将一排容器移动到下一个组装位置，其中12个吸头批量移液器802从包封油输入中吸出包封油并将包封油分配到一排容器中。带402将一排容器移动到下一个组装位置，其中固定的移液头803从例如包括条形码的输入板吸出含有适当的多核苷酸样品的水性体积。组装站可以包括条形码读取器，其被配置为读取条形码并访问例如lims软件以识别多核苷酸样品并确定用于每种具体的多核苷酸样品的适当的引物和探针。然后，控制系统使固定的移液头803根据需要将多核苷酸样品分配到尽可能多的容器中，以适应将要运行的引物/探针反应的数量。在某些情况下，运行的次数将需要多排容器。固定的移液头803具有大约15秒或更短的时间，这取决于pcr温度循环进行每排分配步骤的定时。此外，固定的移液头803可以被配置用于自动或手动的吸头改变以防止污染，或可替代地，固定的移液头803可以被配置用于自动吸头清洗。

然后，带402将一排容器移动到最终组装位置，其中单个吸头非接触式移液头804以以下量吸入含有适当的pcr反应混合物、引物和探针的水性体积：足以使用具体的pcr反应混合物、引物和探针测试的所有多核苷酸样品的量。然后，组装子站使单个吸头非接触式移液头804将pcr反应混合物、引物和探针分配到含有适当的多核苷酸样品的一排容器中。可以从lims提供鉴定用于具体的pcr基因分型反应的合适pcr反应混合物、引物和探针所必需的信息。在这种情况下，加载的简单查询列表可以为组装软件程序提供来自lims的需要的信息。适用于本系统的相似的硬件和软件配置在本领域中是已知的。与在给定的容器站发生的所有其他过程一样，pcr反应混合物、引物、探针分配步骤大约需要15秒才能完成。

在一排容器中组装反应之后，带402将该排移动到下个容器站，其中任选地，可以采取初始温度测量“i”以将此信息提供给系统控制软件用于确定每个水性反应混合物中多核苷酸样品的热启动变性所需的输出能量的量。在此容器位置处，来自光纤阵列714的光纤位于每个孔上方，并且将由此容器站处的各水性油基质发射的黑体红外辐射传导到光纤阵列板713，其聚合光学信号用于通过热成像仪704成像。热成像仪704将信号强度转换成温度信息，当容器向前移动到第一热启动加热位置“d”时，通过控制系统软件使用温度信息来调节电磁辐射源602的脉冲持续时间。在此实施例中，两个热启动位置每个都跟随有温度监测位置。控制系统软件使带402将一排容器移动到下一个容器站，该容器站是第一个热启动加热位置“d”。在此实施例中，每个电磁辐射源602是激光二极管发射红外辐射。因此，激光二极管602通过光管603发射红外辐射，其中每个光管603的末端位于该排中每个容器的顶部，以将红外辐射施加到其中含有的水性反应混合物体积中。优选地，每个水性反应混合物体积的温度上升至约90℃至约99℃(最优选地至约95℃)以使每个水性反应混合物体积中的多核苷酸样品变性。在第一次热启动加热步骤之后，控制软件使带将一排容器移动到下一个容器站，该容器站是温度监测位置。在需要的热启动变性需要超过15秒的情况下，包括另外的热启动加热位置“d”。

在第二次热启动加热步骤之后，带404将一排容器移动到下一个容器站，该容器站是冷却位置和温度监测位置。冷却位置包含大约位于带404顶侧下方的被动散热金属403，如图9所示。当被动散热金属块403与容器的底部接触时，热量从水性油基质通过容器传递到散热金属块403中，以冷却排中的水性油基质。优选地，水性油基质的温度降低至约60℃。在此容器站，通过热成像仪704测量各水性油基质的温度。

接下来，控制系统使带402将一排容器移动到下一个容器站以开始pcr温度循环。激光二极管602向该排中的每个容器中的水性反应混合物体积发射红外辐射，从而升高水性反应混合物体积的温度。另外，控制系统软件能够通过使激光二极管发射适当的红外辐射能量和脉冲持续时间来将水性反应混合物体积的温度升高至适当的退火温度和延伸温度来实现标记特异性pcr条件。在加热步骤完成之后，控制系统使带402将一排容器移动到下一个容器站的冷却位置、pcr产物检测位置、和温度监测位置。在冷却位置，热从排中的各水性油基质传递到被动金属散热器403，从而降低水性油基质的温度。将从荧光激发光源705、707发射的具有适用于激发pcr反应混合物中存在的荧光团(例如，vic和fam)的光谱波长的荧光激发光通过光纤阵列715、716并激发至排中的每个容器的水性反应混合物中。来自容器的荧光发射光通过光纤阵列715、716传回ccd相机710、706，ccd相机710、706将光信号强度转换为原始荧光信号用于通过控制系统处理。在此容器位置处，来自光纤阵列714的光纤位于每个孔上方，并且将由此容器站处的各水性油基质发射的黑体红外辐射传导到光纤阵列板713，其聚合光学信号用于通过热成像仪704成像。热成像仪704将信号强度转换成温度信息，当容器向前移动到加热位置时，通过控制系统软件使用温度信息来调节电磁辐射源的脉冲持续时间。将此过程重复高至40个或更多个pcr温度循环。

在一些实施例中，双向滤光块706、711和红外发射滤光器703使得温度测量和荧光测量能够通过防止不同光谱波长的串扰而同时发生。在其他实施例中，温度测量和荧光测量在可用时间范围内顺序地进行。加热步骤之后的温度监测对于向控制系统软件提供确定下一加热步骤所需的适当能量输出所需的温度信息是有用的。在包含光子加热步骤之后的温度监测步骤的一些实施例中，由于快速散热，在加热步骤期间的动态温度反馈是不可能的。例如，在一些实施例中，当移除加热源时，水性反应混合物体积快速散热并表现出约每秒20℃的温度降低。因此，在一些实施例中，加热位置包含绝缘以减少热损失。在其他实施例中，通过控制系统软件使用pcr产物检测位置处的温度监测来标准化原始荧光数据，因为本领域已知具有某些光谱波长的荧光可被温度影响。然而，在pcr产物检测位置处包含冷却机构的实施例降低了水性反应混合物的温度，以允许在大约相同的温度下进行所有荧光测量。

可替代地，可以通过将激光二极管与热探测器放置在相同的位置来完成在光子加热步骤期间的动态温度反馈。然而，如上讨论的，如果电磁辐射源在用于加热水性反应混合物体积的相同红外波段中发射显著的红外辐射，则热成像不能与加热同时进行，除非使用“闪烁”过程(即，红外加热源的快速交替闪烁与黑体红外发射的检测传感)。在一些实施例中，使用热电偶或热敏电阻代替热成像，这使得能够在红外辐射的同时执行温度监测，从而在光子加热期间实现动态温度反馈。

图9中还描绘的是浪费处置子系统，该子系统包含抽吸器901、903，批量分配器902，油分离器905和紫外灯904。在水性油基质已经移动通过加热位置、温度监测位置、和pcr产物检测位置之后，可以将水性油基质从容器中除去并丢弃。控制系统使带402将一排容器从包含最终pcr产物检测位置的容器站移动到抽吸器901。在优选的实施例中，该抽吸器901是12位移液头。抽吸器901从排中的每个容器中吸出整个水性油基质，并使水性油基质通过废物。在一些实施例中，将水性油基质通过管道系统，该管道系统将消除将抽吸器901移动到废物位置的需要。然后，控制系统使带402将一排容器移动到批量分配器902，该批量分配器902将清洁的油或水分配到该排的每个容器中。接下来，控制系统使带402将一排容器移动到抽吸器903，该抽吸器903从该排中的每个容器吸出油或水。如图9所示，实施例可以包括油分离器905，其中载体和包封油被抽出并在组装子系统中重新使用。在第二次吸出之后，控制系统使带402将孔移动到带环的下侧，其中紫外灯904发射紫外线辐射以破坏容器中任何剩余的多核苷酸，以防止后续pcr反应的多核苷酸污染。

图10中描绘的是pcr扩增和产物检测系统的光子加热位置、温度监测位置、和pcr产物检测位置的优选的布置。在此实施例中，带、组装子系统、和废物处理子系统如图9中所示的布置。然而，在图10所示的实施例中，该系统包含在交替配置中的相同容器站处的加热位置和温度监测位置，其中容器站包括pcr产物检测位置(和冷却位置)。该带将一排容器移动到加热位置，其中电磁辐射源位于容器的下方。在此实施例中，当容器处于加热位置时，电磁辐射源(例如，led)位于每个容器的底部，其中led发射具有在约100nm至约500nm范围内的光谱波长(例如，紫外线、紫色光或蓝色光)的电磁辐射(参见例如，图3)。在优选的实施例中，led发射蓝光。电磁辐射经由准直透镜聚焦在设置在容器底部与包封油之间的镀金聚酯薄膜上。将光能转换成热能(如本文中其他地方描述的)，并提高水性反应混合物体积的温度。在此实施例中，经由与水性油基质光学连通的热成像传感器进行同时温度监测。在优选的实施例中，当容器处于温度监测位置时，光纤位于每个容器的顶部，并将从水性油基质发射的黑体红外辐射传导至热成像传感器(参见例如，图3)。在一些实施例中，将红外发射滤光器放置在光路黑体红外辐射中，并定位于热成像传感器与光纤板的平面之间(参见例如，图9)。在此实施例中，每个pcr温度循环在约十秒或更短的时间内完成。

在第一此pcr温度循环完成后，控制系统使带将一排容器移动到下一个容器站，该容器站包含pcr产物检测位置。如图10所示，具有两种不同光谱波长的荧光激发光由荧光激发和发射检测器的荧光激发光源产生并且当该容器处于pcr产物检测位置时例如通过位于每个容器上的一种或多种光纤传送，并且传送至水性反应混合物体积(用虚线箭头表示)。响应于此，水性反应混合物体积中的荧光团发射荧光发射光，其通过例如一根或多根光纤(由虚线箭头示出)被带回荧光激发和发射检测器。然后通过荧光激发的荧光发射光检测器(例如，ccd相机)和发射检测器测量荧光发射光的强度。在一些实施例中，每个荧光激发光的光路包含荧光激发光源、双向滤光块、光纤阵列板、ccd相机、和光纤阵列(参见例如，图9)。在一些实施例中，每个荧光激发光的光路仅由光源(led或激光器)组成，并且荧光发射检测仅包含发射滤光器和ccd或cmos相机。另外，被动散热器可设置在带的顶侧下方，并且当处于pcr检测位置时位于每个容器下方(参见例如，图9)。在pcr产物检测步骤完成后，控制系统使带将一排容器移动到下一个容器站，在该容器站重复该过程达预定量的范围从1个到40个的pcr温度循环。

机械、电子和软件控制系统

本文提供的是适用于控制pcr扩增和产物检测系统的机械系统、电子系统和软件功能。各种可能的电子和软件配置适用于提供能够结合到本系统中的机械和电子控制系统，并且完全在本领域技术人员的知识范围内。图11中描绘的是优选的实施例的原理框图，该实施例包含用于完整的开始到结束单个装置实施例的控制功能(如图9和10中所示的移动带实施例)。在一些实施例中，本系统包含离线组装孔板中的反应和/或手动将一批容器移动到配置成使得在不移动容器的情况(即，不需要移动带或其他自动定位装置)下完成pcr加热和荧光检测的装置。通过在与每个容器相关联的共同光路上共定位加热和荧光检测组件，使得此类实施例成为可能。在这种情况下，不需要反应组装和/或容器定位。装置上的加热和检测操作将顺序发生，而不是同时在分开的位置发生。通过进行pcr循环加热，然后依次通过荧光检测，消除由加热光源的荧光检测的可能干扰和快速变化的温度所加强的复杂化。然而，不可能连续加载，处理和卸载，并且生产量更受限制。

图11中描绘的是优选的实施例的原理框图，该实施例包含用于完整的开始到结束单个装置实施例的控制功能。如图11所示，该系统包括主仪器工艺流程控制器(plc或电子微控制器)，其被编程以提供启动和控制在仪器上发生的“运行”的工艺流程中涉及的每个动作的功能。“运行”在本文中定义为对pcr产物荧光进行组装、处理和监测的一组反应的操作，其中pcr扩增和产物检测系统在工艺流程和pcr扩增和产物检测期间自动运行而没有任何显著的指导输入，并且pcr扩增和产品检测系统在任何批量装载、卸载或维护操作的工艺流程期间都不会关闭或重置。因此，系统支持运行所需的所有反应组装和pcr参数信息是预定义的，并在运行开始之前传送给系统。使用这种控制系统的实施例是基于微量滴定板的系统。或者，将开始组装和处理可用样品和反应所需的信息传送到pcr扩增和产物检测系统以开始操作，并随后将另外的信息传送到pcr扩增和产物检测系统以增强其指令并支持继续组装和处理提供的另外的样品，使得系统仪器在运行期间的任何时间都不会完全停止并维持工艺流程。

在主仪器工艺流程控制器的控制下，各个子系统可以具有其自己的电子微控制器、或可以由主仪器工艺流程控制器的子程序、多处理器、和电子模块控制。在任一情况下，子系统以协作和协调执行它们各自的功能，使得操作的定时确保所有反应的正确组装和处理。例如，对于任何给定的反应组装体积进行具体的pcr热循环加热和冷却操作所需的确切时间不是预先知道的，并且通过在加热过程期间具体的反应组件体积的反馈温度监测动态确定。因此，主仪器工艺流程控制器收集并编译每个正在进行处理的容器的反馈信号状态信息，并防止任何容器发生下一个处理步骤直至所有容器的前一个步骤完成。直到热循环加热完成才开始荧光检测。同样，带系统上，孔并不会通过容器阵列位置电动机控制器沿着带向前推进，直至主仪器工艺流程控制器确认反应组装完成和/或所有孔的荧光检测读数完成。一旦所有孔的反应组装、光子加热、和/或荧光检测读数完成，主仪器工艺流程控制器通知容器阵列定位过程控制器将电动机定位信息转递到容器阵列位置电动机控制器以使定位装置(例如，移动带)将容器移至下一个容器站。因此，对于给定的处理步骤需要最长时间的具体反应体积确定整个系统的进展速率。

a.控制组装子系统。

如已经陈述，系统的一些实施例整合了在线反应组装。在此类情况下，主仪器工艺流程控制器将命令和所需的信息(如样品识别和体积信息)传递到反应组装移液过程控制器，在其上获得样品、试剂、和油。移液过程控制器将电动机位置信息发送至移液位置电动机控制器和移液吸出/分配电动机控制器(其将液体移动至反应容器)，并通知已在容器中组装的反应的布置的主仪器工艺流程控制器。主仪器工艺流程控制器可以，可替代地，命令具体的预定义的反应的布置，但是如果移液过程控制器通知反应的布置的主仪器工艺流程控制器则系统更有效地工作，其可以快速地产生。然后，主仪器工艺流程控制器可以将该布置记录在本地存储数据库中，使得当收集荧光数据时，系统可以确定什么具体的反应混合物产生什么荧光。

b.控制光子加热子系统和微控温度反馈以及光源控制子系统。

光子加热子系统采用比例-积分-导数(pid)控制器硬件或软件组合定制开发的加热控制规则集来确定驱动光源所需的能量。pid参数和规则经过调整以提供最快的加热，而不会出现所希望的设定点温度的显著超过。

如图11所示，主仪器工艺流程控制器将加热分布信息(包括实现什么温度设定点和多长时间以保持反应体积在各温度)传递至加热控制器并触发供热控制器将温度设定点的信息发送到pid加热功率调节器。作为响应，pid加热功率调节器将功率水平信息传输到加热光源电源供应器，其向加热光源(即，电磁辐射源)提供适当的能量输出。该加热光源然后向容器发射电磁辐射。如在本文其他地方讨论的，本系统包含多个温度传感器(即，热检测装置，如与热红外感测装置光学连通的光纤、热敏电阻或热电偶)，在一些实施例中，这些温度传感器提供实时pcr温度循环信息。各个电子和软件子系统减少了一些主要仪器控制器的负载，特别是在主仪器工艺流程控制器处理器速度有限的情况下。例如，加热在小体积反应中非常快速地发生。为了准确且快速地控制加热过程，大约每100毫秒至200毫秒提供温度反馈值。通过采用单独的加热控制处理器系统，处理器不涉及非加热控制任务，并且可以处理快速反馈并控制预防潜在过热所需的周转时间。因此，提供温度反馈和光源控制子系统，其中由温度传感器产生的电压、电流或红外图像信息被发送到温度传感器信号处理器，该温度传感器信号处理器向pid加热功率调节器提供反馈温度信息，其中，响应于此，将更新的功率水平信息发送到加热光源电源供应器以调节加热光源的能量输出。

一旦达到温度设定点，pid加热功率调节器将此信息传输到加热控制器。此时，加热控制器将命令pid加热功率调节器为加热光源提供另外的输出能量，以将反应的温度升高到下一个温度设定点，或者，如果pcr温度循环完成，则加热控制器将命令pid加热功率调节器终止能量输出，从而关闭加热光源。一旦光子加热子系统完成pcr温度循环，则加热控制器就通知主仪器过程流控制器，例如通过数据通信协议或数字线路状态，该反应完成并等待进一步的指令。

c.控制荧光检测子系统。

荧光检测控制器提供了当主仪器工艺流程控制器的命令启动时打开和关闭荧光激发光源的功能。同样，由荧光发射检测器启动发射光检测由荧光检测子系统管理。如图11所示，主仪器工艺流程控制器触发激活适当的荧光激发电源的荧光检测控制器，导致从一个或多个荧光激发光源供应器发射荧光激发光。如本文其他地方所述，当该容器处于pcr产物检测位置时，荧光激发光可以被传导到含有水性油基质的每个容器。水性反应混合物体积中的荧光团响应具有适当光谱波长的荧光激发光并发射荧光发射光，该荧光发射光被传送到荧光发射光检测器。荧光发射光检测器将原始信号信息发送到荧光信号处理器，荧光信号处理器收集、处理并将数据作为相对荧光单位报告给荧光数据记录仪。荧光数据记录器将相对荧光单位信息传递到本地存储数据库和/或遗传分析处理器(配置为运行pcr数据分析软件)，其基于样品和反应组装计划信息提供的荧光数据和信息确定遗传等位基因调用报告。

在优选的实施例中，在每个pcr温度循环之后收集荧光数据。在一些方面，pcr反应的质量和特性是使得pcr数据分析软件程序通知主仪器工艺流程控制器，已经基于已经可用的信息进行了可靠的遗传呼叫，并且主仪器工艺流程控制器可以然后指示加热控制器和荧光检测控制器来终止对应于遗传呼叫数据的具体水性反应混合物体积的后续处理。这种另外的反馈控制可节省能源和时间。

d.用户界面和外部系统。

在图11所示的实施例中，系统采用lcd或视频图像显示器来提供关于仪器的状态信息(即，仪器lcd状态显示器)。还有一个手动控制界面，其允许手动启动、暂停或中止仪器操作等功能。图11中还示出了基于pc的用户界面，其可以是单独的基于pc的应用程序或网站用户界面。这样的界面将允许多个用户能够将信息发送到仪器以设置和开始运行或将另外的反应加载到已经开始的运行中。

实验室信息管理服务(lims)是本领域公知的且是基于软件的实验室和信息管理系统，其具有支持实验室操作的如工作流、和数据跟踪支持、灵活架构和数据交换接口的特征。因此，在一些实施例中，本系统包含lims程序。图11所示的是外部系统，其包括通信连接到lims数据库和本地存储数据库的lims数据交换服务，并配置为向基于pc的用户界面发送“运行计划”和计划信息、并向主仪器工艺流程控制器发送“运行组分”计划信息。

可以使用本发明系统的组件的许多变型，如下面举例说明的。

器皿

试图检查许多商业上可获得的微量滴定板、管、小瓶、以及多室液体保持装置以找到合适的器皿以支持液体体积，同时适应光介导的加热。液体体积取决于具体需要是灵活的，并且通常可以在较少光能输入下更快地加热较小的体积。然而，为了原型系统的方便和简单，常规使用5微升油中的3微升水性液滴。尺寸、形状和壁厚都是使商业上可获得的器皿检查不良选择的所有因素，以支持选择的液体体积的快速和受控的光介导的加热。一些器皿没有适合金金属的足够区域的底部。许多其他的具有壁厚，该壁厚产生的热质量和散热率太大而不适合所希望的光源。通常需要高瓦数激光器以提供足够的光能以加热某些器皿中的少量液体。一些器皿的形状和尺寸产生不均匀的液体加热，导致热循环不良。一些器皿在由金产生的热量下熔化、分层或变形。最终，制造了薄壁的、真空成形的塑料器皿，并证明这些器皿非常有效。孔的此类真空成形的阵列相对便宜，如果需要可以是一次性的，并且适用于系统的所有检查的实施例。使用不锈钢针构造真空成型模具，其以一个或多个孔的任何所希望的布置和配置产生均匀的薄壁器皿阵列。

可以容易地生产单孔器皿、孔带以及孔的排和列的阵列。大多数多孔阵列都是以9毫米的中心到中心间距制造的，以支持行业标准的实验室多吸头移液技术。但是，任何间距或所希望的布置都是可行的。出于目的测试了若干种可用于真空成型/热成型的塑料片材料。若干个是有功能的。然而，选择具有厚度为0.04英寸的干净、透明的petg(乙二醇改性的聚对苯二甲酸乙二酯)片并用于大多数器皿阵列。如图14所示，对于大多数原型和测试系统，制造了具有内径为3毫米且深度为5.5毫米的平底孔(a)阵列。由于这些薄壁孔阵列缺乏许多较厚壁器皿的刚性，因此大阵列孔需要支撑结构(b)以防止阵列的弯曲、下垂和翘曲。由0.125英寸(4毫米)厚的丙烯酸片提供支撑，该丙烯酸片被激光切割以具有小孔的布置，该布置与petg真空成形的一批孔中的孔的位置和直径匹配。将这些真空成形的孔器皿插入支撑板中的小孔中。这导致在支撑板下方具有大约1.5mm突出的孔阵列的装置。支撑板不仅提供对一批孔的支撑，而且还提供孔与光源的精确对准。

光/热转换材料

为了吸收常规使用的蓝色波长光并将其转换为热量以驱动热循环，在反应孔的底部需要金金属膜(图13)。理想地，可以使用直接施加到孔底的气相沉积或电镀金。然而，气相沉积和电镀工艺对于大多数原型测试来说是不方便的且不切实际的。可替代的是，采用插入孔底部的镀金箔薄膜盘(图13中的e)。这些盘由可商购的镀金聚酯薄膜或镀金铝箔的片料冲压而成。大多数早期原型测试是使用镀金聚酯薄膜进行的。然而，发现在某些情况下，聚酯薄膜会熔化、收缩或失去其金涂层。而且，难以防止聚酯薄膜在一些液体中漂浮，特别是当液体的温度快速变化并且液体体积中可能存在气泡时。通常可用的铝箔被证明太厚而不能有效地工作。然而，发现了非常薄的镀金铝箔，通常用作糖果包装纸(ckproducts/oasissupply4x4英寸金箔糖果包装纸89-44g)，效果非常好。冲头由锋利的钢棒和具有匹配直径孔的钢板制成，允许产生3mm的箔盘。将这些盘插入真空成型器皿的孔中的小直径真空吸头拾取笔，金面朝下。将盘的尺寸设计成紧密地配合在孔的底部。

油基质

如先前所提及，可以使用两种油用于支撑水性液滴、硅酮包封油和全氟化碳载体油，这对于定中心和污染控制具有某些优点。然而，发现在某些情况下，当液体被光迅速加热和冷却时，使用两种油会产生“熔岩灯”效果。使用位于单孔器皿侧面的小型摄像机进行的观察表明，使用一些全氟化碳油导致整个体积的液体在快速加热和冷却过程中搅动、滚动并分裂成较小的液滴。去除全氟化碳油，并仅适用硅油(图13中的c)消除了这种搅拌。在油中建立了热诱导电流，正如可以添加到油中的小颗粒视频的研究所表明的那样。然而，这些电流没有显著地移动水性液滴(图13中的d)，其倾向于停留在孔的底部金箔正上方的油的中心。实际上，这些小电流在贯穿整个液体体积中促进更均匀的温度，使温度监测和控制更容易。所选择的水性液滴和油的体积由器皿的尺寸和形状确定，并在水性液滴上提供大约0.5毫米至1毫米深的油层。此油覆盖物防止了水性液滴的蒸发。

疏水的涂层

为了提供由全氟化碳载体油提供的定中心和污染控制，发现了简单的可替代方案，其不需要液体体积中的载体油。真空成形的孔阵列中的每个孔的下半部分用超疏水涂层(来自lotusleafcoatings公司的hydrofoe^tm)处理(图13中的b)。许多原型系统实施例包含此涂层。该涂层极大地增强了硅油中水性液滴的定中心，并排斥了孔壁与水性反应混合物之间的任何接触。在原型系统中，用20微升的hydrofoe^tm处理每个孔5分钟。在没有疏水涂层的情况下，水性液滴有时会粘附到孔壁上，这被证明对ir热成像和荧光检测是不利的，并且如果将孔再次用于随后的pcr反应则允许潜在的交叉污染问题。超疏水涂层相当耐用，并且在支持若干个pcr反应的一次处理后，孔可以多次使用。用疏水涂层代替全氟化碳油简化了反应体积的组装、降低了成本、并消除了潜在危险的全氟化碳废液。虽然hydrofoe^tm目前用于原型系统，但还有许多其他商业上可获得的疏水处理涂层可以同样良好地工作。

光源

已经研究了许多激光器和led光源作为驱动加热的可能能源。许多常用的蓝色led不能提供必要的能量输出以快速加热所希望的反应液体体积。一些激光器和led相对昂贵。有些是大而笨重的，并且不适合放置在孔下其可以靠近一批孔。一些需要昂贵且复杂的透镜系统来聚焦光。一些激光器产生强烈的、小直径的、准直光源，其可以很容易地定位以仅照射反应孔底部的金金属表面。这些激光器可用于非常快速地加热大多数测试的液体体积。然而，这些激光器通常被认为是潜在的眼睛危害，这被认为是不合需要的。发现led很小、价格便宜、并提供所需的光强度。此外，所选择的led可以非常靠近薄壁真空成形的器皿中孔的底部(图14)，使得led发出的大部分光与孔的底部金色金属层相交。这使得这些选定的led能量有效并且不需要聚焦透镜。如果从led上取下圆顶，则luxeonrebeles1w700ma品蓝led(lumiledsholdingb.v.)运行很好。luxeonzserieses700maled也运行良好，是没有保护圆顶的“裸片(nakeddie)”led装置。移除圆顶允许模具定位到非常靠近(在1毫米内)真空成型的孔的底部，从而提高能量传递效率。这些led可用作微型焊盘上的表面贴装装置(带有触点)，可以轻松安装到印刷电路板上。

光源定位

对于原型装置设计了印刷电路板，允许独立控制96个led，定位为具有9毫米间距(图16)。此具体的设计支持本系统的常用实施例，该系统利用针对96孔微量滴定板中的孔的国际标准布局和覆盖区设计的多吸头移液技术。用于任何其他led布置的类似印刷电路板是可行的。

并非所有输入电能都转换为光。由led产生显著的量的热。为了保持led的稳定性并延长寿命，led可以安装在散热器上以允许此热量消散。在原型系统中，放置风扇以将这些热量从led和led上方的孔中带走。放置另外的风扇以提供穿过底部到孔的空气流。这些风扇由微控制器软件自动开启和关闭，以在希望时促进孔的更快速冷却。

光源装置

为了支持原型系统，已经组装了一个led驱动器系统，该系统从微控制器通过单个i2c总线提供每个led的脉冲宽度调制(pwm)功率控制。led驱动器系统采用一系列pca9685模块，该pca9685模块可从多个电子组件源获得。每个pca9685模块可以为高达16个可寻址的led提供12位pwm信号。这些模块含有其自己的内部时钟，无需连续刷新pwm设置。pca9685模块可以串联组装，这允许单个微控制器在一个i2c总线上控制数百个led。驱动96个led需要6个模块。为了适应驱动单个1wled所需的电流，来自pca9685的每个led的pwm信号输出被路由到安装在rapidledldd-h-4四驱动板(rapidled)上的rapidledmeanwellldd-700h电源驱动器上。每个led都需要ldd-700h。每个驱动板都连接到电源并已经连接每个led输出。图15显示了驱动led所需的组件的基本布置。图中仅显示了32个led，但设计用于测试的组装驱动96个led。此设计轻松扩展到更大数量的led，并且是在原型系统中驱动多个led的简单、廉价且灵活的方式。定制设计的类似功能的led控制电路也是可能的。

非接触式温度传感器

为了控制和调节led的强度，从而调节温度，理想的是使用来自温度传感器的反馈，该温度传感器可以连续监测每个液体体积的温度。反应的尺寸和组成的细微差别可引起加热期间的定时和所需功率水平的显著变化。可以在每个反应中插入简单的热敏电阻或热电偶，以提供反馈温度信息。对于很多原型和测试系统，将0.005英寸热电偶(欧米茄工程公司(omegaengineeringinc.))插入单独的孔中。然而，对于系统的一些实施例，这存在污染控制、器皿重复使用、以及孔阵列的容易移动的多个问题。对于大多数实施例，温度监测的优选的方法是使用非接触式ir传感器。已经进行了多个非接触式ir传感器。许多可用的离散、单一测量、非接触式ir温度传感器的尺寸、形状、位置/对准、成本、精度和视野不适合在我们的原型系统中成功使用这些传感器。迄今为止，使用非接触式ir成像技术可以获得最佳效果，该技术可以从获得的热图像中多个像素同时报告温度。这克服了对许多单独传感器的需求，并且支持更快和更容易地获取和操纵多个孔的温度数据。此外，通过分析反应孔占据的整个区域的热图像，不需要精确对准各个离散温度传感器。虽然可以使用许多可用的ir成像相机，但已在原型系统中使用flir辐射传感器和flirax5-系列热成像相机(flirsystems公司)进行温度监测。两个热成像装置都可以连接到微控制器或计算机，并可以从观察到的物体的图像报告温度。通过将这些成像系统定位在一批反应体积上，在发生光介导的加热的同时监测温度。在原型系统中，具有对应于孔位置的最高报告温度的像素被用作孔的温度。报告的温度是表面温度，并且可以比嵌入式接近金层的热电偶同时报告的温度低几度。然而，只要器皿尺寸、配置和液体体积保持恒定，就可以校准和补偿这些温度差异。

荧光传感器

典型的原型系统测试pcr反应混合物是采用荧光fam和vic探针的双探针(双等位基因)taqman^tmpcr反应。一些反应还含有未结合的rox染料，用于评估反应组分的体积和浓度。这些pcr反应的全光谱激发和发射扫描显示窄的激发和发射窗口，其中发生2种探针染料之间的最小发射串扰。对于我们的具体的测试pcr反应混合物，最佳fam激发窗口为475nm-500nm，其中最佳发射窗口在510nm-525nm之间。vic荧光最佳激发窗口为525nm-535nm，其中最佳发射窗口为555nm-565nm。这些激发和发射窗口用于在原型系统中选择激发光源和激发和发射光学滤波器。

许多离散反应光学荧光传感器和扫描荧光传感器技术可以逐个测量从各个反应体积产生的荧光。然而，为了提供实时(逐周期)荧光测量所需的快速荧光数据收集、并使原型系统的总体速度尽可能快地，希望同时测量来自多个孔的荧光。这可以通过使用光纤阵列和/或通过并行使用多个荧光传感器来实现。然而，在大多数原型系统中已采用荧光成像相机技术。与适当的激发和发射荧光滤光器一起使用的灵敏的超低光成像相机能够在原型系统中同时收集来自多个反应的fam和vic荧光探针taqmanpcr产物数据。相机的灵敏度并不是主要问题。在过去几年中，此领域的技术进步使得找到具有合适能力的摄像机变得相对简单。已经检查了若干种相对低成本的荧光显微镜和荧光天文相机。可行的相机的实例包括sonya7sii(索尼公司(sonycorporation))、tucsenish1000(tucsenphotonics)、toupteke3cmos(touptekphotonics)、amscopemt5000和amscopemf603c(unitedscopellc)。

激发光源

设计了激发和发射滤光器以及激发光源。对于仅观察到一个孔的装置(占据非常小的区域)，多个光源和窄带光学滤波器是可能的。然而，对于荧光激发，由pcr反应液体的一批孔占据的相对大的区域的照射，需要强烈且均匀的激发光。可用的led光源具有非常宽的光谱输出，必须进行大量过滤，以提供所需的窄带宽、以支持fam和vic荧光发射的清洁分离。可以将标准的窄带通干涉滤波器定位在led上以提供所希望的光谱窗口，但是必须精确地控制撞击干涉滤光器的光的入射角以消除不希望的光谱偏移。对于具有这种布置的物理组装来均匀地覆盖由一批孔所占据的大面积是一项显著的工程挑战。为了提供所需的光强度和窄激发波长，激光器提供了更可行的解决方案。相对安全的，激光线装置可以同时在若干个pcr孔上投射强光线。从本质上讲，来自激光器的光输出的带宽非常窄。可以快速移动此激光线以覆盖另外的孔，或者可以在激光线下移动这些孔以捕获来自多排孔的荧光。两个激光器，每个所希望的激发波长一个激光器可以依次辐射所有反应体积，并且仍然只需要几秒钟。另一种替代方案是使用galvo头镜扫描仪(galvo-headmirrorscanner)将激光点光束顺序地偏转到每个所希望的孔位置。此类装置通常用于投射用于秀场和大型观众显示的激光模式。便宜的galvo头镜扫描仪每秒可以移动超过2万点。对于激光线和galvo头镜扫描激光器的荧光激发，由fam和vic探针发射的荧光可以由相机顺序地检测，该相机可以在扫描所希望的数量的孔所需的时间内整合。可以使用具有合适的2波长带通滤波器的单个相机、或者可以使用两个相机，每个相机具有较便宜的单波长窄带通滤波器。

通过以下实例对本公开进行说明。前面和后面的描述和实例不是旨在限制，而是说明所描述的实施例。因此，应当理解，本公开不限于实例的具体细节。

实例1

图17说明了从由toupteke3cmos相机捕获的单个(200msec曝光)图像中提取的40个pcr循环后从16个反应孔中观察到的荧光。在进入相机透镜之前，通过565nm+/-5nm窄带通干涉滤光器过滤荧光发射光。用便宜的20mw532nm激光线(laserlands公司)照射孔以提供vic激发光。16个样品的集合是具有纯合vic、杂合vic和vic阴性样品的多种基因型。基因型中的这种变化有助于峰的高度变化。本文中证明了vic荧光，因为在典型的pcr反应，清晰地测量vic荧光比fam荧光更困难。使用公开可得的imagej图像分析软件(imagej.nih.gov)从获取的图像中提取像素强度信息。

当完全自动化时，使用上述相机系统，获取荧光图像并从图像中的像素提取荧光强度仅需几秒钟。利用这种方法的多个系统实施例是可行的。可以将一组反应孔从进行加热的位置移动到相邻的室，在那里相机可以测量荧光。可替代地，可以将一个或多个荧光检测相机临近ir成像相机或离散ir传感器定位在孔被加热的相同位置处。目前使用的450nm1wled在原型系统中提供加热光能、产生非常明亮和宽的光谱输出，即使使用最好的发射阻挡滤光器也可以淹没荧光检测。因此，在这些原型装置实施例中，在进行荧光测量时，不能打开加热灯。这导致在下一个加热循环开始之前的荧光测量期间每个热循环之后反应体积的几秒钟另外的冷却。虽然当加热灯熄灭时，反应体积的温度最初从95℃的变性温度下降得非常快(通常为每秒6到10度)，但是随着环境温度与反应温度之间的差异减小，在最初的几秒钟后，温度下降速度减慢。即使在开始下一个加热循环时有这样的延迟，在具有指定反应体积的原型系统中，使反应体积回到所需退火温度以开始下一循环所需的另外的时间仅为1或2秒。

通过以下实例对本公开进行说明。前面和后面的描述和实例不是旨在限制，而是说明所描述的实施例。因此，应当理解，本公开不限于实例的具体细节。

实例2

来自光介导的水性油基质反应的pcr产物检测

形成dna靶基因座的双等位基因询问的两种探针和定制设计的引物对在水性油基质中用光介导的温度循环进行测试。将探针和引物与典型的pcr酶和试剂在密封孔中组合，并在水浴热循环仪中运行高至40个pcr温度循环。在热循环后，然后在商业荧光读数器中在对于fam和vic染料的发射波长下测量pcr产物，该fam和vic染料与具体的基因座等位基因的两个探针相关。升高的fam和/或vic荧光表明存在针对dna等位基因的扩增的pcr产物，该dna等位基因设计有探针和引物的。

为了检测水性油基质中的光介导的pcr产物，从常规基因分型生产过程获得先前提取的dna样品。这些样品构成已知的基因型。已知样品1产生用于选择的fam探针的pcr产物。已知样品2产生用于选择的vic探针的pcr产物。已知样品3产生用于选择的具体的dna基因座的fam和vic探针的pcr产物。

制备了384孔透明平底板，其中孔的内部底部涂覆有金乳液漆的薄层。将0.005英寸的热电偶插入并定位在涂覆的孔中，使得热电偶珠位于金漆上方大约0.5mm处。在制备的孔中，组装水性油基质pcr反应用于每个样品以及用于无模板对照(没有dna添加到反应中)。各水性油基质由2μl的水性pcr反应混合物组成，其组成与生产基因分型过程相同，在4μl硅酮包封油中在4μl全氟化碳载体油中。

将384孔板中的水性油基质反应一个接一个地放置在200mw405nm激光二极管上，聚焦以照射直径大约1.5mm的金漆区域。使用arduino微控制器(如arduino网站上深入描述的那些)以及稳压电源来驱动光源，使得光可以每秒闪烁高至500次，其中脉冲宽度调制的功率取决于孔中热电偶检测到的温度。将微控制器被编程为在62℃的达到的温度提供两秒、接着是在72℃的达到的温度提供五秒、接着是在95℃的达到的温度提供两秒。对微控制器进行编程以重复该温度曲线40次以完成pcr扩增。来自前十个pcr温度循环的温度曲线数据在图12中提供。

在光介导的pcr热循环之前和之后，将板移至商业荧光板读数器，其中测量每个反应孔的fam和vic荧光。如预期的，对于样品的fam和vic探针两者观察到升高的荧光。此测试的结果示于表2中：

表2：在40个光介导的pcr循环之前和之后，已知基因型样品的相对荧光

ntc＝无模板对照

实例3

通过热冲击的dna提取

pcr扩增系统的要求是dna样品的来源，其可以掺入pcr反应中。已经观察到，可以在与各种植物或植物部分接触的各种基质上或其中发现足够量的含dna的有机材料。来自植物表面的拭子、少量培养基、或在各种植物部分上冲洗的液体可含有显著的量的dna。此类收集的含dna的材料提供了植物的非破坏性dna取样的手段。这种“脱落的”含dna的材料有时可以直接使用(而无需进一步纯化)作为pcrdna来源，如果它暴露于“热冲击”以释放、解开和/或去区分包含在液体中的dna和/或使对pcr扩增有害的酶和其它材料变性或破坏。无论采取何种确切的作用方式，单个非常快速加热和冷却处理都可以使dna可用并适用于pcr。两个或更多个快速加热和冷却循环可能潜在地增强对一些植物来源的此效果。通过观察，来自植物胚胎周围的培养基或培养的植物组织的单个3微升体积的水性液体可以含有足够的dna用于许多pcr反应。

在一个实施例中，使用与如上所述的后续pcr扩增步骤中使用的相同热源，使用热冲击从本发明的装置中的脱落材料获得dna。在另一个实施例中，使用光子加热装置的单独位置或定位用于快速加热含有此棚屋植物材料的少量液体。尽可能快地，将液体温度从室温升至90℃至98℃并立即将其再次降至室温，从而提供所需的热冲击。在一些实施例中，可以通过在加热处理之前使用珀耳帖(peltier)冷却或浸没在冷浴中将液体温度降低至零下温度(经常使用的是-20℃)来进一步增强该过程。可以通过在热冲击期间或之后结合液体的温和地搅动或振动来进一步增强该过程。此搅拌均匀地混合液体和/或增强dna的释放。这种加热(和任选的冷却)设备可以简化手持或便携式装置中pcr反应的设置和/或可以用于加速单个或多个dna样品的热冲击处理，同时还降低能量成本。

在其他实施例中，许多其他dna提取和纯化方法可以提供用于光子pcr反应的dna。例如，可以通过将植物材料与酶一起孵育来获得dna；该酶可以是l，含有大范围的糖酶(包括阿拉伯糖酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶、半纤维素酶、和木聚糖酶)的多酶复合物。(参见西格玛奥德里奇公司(sigmaaldrich)产品目录)。一旦植物材料被酶消化，就可以使用热冲击来制备释放的dna用于pcr。可替代地，可以使用更传统的dna提取技术获得dna，这些dna提取技术如但不限于使用结合遗传物质的磁性颗粒或本领域普通技术人员已知的任何方法。