本发明属于酶催化与传感检测技术领域，具体涉及一种g-c3n4@hemin复合物模拟酶的制备与应用。
背景技术：
糖尿病是一种常见的疾病，准确快速的检测葡萄糖的含量对于诊断和治疗糖尿病是非常有必要的，生物体内细胞代谢产生的过氧化氢是临床医学上诊断某些疾病的重要依据之一，目前普遍应用的葡萄糖和过氧化氢检测方法主要包括两大类：酶学比色法和电化学法。电化学法检测比较灵敏，但是需要专门仪器即电极和电化学工作站，不便于检测。天然酶能够与底物特异性结合，而且可以高效催化化学反应，这使得它被成功地用于许多领域。但是天然酶存在较多的缺陷，其来源有限，纯化过程比较困难，且成本比较高，反应条件苛刻且容易受外界环境因素如高温、强酸、强碱等影响而失活等等，这些缺陷限制了它在许多方面的应用。正由于天然酶的这些缺陷，近些年，研究人员开始越来越多的关注和研究模拟酶的制备，使其具有与自然酶相似的功能。
2007年，四氧化三铁磁性纳米粒子首次被发现其自身与自然界中的过氧化物酶具有相似的催化活性。在过氧化氢存在下，能够催化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine,tmb)、二氨基联苯胺(diaminobenzidine,dab)等辣根过氧化物酶(hrp)的底物反应，生成的反应产物与过氧化物酶催化产物相同，从而产生与过氧化物酶类似的催化作用。自此报道之后，越来越多的关注开始转向模拟过氧化物酶以及它们潜在的应用价值。在维持人体生命活动的过程中，过氧化物酶是广泛存在于体内的一类氧化还原酶，它以血红素为辅基，是参与体内生理代谢的一种十分重要的天然酶。血红素是一种铁卟啉衍生物，然而，由于易形成二聚体导致其催化活性大大降低，这就使得直接使用血红素作为模拟酶仍然是一个挑战。
技术实现要素：
为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供了一种g-c3n4@hemin复合物模拟酶的制备与应用，制备的复合物模拟酶具有血红素与类石墨烯的双重催化功能，制备过程简单，易于保存，无需复杂仪器，成本较低，便于检测等优点。
为实现上述目的，本发明的采取的技术方案为：
一种g-c3n4@hemin复合物模拟酶的制备方法，包括以下步骤：
取三聚氰胺粉末放于磁舟中，置于马弗炉于氮气中550℃加热裂解4-6h后自然冷却至室温，得到淡黄色g-c3n4粉末；取g-c3n4粉末分散于去离子水中使其浓度为50mg/ml-100mg/ml，超声分散16h，以11000rpm的转速离心5min以除去残留的未剥离的g-c3n4，将含有g-c3n4纳米片的上清液在60℃下烘干备用；
取已烘干的g-c3n4纳米片分散于去离子水中使其浓度为2mg/ml,取血红素分散于去离子水中使其浓度为1mg/ml-5mg/ml，将两溶液按照体积之比1:1混合，于水浴中65℃恒温反应8-10h，自然冷却至室温后，得到混合溶液；将混合溶液在11000rpm下离心，采用无水乙醇和蒸馏水洗涤3-5次，所得沉积物于60℃下烘干，即得g-c3n4@hemin复合物。
所述的g-c3n4@hemin复合物具有过氧化物酶样催化活性，最适ph值为4.0，最适温度值为40℃。
利用所述的g-c3n4@hemin复合物模拟酶比色检测过氧化氢，包括以下步骤：
配置一系列浓度为5μmol/l-500μmol/l的过氧化氢水溶液，向离心管中加入100μl浓度为2μmol/ltmb溶液，然后加入100μl上述不同浓度的过氧化氢水溶液，再加入100μl浓度为50μg/ml的g-c3n4@hemin复合物模拟酶分散液，最后向上述溶液中加入ph4.0浓度为0.2mmol/l的hac-naac缓冲液至溶液总体积为3ml，于40℃水浴条件下恒温反应10min后滴加20μlh2so4终止反应，h2so4的体积浓度为20％，通过紫外-可见光谱检测其在652nm处的吸光度，再根据吸光度对过氧化氢浓度作图。
利用所述的g-c3n4@hemin复合物模拟酶比色检测葡萄糖，包括以下步骤：
首先向离心管中加入1ml的ph7.4浓度为0.2mmol/l的磷酸盐缓冲溶液，再分别加入100μl的10μmol/l-500μmol/l不同浓度的葡萄糖溶液，然后加入10μl浓度为5mg/ml的葡萄糖氧化酶，摇匀，在37℃水域条件下反应1h，得混合液；向离心管中加入100μl浓度为2μmol/l的tmb溶液，再加入100μl浓度为0.5mg/ml的g-c3n4@hemin复合物模拟酶分散液，最后向上述溶液中加入ph4.0浓度为0.2mmol/l的hac-naac缓冲液至溶液总体积为3ml，于40℃水浴条件下恒温反应10min后滴加20μlh2so4终止反应，h2so4的体积浓度为20％，通过紫外-可见光谱检测其在652nm处的吸光度，再根据吸光度对葡萄糖浓度作图。
利用所述的g-c3n4@hemin复合物模拟酶用于血清中葡萄糖的检测，包括以下步骤：
先向离心管中加入1ml的ph7.4浓度为0.2mmol/l的磷酸盐缓冲溶液，再加入100μl稀释过的血清溶液，稀释过的血清溶液为血清用去离子水稀释十倍后的溶液，然后加入10μl浓度为5mg/ml的葡萄糖氧化酶，在37℃水浴条件下反应1h，得混合液；向离心管中加入100μl浓度为2μmol/l的tmb溶液，再加入100μl浓度为0.5mg/ml的g-c3n4@hemin复合物模拟酶分散液，最后向上述溶液中加入浓度为0.2mmol/lhac-naac缓冲液至溶液总体积为3ml，于40℃水浴条件下恒温反应10min后滴加20μlh2so4终止反应，h2so4的体积浓度为20％，通过紫外-可见光谱检测其在652nm处的吸光度，将得到的吸光度值代入葡萄糖标准曲线中，确定血清中葡萄糖的含量。
本发明的有益效果是：制备的g-c3n4@hemin复合物，具有过氧化物酶样催化活性，是一种新的过氧化物模拟酶，且该模拟酶与底物的亲和性好。基于g-c3n4@hemin的催化活性和葡萄糖氧化产生过氧化氢的原理，建立了过氧化氢和葡萄糖的比色检测方法，对于过氧化氢的检出限为1×10-6mol/l，线性范围为5×10-6mol/l～5×10-4mol/l。将该模拟酶与gox联合，实现了葡萄糖的比色检测，葡萄糖的检出限为1×10-5mol/l，线性范围为5×10-5mol/l～1×10-3mol/l，且该方法具有较高的准确度和精密度。该g-c3n4@hemin复合物模拟酶对葡萄糖检测有较好的选择性。
本发明具有的优点是：与昂贵的天然酶相比，该复合物模拟酶制备方便，经济可行，无需复杂仪器，且与底物具有较强的亲和性。对过氧化氢和葡萄糖的检测限较低，且线性范围较宽，所建立的方法可实现人血清中葡萄糖的准确快速测定。
附图说明
图1为g-c3n4@hemin复合物模拟酶制备流程图。
图2为实施例1g-c3n4@hemin复合物模拟酶对过氧化氢氧化tmb的催化活性图。
图3为实施例1g-c3n4@hemin复合物模拟酶对温度的选择图。
图4为实施例1g-c3n4@hemin复合物模拟酶对ph的选择图。
图5为实施例2g-c3n4@hemin模拟酶检测过氧化氢时得到的过氧化氢浓度-652nm处吸收值响应曲线图。
图6为实施例3用葡萄糖氧化酶和g-c3n4@hemin模拟酶检测葡萄糖时得到的葡萄糖浓度-652nm处吸收值响应曲线图。
图7为实施例3g-c3n4@hemin模拟酶结合gox检测葡萄糖时设计的干扰性实验图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作详细描述。
实施例1，一种g-c3n4@hemin复合物模拟酶的制备方法，包括以下步骤：
取三聚氰胺粉末3g放于磁舟中，置于马弗炉于氮气中550℃加热裂解4h后自然冷却至室温，得到淡黄色g-c3n4粉末；取g-c3n4粉末分散于去离子水中使其浓度为50mg/ml，超声分散16h，以11000rpm的转速离心5min以除去残留的未剥离的g-c3n4，将含有g-c3n4纳米片的上清液在60℃下烘干备用；
取已烘干的g-c3n4纳米片分散于去离子水中使其浓度为2mg/ml,取血红素分散于去离子水中使其浓度为1mg/ml，将两溶液按照体积之比1:1混合，本实施例各取10ml混合，于水浴中65℃恒温反应8h，自然冷却至室温后，得到混合溶液；将混合溶液在11000rpm下离心，采用无水乙醇和蒸馏水洗涤3次，所得沉积物于60℃下烘干，即得g-c3n4@hemin复合物，制备过程如附图1所示。
本实施例g-c3n4@hemin复合物过氧化物酶催化活性：
向5ml离心管中加入100μl浓度为2μmol/l的tmb溶液，加入不同浓度的过氧化氢水溶液，再加入100μl浓度为50μg/ml的g-c3n4@hemin复合物模拟酶分散液，最后向上述溶液中加入ph4.0、浓度为0.2mmol/l的hac-naac缓冲液至溶液总体积为3ml，于40℃水浴条件下恒温反应10min后滴加20μlh2so4终止反应，h2so4的体积浓度为20％，为了证明g-c3n4@hemin复合物具有模拟过氧化物酶的活性，而不是该材料自身与tmb反应，设计tmb与不同物质组成溶液，反应条件同上，结果如图2所示，图中的比色照片为反应10min拍摄而得，从左向右依次为a)tmb+h2o2；a)tmb+g-c3n4@hemin；c)tmb+h2o2+g-c3n4@hemin；结果显示a)、b)均无颜色，c)为蓝色，证明该材料具有模拟过氧化物酶的活性。
本实施例g-c3n4@hemin复合物模拟酶催化反应条件：
①反应温度：向5ml离心管中加入100μl浓度为2μmol/l的tmb溶液，加入100μl浓度为2μmol/l过氧化氢水溶液，再加入100μl浓度为50μg/mlg-c3n4@hemin复合物模拟酶分散液，最后向上述溶液中加入ph4.0、浓度为0.2mmol/lhac-naac缓冲液至溶液总体积为3ml，分别在20～60℃下恒温10min，滴加20μlh2so4终止反应，h2so4的体积浓度为20％，通过紫外-可见光谱检测，考察溶液在652nm波长下的吸光度，从而确定最适温度为40℃，结果见图3所示。
②反应ph：在5ml离心管中，向5ml离心管中加入100μl浓度为2μmol/l的tmb溶液，加入100μl浓度为2μmol/l的过氧化氢水溶液，再加入100μl浓度为50μg/ml的g-c3n4@hemin复合物模拟酶分散液，最后加入0.2mol·l-1、ph为2～8的缓冲溶液，使溶液总体积为3ml，40℃下恒温反应10min，滴加20μlh2so4终止反应，h2so4的体积浓度为20％，通过紫外-可见光谱检测，考察溶液在652nm波长下的吸光度，从而确定最适ph为4.0，结果见图4所示。
实施例2,一种g-c3n4@hemin复合物模拟酶的制备方法，包括以下步骤：
取三聚氰胺粉末3g放于磁舟中，置于马弗炉于氮气中550℃加热裂解5h后自然冷却至室温，得到淡黄色g-c3n4粉末；取g-c3n4粉末分散于去离子水中使其浓度为80mg/ml，超声分散16h，以11000rpm的转速离心5min以除去残留的未剥离的g-c3n4，将含有g-c3n4纳米片的上清液在60℃下烘干备用；
取已烘干的g-c3n4纳米片分散于去离子水中使其浓度为2mg/ml,取血红素分散于去离子水中使其浓度为3mg/ml，将两溶液按照体积之比1:1混合，于水浴中65℃恒温反应9h，自然冷却至室温后，得到混合溶液；将混合溶液在11000rpm下离心，采用无水乙醇和蒸馏水洗涤4次，所得沉积物于60℃下烘干，即得g-c3n4@hemin复合物模拟酶。
利用所述的g-c3n4@hemin复合物模拟酶比色检测过氧化氢，原理是：过氧化物酶是以过氧化氢为电子受体催化底物氧化的酶，利用过氧化氢氧化各种可以提供电子的底物，在过氧化氢存在下，能够催化辣根过氧化物酶的底物(tmb)反应，tmb的氧化中间态为蓝色，在652nm具有较大的吸收系数。
具体步骤为：配置一系列不同浓度为5μmol/l-500μmol/l的过氧化氢水溶液，向5ml离心管中加入100μl浓度为2μmol/ltmb溶液，加入100μl不同浓度的过氧化氢水溶液，再加入100μl浓度为50μg/ml的g-c3n4@hemin复合物模拟酶分散液，最后向上述溶液中加入ph4.0、浓度为0.2mmol/l的hac-naac缓冲液至溶液总体积为3ml，于40℃水浴条件下恒温反应10min后滴加20μlh2so4终止反应，h2so4的体积浓度为20％，通过紫外-可见光谱检测其在652nm处的吸光度，再根据吸光度对过氧化氢浓度作图，结果如图5所示。
米氏常数的测定：为了考察本实施例g-c3n4@hemin复合物模拟酶对两种底物tmb和h2o2的亲和能力以及催化速率，设计实验并对实验结果进行计算。在最适ph为4.0、最适温度值为40℃，分别测定不同浓度的h2o2和tmb条件下，通过紫外-可见光谱进行时间驱动扫描，以反应的前20s的扫描曲线的斜率为初速度，通过计算两种底物的反应初速度，根据如下公式，确定g-c3n4@hemin的米氏常数，结果见表1，表明该复合物模拟酶对底物的亲和能力强于hrp。
式中v为催化反应的初速度(mol·l-1·s-1)；vmax为最大反应速率(mol·l-1·s-1)；[s]为底物浓度(mol·l-1)；km为米氏常数(mol·l-1)，该值越小表明与底物的亲和能力越强。
表1
实施例3，一种g-c3n4@hemin复合物模拟酶的制备方法，包括以下步骤：
取三聚氰胺粉末3g放于磁舟中，置于马弗炉于氮气中550℃加热裂解6h后自然冷却至室温，得到淡黄色g-c3n4粉末；取g-c3n4粉末分散于去离子水中使其浓度为100mg/ml，超声分散16h，以11000rpm的转速离心5min以除去残留的未剥离的g-c3n4，将含有g-c3n4纳米片的上清液在60℃下烘干备用；
取已烘干的g-c3n4纳米片分散于去离子水中使其浓度为2mg/ml,取血红素分散于去离子水中使其浓度为5mg/ml，将两溶液按照体积之比1:1混合，于水浴中65℃恒温反应10h，自然冷却至室温后，得到混合溶液；混合溶液在11000rpm下离心，采用无水乙醇和蒸馏水洗涤5次，所得沉积物于60℃下烘干，即得g-c3n4@hemin复合物模拟酶。
所述的g-c3n4@hemin复合物模拟酶用于比色检测葡萄糖，原理是：葡萄糖氧化酶利用氧将葡萄糖转化为葡萄糖酸，同时释放出过氧化氢。g-c3n4@hemin作为模拟过氧化物酶，催化过氧化氢以及tmb反应，由于在葡萄糖分解过程中，分解的葡萄糖浓度与生成的过氧化氢浓度成正比，所以通过测过氧化氢浓度能够间接测得葡萄糖浓度。
具体步骤为：首先向5ml离心管中加入1ml的ph7.4、浓度为0.2mmol/l的磷酸盐缓冲溶液，再分别加入100μl不同浓度(10μmol/l-500μmol/l)的葡萄糖溶液，然后加入10μl浓度为5mg/ml的葡萄糖氧化酶，摇匀，在37℃水域条件下反应1h，得混合液，向离心管中加入100μl浓度为2μmol/l的tmb溶液，再加入100μl浓度为0.5mg/mlg-c3n4@hemin复合物模拟酶分散液，最后向上述溶液中加入ph4.0、浓度为0.2mmol/l的hac-naac缓冲液至溶液总体积为3ml，于40℃水浴条件下反应恒温10min后滴加20μlh2so4终止反应，h2so4的体积浓度为20％，通过紫外-可见光谱检测其在652nm处的吸光度，再根据吸光度对葡萄糖浓度作图，结果如附图6。
g-c3n4@hemin复合物模拟酶用于血清中葡萄糖的检测，包括以下步骤：
首先向5ml离心管中加入1ml的ph7.4、浓度为0.2mmol/l的磷酸盐缓冲溶液，再加入100μl稀释过的血清溶液，稀释过的血清溶液为血清用去离子水稀释十倍后的溶液，然后加入10μl浓度为5mg/ml的葡萄糖氧化酶，在37℃水浴条件下反应1h，得混合液；向离心管中加入100μl浓度为2μmol/l的tmb溶液，再加入100μl浓度为0.5mg/ml的g-c3n4@hemin复合物模拟酶分散液，最后向上述溶液中加入ph4.0、浓度为0.2mmol/l的hac-naac缓冲液至溶液总体积为3ml，于40℃水浴条件下反应恒温反应10min后滴加20μlh2so4终止反应，h2so4的体积浓度为20％，通过紫外-可见光谱检测其在652nm处的吸光度，将得到的吸光度值代入葡萄糖标准曲线中，确定血清中葡萄糖的含量；同时进行了加标回收率实验和干扰性实验，结果如表2、表3以及附图7所示，表2、表3表明该测定值与医院测定值比较接近，相对标准偏差均小于5％，回收率均介于95％-105％之间，表明该分析方法精密度好，准确度高。
表2
表3
图7为g-c3n4@hemin模拟酶结合gox检测葡萄糖时设计的干扰性实验，从左到右依次为：葡萄糖、半乳糖、果糖、蔗糖、酪氨酸、抗坏血酸、na+、k+、ca2+，其中葡萄糖浓度为0.1mmol/l,其他物质浓度均为1.0mmol/l，图7中可以看出该方法对葡萄糖的选择性很好。
以上所述的，是根据本发明的较佳实施例，并非用于限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化。即凡是根据本发明申请的权利要求书及说明书内容所做的简单等效变化与修饰，皆落入本发明的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的技术内容为本领域技术人员的公知常识。