从原料中分离与浓缩目标组分的多柱切换循环色谱分离系统及其方法与流程

本发明涉及色谱分离的技术领域，具体的涉及一种从原料中分离与浓缩目标组分的多柱切换循环色谱分离系统及其方法。

背景技术：

循环色谱能够在不增加柱压的前提下延长等效柱长，因而特别适于分离诸如对映异构体、同分异构体和天然同系物等难分离物系。但待分离组分的浓度谱带在分离过程中会不断展宽，导致弱保留组分的谱带前沿很容易追赶上强保留组分的谱带后沿而使分离失败。为避免这一不利影响，可降低进料量；或采用峰切割技术，在每个循环中将已经实现分离的弱保留组分谱带前沿和强保留组分谱带后沿切割出系统，仅使组分谱带的重叠部分在系统内循环。这些措施虽然避免了弱保留组分谱带前沿追及强保留组分谱带后沿，但并未从根本上解决谱带扩展，导致产品馏分浓度低，回收困难。

现有技术有采用双柱溶剂梯度循环色谱技术，即通过阀门切换，使两根色谱柱始终保持串联，在两柱中间引入一股修饰剂，可产生一种浓度谱带收缩机制，阻止谱带扩展。但这种双柱溶剂梯度循环色谱存在一个问题，即其固定相利用率不高。如图1所示，在分离过程的每一次切换周期内，目标组分的浓度谱带(图中阴影)总是从上游色谱柱迁移到下游色谱柱内，对目标组分谱带没有覆盖到的区域而言，其内部的固定相显然并未起到分离作用。所以在这种双柱溶剂梯度循环色谱系统中，两根色谱柱虽然都承担分离作用，但实际上大部分固定相并未被利用。例如，在最优操作条件下的每一次切换周期内，目标组分谱带尾部总是刚好离开上游色谱柱，而前沿则刚好达到下游色谱柱出口，从图1可知，其未被利用的固定相至少占到全部固定相的50％，也就是说固定相利用率最大为50％。

技术实现要素：

本发明针对现有技术的不足，提供一种能够提高固定相利用率的从原料中分离与浓缩目标组分的多柱切换循环色谱分离系统。

为了解决上述技术问题，本发明提供的技术解决方案是这样实现的：一种从原料中分离与浓缩目标组分的多柱切换循环色谱分离系统，该系统包括：n根色谱柱、且n为≥3的整数，阀门组件；所述的n根色谱柱通过阀门组件始终保持串联连接，所述的n根色谱柱的串联方式为每隔一定时间进行切换；具体的切换过程为：首先，洗脱剂从第1根色谱柱的入口流向第n根色谱柱的出口；一定时间后，系统切换成第2根、第3根、…、第n根和第1根色谱柱串联，洗脱剂沿着上述串联顺序从第2根色谱柱的入口流向第1根色谱柱出口；一定时间后，系统再次切换成第3根、第4根、…、第n根、第1根和第2根色谱柱串联，洗脱剂沿着上述串联顺序从第3根色谱柱的入口流向第2根色谱柱的出口；按此方式，系统切换(n-1)次后，串联方式为第n根、第1根、第2根、….、第n-1根色谱串联，洗脱剂沿着上述串联顺序从第n根色谱柱入口流向第n-1根色谱柱出口；系统切换n次后，串联方式为第1根、第2根、….、第n根色谱串联，洗脱剂从第1根色谱柱的入口流向第n根色谱柱的出口；该系统按照上述循环往复地切换，在运行过程中，修饰剂从位于洗脱剂入口下游的任意一根色谱柱的入口流入系统，且其中修饰剂的洗脱能力弱于洗脱剂的洗脱能力。

作为优选，为了使得洗脱剂的洗脱能力强于修饰剂的洗脱能力，可以加热洗脱剂并冷却修饰剂，以保证洗脱剂温度高于修饰剂的温度，从而实现洗脱剂的洗脱能力强于修饰剂的洗脱能力。

作为优选，为了使得洗脱剂的洗脱能力强于修饰剂的洗脱能力，也可以采用洗脱剂中具有强洗脱能力的溶剂的体积百分含量高于修饰剂中具有强洗脱能力的溶剂的体积百分含量的方法。

也可以同时采用加热洗脱剂并冷却修饰剂和洗脱剂中具有强洗脱能力的溶剂的体积百分含量高于修饰剂中具有强洗脱能力的溶剂的体积百分含量进行操作，实现洗脱剂的洗脱能力强于修饰剂的洗脱能力。

本发明还提供一种利用上述多柱切换循环色谱分离系统分离和浓缩目标组分的方法，具体步骤包括：

(1)进料：将待分离的原料溶于任一种可溶解原料的溶剂中，配制成原料液；多柱切换循环色谱分离系统的初始状态为第1根、第2根、…、第n根色谱柱依次串联，然后将原料液从任意一根色谱柱入口加入系统，使目标物被吸附在系统内；

(2)纯化：多柱切换循环色谱系统状态仍为第1根、第2根、…、第n根色谱柱依次串联，然后将洗脱剂从第1色谱柱入口流入系统，并将修饰剂从洗脱剂入口下游的任一色谱柱入口流入系统；一定时间后，系统切换，此时第2根、第3根、…、第n根和第1根色谱柱串联，洗脱剂从第2色谱柱入口流入系统，并将修饰剂从洗脱剂入口下游的任一色谱柱入口流入系统；一定时间后，系统再次切换，此时第3根、第4根、…、第n根、第1根、第2根色谱柱串联，洗脱剂从第3根色谱柱入口流入系统，并将修饰剂从洗脱剂入口下游的任一色谱柱入口流入系统；按此方式，系统切换(n-1)次后，第n根、第1根、第2根、….、第n-1根色谱串联，洗脱剂从第n根色谱柱的入口流向第n-1根色谱柱的出口，修饰剂则从位于洗脱剂入口下游的第1到第n-1色谱柱入口中的任一入口加入系统；系统切换n次后，第1、第2、….、第n色谱串联，洗脱剂从第1根色谱柱入口流向第n根色谱柱出口，修饰剂从位于洗脱剂入口下游的第2根到第n根色谱柱入口中的任一入口加入系统；按上述方式循环往复地切换系统，即循环往复地改变n根色谱柱的串联方式以及洗脱剂和修饰剂入口位置，最终获得纯化的目标产物。

优选的，本发明的系统，在进料过程中，洗脱泵和修饰泵均不运行，阀门组件亦不切换，将原料从第1色谱柱入口加入，当目标组分从第(n-1)根色谱柱流出时，停止进料，此时对应的进料量为最适宜的进料量。

本发明所述的系统切换，即洗脱剂入口和流出液出口位置发生变化，任意相邻两次切换的时间间隔取决于具体的分离物系和系统耐压能力，而且可以相等也可以不相等。

本发明所述的第1根、第2根、…、第n根色谱柱串联，或第2根、3根、…、第n根、第1根色谱柱串联，是从系统内流动的介质的流动方向来界定的：如：流体从第1根色谱柱经第2根、第3根、…流向第n根色谱柱，则为第1根到第n根色谱柱串联；流体从第2根色谱柱经第3根、第4根、…第n根色谱柱流向第1根色谱柱，则为第2根到第n根色谱柱和第1根色谱柱串联，其余串联状态依此类推。

本发明的技术原理是：在多柱切换循环色谱中，分离组分浓度谱带在多根柱子组成的一个闭环内循环中移动，在谱带迁移过程中，如果上游柱子内部流动相的洗脱能力比下游柱子内部流动相的洗脱能力更强，则能够使每一个分离组分的浓度谱带后沿的迁移速率比其浓度谱带前沿的迁移速率更快，这样就对浓度谱带产生一种收缩效应，以克服和抵消浓度谱带的扩展；此外，更为重要的是本发明的色谱柱涉及成三根及以上，可以很好地避免两根色谱柱存在的固定相利用率低的问题，本发明的固定相利用率通过合理地布局色谱柱的数量以及进料出料的位置和进料出料的成分等等，实现了利用率在50％以上的技术效果。

本发明即是基于这一认识，通过如下三种措施来使上游柱子内部流动相的洗脱能力强于下游柱子内部流动相的洗脱能力，同时使得色谱柱的利用率达到50％以上：

(1)洗脱剂中具有强洗脱能力的溶剂的体积百分含量高于修饰剂中具有强洗脱能力的溶剂的体积百分含量；

(2)洗脱剂的温度高于修饰剂的温度；

(3)同时满足洗脱剂中具有强洗脱能力的溶剂的体积百分含量高于修饰剂中具有强洗脱能力的溶剂的体积百分含量和洗脱剂的温度高于修饰剂的温度。

与已有的双柱溶剂梯度循环色谱相比，本发明技术方案的固定相利用率更高。如图2所示，以六柱切换循环色谱为例，在最优操作条件下的每一个切换周期内，目标组分谱带尾部总是从图中从左计数的第一根柱子移动到第二根柱子内，而谱带前沿则从第五根移动到最后一根柱子内，目标组分谱带始终覆盖5根柱长的固定相区域，而未被利用的固定相则始终位于第一根和最后一根柱子内部，占总固定相的1/6，即固定相利用率可高达5/6，远高于图1所示双柱系统的1/2利用率。显然，柱子数越多，则其固定相利用率越高。由于多柱系统的固定相利用率提高，其单位柱体积的处理能力也将随之提高。

本发明的上述方法还包括最后目标组分的回收步骤，根据对目标产物纯度的要求，具体可采用如下两种方法来实现：

在纯化过程中，监测系统流出液和原料液中的浓度，保证系统流出液中目标组分与非目标组分浓度之比(即目标组分浓度除以非目标组分浓度)低于原料液中目标组分与非目标组分浓度之比；随着纯化过程的进行，系统内部的目标组分与非目标组分含量之比(即目标组分浓度除以非目标组分浓度)会逐步提高，当系统内部的目标组分与非目标组分含量之比达到要求时，停止纯化操作，并洗脱第1根、第2根、…、第n-1根和第n根色谱柱以回收目标组分；

或

在纯化过程中，监测系统流出液中的目标组分和非目标组分的浓度和流出液的体积，保证流出液中的目标组分和非目标组分的质量小于在进料阶段加入到系统的目标组分和非目标组分的质量；故随着纯化过程的进行，系统内部的目标组分与非目标组分的浓度谱带在空间分布上的差异逐步增大；当目标组分与非目标组分浓度谱带的分离达到要求时，停止柱子切换操作；而洗脱剂继续流动，并从系统出口依次收集非目标组分和目标组分。

采用本发明上述第二种回收方法时，可在每根柱子出口处设置检测器来监测目标组分与非目标组分浓度谱带的分离，帮助定性判断是否达到分离要求，比如两个谱带基本分离开来，重叠部分不多。

本发明的优点和有益效果：本发明提供采用一种多柱切换循环色谱从原料中同步分离与浓缩目标组分的方法，能够在提高目标组分纯度的同时还能增加目标组分在产品溶液中的浓度，从而减轻从产品溶液中回收目标组分的负担。本发明提供的多柱切换循环色谱分离系统具有固定相利用率高，分离纯化成本低等优点。

附图说明

图1为在某一个切换内，目标组分谱带(阴影)在现有技术的双柱溶剂梯度循环色谱内的移动情况。

图2为在某一个切换内，目标组分谱带(阴影)在本发明实施例六柱溶剂梯度循环色谱内的移动情况。

图3为本发明多柱切换循环色谱分离系统的初始状态的第1-6根色谱柱依次串联的结构示意图。

图4为本发明多柱切换循环色谱分离系统的第一次切换后的第2-1根色谱柱依次串联的结构示意图。

图5为本发明多柱切换循环色谱分离系统的第二次切换后的第3-2根色谱柱依次串联的结构示意图。

图6为本发明多柱切换循环色谱分离系统的第三次切换后的第4-3根色谱柱依次串联的结构示意图。

图7为本发明多柱切换循环色谱分离系统的第四次切换后的第5-4根色谱柱依次串联的结构示意图。

图8为本发明多柱切换循环色谱分离系统的第五次切换后的第6-5根色谱柱依次串联的结构示意图。

图9为本发明多柱切换循环色谱分离系统的第六次切换后的第1-6根色谱柱依次串联的结构示意图。

图10为奥利司他原料的高效液相色谱图(分析体积2μl)。

图11为奥利司他原料的高效液相色谱图放大(在循环色谱中，峰4为目标物；峰1和3为前杂；峰2和5为后杂)。

图12为循环色谱流出液的高效液相色谱图循环色谱流出液的高效液相色谱图(分析体积100μl)。

图13为循环色谱馏分1的高效液相色谱图。

图14为循环色谱馏分2的高效液相色谱图。

图15为循环色谱馏分3的高效液相色谱图。

具体实施方式

下面通过实施例进一步详细描述本发明，但是本发明不仅仅局限于以下实施例。

下面以分离纯化奥利司他作为例子，详细说明本发明的技术方案。奥利司他原料购自河北海德生物科技有限公司。在碳十八烷基键合硅胶柱上，用乙醇/水(88/12,v/v)作流动相，在奥利司他主峰前后，还有若干前杂和后杂峰，其中各个杂质峰面积百分比均高于0.1％。采用本发明提出从原料中同步分离与浓缩目标组分的多柱切换循环色谱分离方法，从奥利司他原料中分离与浓缩主成分奥利司他，并使各杂质峰面积百分比低于0.1％。本发明所述的每隔一定时间，即洗脱剂进口和流出液出口位置切换时间，取决于具体的分离物系和系统耐压能力，而且可以相等也可以不相等。

本发明的阀门组件为行业常规的多项阀门，如三项阀门(三通阀)，六项阀门(六通阀)等等，结合管道与本发明的系统实现连接；可以根据实际的色谱柱系统的切换需求合理配备，该结构为本领域的技术人员根据需要即可实现的，并不需要付出创造性的劳动。

1.多柱切换循环色谱分离系统

本发明第一根至第n根的色谱柱指代的具体色谱柱均不发生变化，第一根始终是那一根，第n根也始终是那个n根，仅仅是他们串联方式发生变化(每一根指代的具体柱子不变化，只是位置(即串联方式)改变)。

本发明的多柱切换循环色谱分离系统，包括：n根色谱柱且n为≥3的整数，阀门组件；所述的n根色谱柱通过阀门组件始终保持串联连接，洗脱剂从第1根色谱柱的入口流向第n(最后一根)根色谱柱的出口，所述的n根色谱柱的串联方式为每隔一定时间进行切换；具体的切换过程为：首先，所述的洗脱剂从第1根色谱柱的入口流向第n根色谱柱的出口；一定时间后，系统切换成第2根、第3根、…、第n根和第1根色谱柱串联，洗脱剂沿着上述串联顺序从第2根色谱柱的入口流向第1根色谱柱出口；一定时间后，系统再次切换成第3根、第4根、…、第n根、第1根和第2根色谱柱串联，洗脱剂沿着上述串联顺序从第3根色谱柱的入口流向第2根色谱柱的出口；按此方式，系统切换(n-1)次后，串联方式为第n根、第1根、第2根、….、第n-1根色谱串联，洗脱剂沿着上述串联顺序从第n根色谱柱入口流向第n-1根色谱柱出口；切换n次柱子后，串联方式为第1根、第2根、….、第n根色谱串联，洗脱剂从第1根色谱柱的入口流向第n根色谱柱的出口；该系统按照上述循环往复地切换，在运行过程中，修饰剂从位于洗脱剂入口下游的任意一根柱子的入口流入系统，且其中修饰剂的洗脱能力弱于洗脱剂的洗脱能力。

进料：将待分离的原料溶于任一种可溶解原料的溶剂中，配制成原料液；多柱切换循环色谱分离系统的初始状态为第1根、第2根、第3根、…、第n根色谱柱串联，然后将原料液从任意一根色谱柱入口加入系统，使目标物被吸附在系统内；

本发明的系统，在进料过程中，可将原料液从任意一根色谱柱入口加入系统，最优的进料位置是从第1根色谱柱入口加入，使目标物被吸附在系统内。在进料时，洗脱泵和修饰泵均不运行，阀门组件亦不切换。

本系统中：原料液输送管道和洗脱剂(洗脱液)输送管道通过三通接头实现连接，且在原料液、洗脱剂和修饰剂的管道上设置柱塞泵(原料液管道上的可以称为原料泵，洗脱剂管道上的可以称为洗脱泵，修饰剂管道上的可以称为修饰泵)以为流体在系统内的循环流动提供动力。

本实施例的多柱切换循环色谱分离系统主要包括用于输送原料液、洗脱剂和修饰剂的3台柱塞泵、6根装填有c18硅胶的色谱柱(内径1cm，长10cm)；洗脱剂为乙醇/水(88/12,v/v)，修饰剂中水含量高于洗脱剂中水含量，故洗脱剂的洗脱能力比修饰剂的洗脱能力要强。将奥利司他原料溶于乙醇/水(86/14,v/v)配制成原料液，总浓度20mg/ml。

2.成品检验

高效液相色谱分析产品纯度。高效液相色谱系统组成：大连依利特1201泵，美国phenomenexknitexxb-18柱(4.6×150mm，5μm)，大连依利特1201检测器；液相色谱分析条件：流动相为乙腈/水(体积比90/10)，流速1.0ml/min，检测波长210nm，柱温30℃。

实施例1—用多柱切换循环色谱分离系统分离与浓缩奥利司他

奥利司他原料的高效液相色谱图(分析体积2μl)如图10所示，奥利司他原料的高效液相色谱图放大(在循环色谱中，峰4为目标物；峰1和3为前杂；峰2和5为后杂)如图11所示。

分离系统的六根色谱柱的初始串联顺序如附图3所示，依次为第1根色谱柱、第2根色谱柱、第3根色谱柱……、第6根色谱柱串联；首先为初始进料状态：第1根、第2根、…、第6根色谱柱串联，在室温下将原料液从第1根色谱柱入口加入系统，当加入原料液体积为340ml时，分离组分刚好从第5色谱柱出口流出，停止进料，此时的状态如附图2中进料状态所示，其中的色谱柱内的阴影即代表原料液的分布情况；然后，同时启动洗脱泵和修饰泵，分别将洗脱剂和修饰剂(水)以4ml/min和0.2ml/min的流量从第1根色谱柱入口和第3根色谱柱入口加入系统(如附图2中的初始时刻和附图3的状态所示)。10min后，系统第1次切换，此时如附图4所示，串联方式为：第2根、第3根、…、第6根色谱柱与第1根色谱柱依次串联，洗脱剂和修饰剂分别从第2根色谱柱和第4根色谱柱入口以4ml/min和0.2ml/min的流量流入系统；10min后，系统第2次切换，此时如图5所示，串联方式为：第3根、第4根、第5根、第6根、第1根、第2根色谱柱依次串联，洗脱剂和修饰剂分别从第3根色谱柱和第5根色谱柱入口以4ml/min和0.2ml/min的流量流入系统；10min后，系统第3次切换，此时如图6所示，串联方式为：第4根、第5根、第6根、第1根、第2根、第3根色谱柱依次串联，洗脱剂和修饰剂分别从第4根色谱柱和第6根色谱柱入口以4ml/min和0.2ml/min的流量流入系统；10min后，系统第4次切换，此时如图7所示，第5根、第6根、第1根、第2根、第3根、第4根色谱柱依次串联，洗脱剂和修饰剂分别从第5根色谱柱和第1根色谱柱入口以4ml/min和0.2ml/min的流量流入系统；10min后，系统第5次切换，此时如图8所示，第6根、第1根、第2根、第3根、第4根、第5根色谱柱依次串联，洗脱剂和修饰剂分别从第6根色谱柱和第2根色谱柱入口以4ml/min和0.2ml/min的流量流入系统；10min后，系统第6次切换，此时如图9所示，系统回复到初始状态，第1根、第2根、…、第6根色谱柱依次串联，洗脱剂和修饰剂分别从第1根色谱柱和第3根色谱柱入口以4ml/min和0.2ml/min的流量流入系统。

如此循环往复，每10min切换一次，共切换13次。分离纯化过程中，系统流出液中含杂质以及微量奥利司他(具体如附图12所示，即为循环色谱流出液的高效液相色谱图(分析体积100μl))。运行130min后，系统停止切换，此时对应的是第2根、第3根、…、第6根色谱柱与第1根色谱柱依次串联。然后关闭修饰泵，单独开启洗脱泵，以5ml/min流量洗脱系统，从系统出口分段收集三个馏分：馏分1主要含前杂和少量奥利司他(具体如附图13所示，即为馏分1的高效液相色谱图)；馏分2含奥利司他，不含前杂和后杂(具体如附图14所示，即为馏分2的高效液相色谱图)；馏分3中主要含后杂和少量奥利司他(具体如附图15所示，即为馏分3的高效液相色谱图)。馏分2即为合格产品，收率95％。

对比例：

如图1所示的双柱切换循环色谱，该系统由两根1cm内径，10cm柱长的色谱柱构成，奥利司他浓度和本发明实施例1相同，但进样量60ml，单位柱体积的进料体积3.82ml，收率92％。本发明给出的多柱切换循环色谱(以六柱为例)，进样量340ml，单位柱体积的进料体积为7.22ml。综上比较，正是因为本发明提高了固定相利用率，从而使得单位柱体积的处理量增加。

实施例2—用多柱切换循环色谱分离系统分离与浓缩奥利司他

分离系统的六根色谱柱的初始串联顺序如附图3所示，依次为第1根色谱柱、第2根色谱柱、第3根色谱柱……、第6根色谱柱串联；首先为初始进料状态：第1根、第2根、…、第6根色谱柱依次串联，在室温下将原料液从第1根色谱柱入口加入系统，当加入原料液体积为410ml时，分离组分刚好从第6色谱柱出口流出，停止进料；然后，同时启动洗脱泵和修饰泵，分别将洗脱剂和修饰剂(乙醇/水＝20/80(v/v))以4ml/min和1.0ml/min的流量从第1根色谱柱入口和第2根色谱柱入口加入系统。输送洗脱剂和修饰剂时，预先将洗脱剂加热到45℃，而修饰剂则冷却至5℃。10min后，系统第1次切换，此时如附图4所示：第2根、第3根、…、第6根色谱柱与第1根色谱柱依次串联，洗脱剂和修饰剂分别从第2根色谱柱和第4根色谱柱入口以4ml/min和0.2ml/min的流量流入系统；10min后，系统第2次切换，此时如图5所示，第3根、第4根、第5根、第6根、第1根、第2根色谱柱依次串联，洗脱剂和修饰剂分别从第3根色谱柱和第5根色谱柱入口以4ml/min和0.2ml/min的流量流入系统；10min后，系统第3次切换，此时如图6所示，第4根、第5根、第6根、第1根、第2根、第3根色谱柱依次串联，洗脱剂和修饰剂分别从第4根色谱柱和第6根色谱柱入口以4ml/min和0.2ml/min的流量流入系统；10min后，系统第4次切换，此时如图7所示，第5根、第6根、第1根、第2根、第3根、第4根色谱柱依次串联，洗脱剂和修饰剂分别从第5根色谱柱和第1根色谱柱入口以4ml/min和0.2ml/min的流量流入系统；10min后，系统第5次切换，此时如图8所示，第6根、第1根、第2根、第3根、第4根、第5根色谱柱依次串联，洗脱剂和修饰剂分别从第6根色谱柱和第2根色谱柱入口以4ml/min和0.2ml/min的流量流入系统；10min后，系统第6次切换，此时如图9所示，系统回复到初始状态，第1根、第2根、…、第6根色谱柱依次串联，洗脱剂和修饰剂分别从第1根色谱柱和第3根色谱柱入口以4ml/min和0.2ml/min的流量流入系统。

如此循环往复，每10min切换一次，共切换11次。因上样过载，分离纯化过程中，系统流出液中除杂质外还含一定量的奥利司他。运行12次切换后，系统停止切换，此时第1根、第2根、第3根、…、第6根色谱柱依次串联。然后关闭修饰泵，单独开启洗脱泵，以5ml/min流量洗脱系统，从系统出口分段收集三个馏分：馏分1主要含前杂和少量奥利司他；馏分2含奥利司他，不含前杂和后杂，奥利司他收率85％；馏分3中主要含后杂和浓度很稀的奥利司他。

通过上述本系统的实施例，可以得出本发明的分离系统能够在提高目标组分纯度的同时还能增加目标组分在产品溶液中的浓度，从而减轻从产品溶液中回收目标组分的负担。本发明提供的双柱切换循环色谱分离系统，结构简单，操作方便，分离纯化后处理简单，降低了分离、纯化成本。

以上实施例是对本发明的说明和进一步解释，而不是对本发明的限制，在本发明的精神和权利保护范围内所做的任何修改，都落入本发明的保护范围。