一种蛋白质抗原决定基分子印迹材料及其制备和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于高分子材料制备技术及其在蛋白质识别中的应用，具体的说是一种新型的蛋白质抗原决定基分子印迹材料及其制备和应用。
【背景技术】
[0002]分子印迹技术是采用人工合成方法制备对目标分子进行特异性识别材料的技术。有关的最早报道是Klaus Mosbach等1993年在《Nature》上发表的有关利用非共价键合成茶碱分子印迹聚合物的报道，此后分子印迹材料作为一种人工合成高选择性材料迅速进入全球众多科学家的视野。目前，针对有机小分子和金属离子的印迹工作已取得了巨大的进展，实验方法和评价标准渐趋成熟，并已开始应用于临床分析、催化合成等领域(Chen LX, Chemical Society Reviews, 40，2011，2922-2942)。在这些方面，分子印迹材料和天然分子识别系统相比，不仅具有高效选择性，并且对各种物理和化学影响因素具有很高的耐受力，而且还可以重复使用，弥补了天然识别体系在使用过程中的诸多不足。与此同时，当小分子印迹的研究逐渐成熟的时候，分子印迹的研究开始转向生物大分子(尤其是蛋白质)印迹。这向其最初创立时的梦想，“人工合成抗体”，又迈进了一步。目前文献报道的蛋白质印迹聚合物制备方法主要包括3D分子印迹法(包埋法)、2D分子印迹法(表面印迹法)、金属螯合印迹方法、Langmuir单层膜印迹法、表面微接触印迹方法等(Yang KGet.al., Analytical and B1analytical Chemistry, 403，2012，2173-83.)。这些印迹方法中常常以完整蛋白质为模板分子，但是由于完整蛋白质模板分子难以获得、价格昂贵，因此限制了蛋白质印迹材料的使用(SelIergren, B.Nature Chemisty, 2，2010，7)。
[0003]抗原决定基印迹是以目标蛋白上一段特异性多肽为模板分子进行印迹，由于模板肽段与目标蛋白间极强的特异性，形成的印迹位点对模板肽段及目标蛋白均具有特异性识别能力(Shea, KJ.Angwandte Chemie, 45, 2006, 2392-2396)。这种方法解决了蛋白质分子印迹中蛋白质难获得、价格昂贵的问题；同时，多肽模板构象稳定，增加了印迹位点识别的特异性。由于利用自由肽段为模板时模板利用率极低，因此需对模板进行固载；而此前报道的模板固定化方法具有模板难去除的不足，这限制了抗原决定基印迹方法的应用。
[0004]因此，我们以末端修饰了组氨酸标签的抗原决定基肽段为模板，通过组氨酸标签与金属离子间的螯合作用对模板进行固定，聚合完成后，利用EDTA-Na的竞争性螯合作用对模板进行洗脱，制备得到可对目标蛋白进行选择性识别的抗原决定基分子印迹材料。
【发明内容】
[0005]采用末端修饰了组氨酸标签的目标蛋白抗原决定基肽段为模板分子，利用金属螯合作用将模板分子固载于表面固定了金属离子Ni2+的基质材料表面，通过功能单体的聚合形成分子印迹层，去除模板形成抗原决定基印迹材料；并且将该分子印迹材料用于标准目标蛋白的识别中。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为:
[0006](I)在基质材料表面通过化学修饰引入亚氨基二乙酸(IDA)基团，利用IDA基团与Ni2+的螯合作用，将Ni2+固载在基质材料表面。
[0007](2)利用固相合成多肽法制备末端修饰组氨酸标签的模板分子。
[0008](3)在室温条件下，在上述基质材料中按质量比1:1000-100:1000(模板:基质材料)加入模板肽段溶液，室温下孵育(2分钟-5小时)，使模板固载于基质材料表面，其中基质材料的质量浓度为0.2mg/ml-500mg/mlo
[0009](4)随后以一定的质量比在上述固载了模板的基质材料中加入功能单体，预组装一定时间(2分钟-5小时)后，加入引发剂，搅拌情况下聚合；其中自由基类单体如甲基丙烯酸(MAA)、N, N’-亚甲基双丙烯酰胺(MBA)、甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)等对应引发剂偶氮二异丁(AIBN)、过硫酸铵、过氧化二苯甲酰等；多巴胺、苯胺、硅烷等单体对应酸性或碱性物质作为引发剂。
[0010](5)聚合完成后，反复用20mM-lM的EDTA-Na水溶液清洗聚合物材料，使其中的模板分子洗脱出来，直至洗脱液中检测不出模板分子，进而得到抗原决定基分子印迹材料(MIP)。
[0011](6)在基质材料上不固载模板分子，通过上述相同的步骤制备得到非印迹微球(NIP)。
[0012](7)将该分子印迹材料用于目标蛋白的选择性识别中。
[0013]本发明具有如下优点:
[0014](I)本发明利用末端修饰了组氨酸标签的抗原决定基肽段为模板，通过金属螯合作用将模板肽段固定于表面修饰了 Ni2+的基质材料表面(Zhang LH, et.al., Chemical Communi cat 1n, 47，2011，3969-3971)。这种方法简单，高效，同时保证了所有肽段的固载效率一致，不同肽段同时固载时无歧视，是一种通用的模板固载方法。
[0015](2)本发明采用人工合成肽段为模板，而不是蛋白质分子，解决了蛋白质分子印迹中蛋白质难获得、价格昂贵的问题；同时，多肽模板构象稳定，增加了印迹位点识别的特异性。
[0016](3)本发明可采用多种不同的功能单体进行聚合形成印迹位点。多种功能单体的利用可极大程度的提供多种丰富的相互作用，保证形成的印迹位点对目标肽段及目标蛋白的特异性识别。
[0017](4)本发明采用EDTA-Na溶液对模板进行洗脱，此方法不涉及强酸、强碱、强氧化还原条件的使用，条件温和，不会破坏印迹位点，可进一步提高印迹位点的识别的特异性。
[0018](5)本发明基质材料制备过程、模板固载过程、聚合过程及模板去除过程均具有通用性，极大程度的保证了此方法在不同目标蛋白质抗原决定基印迹材料制备中的通用性及普适性。
【附图说明】
[0019]图1.人血清白蛋白抗原决定基印迹材料(MIP)及非印迹材料(NIP)的透射电镜图；
[0020]图2 (a).人血清白蛋白抗原决定基印迹材料(MIP)及非印迹材料(NIP)对人血清白蛋白抗原决定基的吸附容量图；
[0021]图2 (b).人血清白蛋白抗原决定基印迹材料(MIP)及非印迹材料(NIP)对人血清白蛋白的吸附容量图；
[0022]图3.人血清白蛋白抗原决定基印迹材料(MIP)及非印迹材料(NIP)对人血清白蛋白(HSA)、牛血清白蛋白(BSA)、细胞色素c (Cyc)的选择性识别，纵坐标为印迹因子；
[0023]图4.MIP2、NIP2对人血清白蛋白抗原决定基的吸附容量图；
[0024]图5.MIP3、NIP3对人血清白蛋白抗原决定基的吸附容量图；
[0025]图6.MIP4、NIP4对人血清白蛋白的吸附容量图；
[0026]图7.MIP5、NIP5对人血清白蛋白的吸附容量图。
[0027]实施例1
[0028](I)人血清白蛋白抗原决定基印迹微球材料的制备
[0029]采用溶剂热法制备包被有娃层的磁性纳米粒子作为基质材料。取基质材料50mg,加入Iml0.5mg/ml人血清白蛋白模板肽段(AASQAALGLHHHHHH)(吉尔生化上海有限公司)溶液，于25°C下孵育使模板固定于基质表面(模板与基质材料的质量比为10:1000)。冲洗未固定的模板肽段后，重悬基质于25ml水中，加入15mg多巴胺(单体与基质材料质量比为0.3:1), 30°C机械搅拌下预组装30min,加入0.5mllM tris-HCl缓冲液(pH8.0),机械搅拌下自聚合5h，磁铁辅