一种纳米复合材料结合质谱鉴定磷酸化肽段的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于先进纳米材料与纳米技术领域，具体涉及一种纳米复合材料结合质谱 鉴定磷酸化肽段的方法，特别是涉及一种石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介 孔二氧化硅的纳米复合材料结合MALDI-TOF MS用于磷酸化肽富集与检测的方法。 技术背景
[0002] 蛋白质或多肽的磷酸化是生命过程中最为普遍的翻译后修饰之一。它与细胞分 裂、增殖、分化、迀移和细胞间信号传递等许多重要的复杂生物过程息息相关。内源性的磷 酸化肽段指的是生物样品中天然含有的那些经过磷酸化修饰的肽段。一些研究表明，内源 性的磷酸化肽段的表达水平与很多疾病关系密切，尤其是癌症等人类重大疾病。所以对内 源性磷酸化肽的研究对疾病的早期诊断有着重要的意义。质谱分析是目前多肽组学所采用 的主要分析手段。但内源性磷酸化肽的丰度往往非常低，并且内源性磷酸化肽段的质谱响 应会受到非磷酸化肽和蛋白质的压制，样品中的盐分和表面活性剂同样也会对其质谱行为 产生干扰，使得内源性磷酸化肽的电离效率非常低，质谱检测相对较为困难。因此在使用质 谱方法分析复杂生物样品中的内源性磷酸化肽段之前，对样品中的内源性磷酸化肽段进行 选择性富集是十分必要的。
[0003] 随着近年来研究的不断深入，许多方法都被用来选择性分离富集磷酸化蛋白和多 肽，比如免疫沉淀法、固相萃取法、超滤法、强阳离子交换色谱法、固定金属离子亲和层析法 (MAC)、金属氧化物亲和层析法(MOAC)等等。其中MOAC方法应用最为广泛，效果也较好。通 过金属氧化物中金属中心与磷酸化多肽上的磷酸基团间发生配位相互作用，从而起到富集 磷酸化多肽的效果。传统的MOAC方法操作简便、快速、成本低廉，并且相比于IMAC方法，选择 性好、非磷酸化肽段干扰少。因此，许多MOAC材料被制备出来，广泛应用于磷酸化肽段的富 集中。但是传统MOAC方法由于在富集前需要先对生物样品进行酶解，将所有蛋白质酶切为 肽段后再进行富集和质谱分析。这个步骤不但会影响内源性磷酸化肽和非内源性磷酸化肽 段的磷酸化水平，更会极大的增加数据分析的难度，使后续的数据处理步骤变得繁琐而困 难。
[0004] 介孔材料由于有着狭窄而有序的孔道、非常高的比表面积、连续可调的孔径等优 点而被人们广泛关注，近年来发展迅速。由于介孔材料具有狭窄且十分有序的孔道，可以使 体积较小的肽段钻入孔道，而将体积较大的蛋白质阻挡在材料外部，来实现对肽段的富集。 这可以避免酶切步骤，从而大大降低了因为样品前处理步骤所引入的对样品复杂程度的影 响。本发明首次合成了结合传统MOAC材料和介孔材料优点的纳米复合材料，并应用于内源 性磷酸化肽段的分离富集。由于介孔二氧化硅良好的体积排阻效应和石墨烯高的表面积以 及二氧化钛与磷酸基团间的亲和作用，使得该纳米复合材料可以对复杂生物样品中的内源 性磷酸化肽段进行选择性富集，大大提高了磷酸化肽段的质谱信号。对磷酸化肽段的检测 限可达5 amol/yL，对非磷酸化肽段的选择性达1:1000(质量比），与磷酸化蛋白和非磷酸化 蛋白的体积排阻效应达1:500:500 (质量比）。
[0005] 本发明所涉及的具有介孔结构的石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及 介孔二氧化硅的纳米复合材料，合成方法简单快速，二氧化钛微球对磷酸化肽具有高灵敏 度和高选择性，石墨烯提高了有效表面，介孔二氧化硅层赋予了材料较好的体积排阻效应。 此纳米复合材料可用于选择性地富集生物样品中的低丰度的磷酸化肽和内源性磷酸化肽， 并用于MALDI-TOF MS检测。
【发明内容】
[0006] 本发明目的在于提供一种纳米复合材料结合质谱鉴定磷酸化肽段的方法。
[0007] 本发明提出的一种纳米复合材料结合质谱鉴定磷酸化肽段的方法，具体步骤为： 将纳米复合材料配置成为10mg/mL的分散液，溶剂为超纯水，将该分散液与磷酸化肽段溶液 加入到由体积比为50%乙腈和0.1%三氟乙酸缓冲液组成的混合液中混合，在酶解仪中孵育 30分钟;通过离心分离纳米复合材料，用体积比50%乙腈和0.1%三氟乙酸缓冲液组成的混合 液洗涤，随后用0.4M氨水洗脱;取IyL洗脱液直接在MALDI-TOF MS进样靶板上点靶，干燥后 再点加 IyL浓度为20mg/mL的2,5_二羟基苯甲酸溶液于该液滴上，形成基质结晶，进行质谱 分析； 其中，所述的纳米复合材料为石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧 化娃的纳米复合材料。
[0008] 本发明中，纳米复合材料的具体制备步骤如下： (1) 用浓硝酸对石墨烯进行酸化，在60°C条件下反应7小时得到酸化石墨烯，随后用去 离子水充分洗涤酸化石墨烯，到洗液呈中性为止，在40_60°C下真空干燥； (2) 配置三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液，溶剂为体积比为1:2的去离子水和乙醇，将 步骤（1)所得的酸性石墨烯分散于缓冲液中，超声数分钟，加入多巴胺盐酸盐，在室温下机 械搅拌反应6-20小时，制得聚多巴胺包覆的石墨烯;离心分离产物，用去离子水和无水乙醇 充分洗涤，在40-60°C下真空干燥； (3) 在异丙醇中分散步骤(2)所得产物，超声20分钟，充分分散;加入二乙胺和异丙醇 钛，搅拌均匀，反应温度为180-220°C，反应时间为17-24小时，反应结束后，离心分离产物， 用蒸馏水和无水乙醇充分洗涤所得产物，在40-60°C下真空干燥，得到二氧化钛修饰的聚多 巴胺包覆的石墨烯； (4) 将步骤(3)所得产物在400°C下煅烧2小时，随后将煅烧产物分散在十六烷基三甲基 溴化铵(CTAB )去离子水溶液中，超声数分钟后，加入氢氧化钠去离子水溶液和去离子水，超 声数分钟，于60°C水浴条件下，加入正硅酸乙酯(TEOS)与乙醇混合液，在60°C水浴条件下机 械搅拌反应12小时； (5) 步骤(4)所得产物离心分离后用蒸馏水和无水乙醇充分洗涤，随后用丙酮回流24小 时两次； (6) 步骤(5)所得产物离心分离后，用蒸馏水和无水乙醇充分洗涤，在40-60°C下真空干 燥。
[0009] 本发明中，步骤（1)中石墨稀和浓硝酸的比为（l_3)g: (30-70)ml，更进一步，步骤 (1)中石墨烯和浓硝酸的比为2g: 50ml。
[0010]本发明中，步骤(2)中三羟甲基氨基甲烷缓冲液的pH值为8.5。
[0011] 本发明中，步骤(2)中石墨烯和多巴胺盐酸盐的质量比为1:4。
[0012] 本发明中，步骤(3)中聚多巴胺包覆的石墨烯和异丙醇的比为(40-60)mg: (35-55) ml，二乙胺和异丙醇钛的体积比为(0.02-0.04) :(1.5-2)，更进一步，步骤(3)中聚多巴胺包 覆的石墨稀和异丙醇的比为50mg:40ml，二乙胺和异丙醇钛的体积比为0.03:1.8。
[0013] 本发明中，步骤(3)中反应温度为200°C，反应时间为24小时。
[0014]本发明中，步骤(4)中二氧化钛修饰的聚多巴胺包覆的石墨烯与十六烷基三甲基 溴化铵的质量比为1:10,乙醇与正硅酸乙酯的体积比为4:1。
[0015] 本发明的有益效果在于:所提供的石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及 介孔二氧化硅的纳米复合材料合成方法简单，比表面积较大，具有良好的体积排阻效应，可 祛除大体积蛋白并使小分子肽段进入孔道，孔道底部的二氧化钛可同磷