专利名称：并行检测多个生物学信号的表面等离子体共振生物传感器的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基于表面等离子体共振原理的、可以并行检测多个生物学信号的生物传感器。
其中，光学方法由于其具有非破坏性和高灵敏度的特点被视为是最成熟和最好的生物传感技术。自1902年，Wood在光学实验中首次发现了表面等离子体共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)现象以来，SPR仪器和SPR生物传感器的研究一直受到关注。
表面等离子体共振SPR是一种物理光学现象。形成SPR现象的必要条件之一是金属和电介质间的界面存在。当入射光以某一特定的角度入射时，其反射率会显著减少，此入射角度即为SPR角。附着在金属表面的物质不同，其SPR角不同，而同一种物质，附着在金属表面的量不同，其SPR角也不相同。根据上述原理，SPR生物传感器可以将已知的生物分子固定在几十纳米厚的金属膜表面，当它与互补的目标生物分子结合时，由于表面结构的改变将导致SPR角改变，并且根据SPR角的改变值，可以得知结合的目标生物分子的种类及浓度。目前，SPR传感器已用于生物分析领域。
世界上已有一些基于SPR原理的生物传感器产品，以瑞典的Biacore AB的Biacore系列生物传感器为例，它的制备方法是将100nm厚的金膜固定在玻璃基质上，将此玻璃片嵌在一个塑料平板夹里，用一种折射率与棱镜匹配的聚合物将芯片耦合到玻璃棱镜上。在芯片表面固定一层葡聚糖分子层，使它较容易与其它生物大分子偶联.它以发光二极管为光源，用线性阵列发光二极管作为检测器，检测不同入射角处的反射光强度.但这只完成了单点SPR的检测，一次只能对一种物质进行检测，这在一定程度限制了它的应用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是在现有SPR技术基础上提供一种可以进行多点并行检测的SPR生物传感器。
本发明SPR生物传感器依次由基质、金属膜、化学修饰物层、交联剂层和生物单分子层构成，此生物单分子层在不同位置含有不同的生物分子。
本发明的基质可以是连续基质，也可为不连续的基质，材料可选用玻璃、硅片或其他硬质固体材料。在基质的外部镀上厚度为20-90nm的金属膜，金属膜优选Au膜或Ag膜。在金属膜表面涂有化学修饰物层以产生一层多聚阴离子表面，此化学修饰物可以是11-巯基烷二酸(MUA)、氨基硫酚、氨基硫醇、巯基乙二胺、十六烷巯基醇或其他含硫试剂。在化学修饰物的表面联有交联剂，交联剂可选用EDAC(1-Ethyl-3(3-Dimethylamino-propyl)carbodiimide)、戊二醛等，在交联剂层上按一定顺序点有多种生物分子，如抗原、抗体，激素、受体，生物素、抗生物素蛋白，底物、酶或辅酶，核酸分子等，形成生物单分子层。
上述生物传感器与SPR检测仪配套使用，可实现对生物样品中多个生物学信号并行检测。
本发明所要解决的另一个技术问题是提供上述生物传感器的制备方法。
本发明生物传感器是通过下述技术方案获得的1.在基质的表面镀上金膜，使金属膜的厚度为20-90nm；2.此基质依次在浓硫酸∶过氧化氢＝1.5-4∶1的溶液、丙酮溶液或酒精溶液、二次水溶液中超声清洗，干燥；3.此基质浸于含有巯基的化学修饰物溶液中组装3-24小时；4.依次在酒精溶液和二次水溶液中清洗，干燥；5.在交联剂中，组装3-24小时；6.用加样器将多种生物分子按一定顺序定量点制在经过上述步骤处理过的基质表面的不同位置；点与点之间的距离大于lmm，各生物分子的浓度从0.05mg/ml2-0.0mg/ml不等。
7.浸于0.01-0.5％(w/v)BSA封闭液中封闭过夜，2-8℃保存。
本发明的再一目的是提供上述生物传感器在多个生物学信号并行检测中的应用。
本发明生物传感器可用于并行检测待测样品中的多种抗原、抗体、激素、受体、生物素、抗生物素蛋白、底物、酶或辅酶和核酸分子等。
检测时，可用激光光源发出的单束激光对传感器进行扫描，也可用空间滤波器(Spatial Filter)对单束激光进行扩束，使其可以同时照射传感器的整个表面。当待测溶液接触SPR生物传感器时，其生物单分子层的各生物分子与待测样品溶液中的目标分子特异性结合，形成复合物，使生物单分子层的表面结构发生变化。这一变化可导致该单分子层上各生物分子处的SPR现象的改变，通过SPR检测仪可检测SPR角的变化。
本发明所述SPR生物传感器通过下述方式实现多个生物学信号并行检测1)用完全相同的上述SPR生物传感器分别检测几份含有多种可与生物传感器上的生物分子特异性结合的目标分子，且各目标分子浓度已知并依次递增的样品，通过SPR检测仪记录不同时刻t、生物传感器上各生物分子处的SPR角ω的变化，根据ω与t的关系作动力学曲线。
2)由动力学曲线可以得到反应达到平衡后，生物传感器上各生物分子的SPR平衡角ω0值，作此角度值与该点对应的目标分子浓度C的相关曲线，即得到对应于各目标分子的ω0/C曲线(称为标准曲线)，上述标准曲线置于检测仪数据库中备用。
3)当检测未知浓度的溶液时，同1)仍根据生物传感器上各点的SPR角ω与时间t的关系作动力学曲线。
4)同2)，由动力学曲线找出各SPR平衡角ω0值，将ω0值与对应的目标分子的标准曲线对照，可得出该目标分子的浓度。从而达到对多种目标分子进行定量检测的目的。
目前的单点SPR检测主要应用在研究领域，本发明的多点SPR检测，它的意义在于临床上的应用。如目前对于肿瘤的早期检测，大多采用生化检测，但是，单指标(单一的肿瘤标志物)的检测并不足以帮助医生作出正确的判断，因为单指标检测的假阳性和假阴性都相当高，因此对多个肿瘤标志物进行并行检测，可以大大提高诊断的准确度。
本发明所述并行检测多个生物学信号的表面等离子体共振生物传感器，使用方便，检测灵敏，有助于准确检测各种疾病，具有广泛的临床应用价值。
图2 传感器上生物分子点样示意3 ω/t动力学曲线示意4 标准曲线示意5 A1、A2、B1、B2分别表示实施例1点样点，5.1、5.2、5.3、5.4是对应于点A1、A2、B1、B2的反射率I/入射角A的曲线图6 6.1、6.2、6.3、6.4分别是图5中A1、A2、B1、B2点对应的ω/t动力学曲线图7 7.1、7.2、7.3、7.4分别是实施例1AFP、CEA、PSA、Ferritin的ω0/C标准曲线上述单抗均来源于美国Biodesign公司5)血清样品来源于上海市第六人民医院。制备方法1)将镀有Au膜的玻璃片在浓硫酸∶过氧化氢＝7∶3的溶液、酒精溶液、二次水溶液中各超声清洗5分钟，室温吹干；2)将上述玻片浸于11-巯基烷二酸(MUA)中室温组装24小时；3)依次在酒精溶液和二次水溶液中各清洗5分钟，室温吹干；4)浸于交联剂0.1％EDAC溶液中，室温组装24小时5)用微量加样器将0.6mg/ml的抗AFP单抗、1.0mg/ml的抗CEA单抗0.5mg/ml的抗PSA单抗、0.5mg/ml的抗free-PSA单抗如图5所示定量点制在上述基质表面的不同位置；点与点之间的距离为2.5mm，点样量为1ul。
如图5，点A1抗AFP单抗，点A2抗CEA单抗，点B1抗PSA单抗，点B2抗Ferritin单抗6)、浸于0.1％(W/V)BSA封闭液中封闭过夜。
用上述生物传感器来检测血清。将上述生物传感器置于光学耦合器件如
图1(3)上，使待测血清接触其表面，光电检测器(4)可记录生物传感器上各单抗处的SPR现象的变化，如图5中5.1，5.2，5.3，5.4所示，经过计算机处理可得出各点的ω/t动力学曲线，各点的动力学曲线如图6所示。从图6.1至6.4，可分别以得出抗AFP、CEA、PSA、Ferritin的SPR平衡角ω0，将平衡角ω0与各目标分子的标准曲线对应，如图7，从图7.1至7.4，可得出此血清中AFP、CEA、PSA、Ferritin的浓度CEA浓度为24ng/ml；AFP浓度为17ng/ml；PSA浓度为3ng/ml；Ferritin浓度为205ng/ml。
权利要求
1.并行检测多个生物学信号的SPR生物传感器，该生物传感器依次由基质，金属膜，化学修饰物层，交联剂层和生物单分子层构成，其特征在于此生物单分子层的不同位置含有不同的生物分子
2.如权利要求1所述的并行检测多个生物学信号的SPR生物传感器，其特征在于其中所述的生物单分子层点有抗原、抗体，激素、受体，生物素、抗生物素蛋白，底物、酶或辅酶和核酸分子。
3.如权利要求1所述的并行检测多个生物学信号的SPR生物传感器，其特征在于其中所述的基质选用玻璃、硅片或其他硬质固体材料。
4.如权利要求l所述的并行检测多个生物学信号的SPR生物传感器，其特征在于其中所述的基质为连续或不连续的基质。
5.如权利要求1所述的并行检测多个生物学信号的SPR生物传感器，其特征在于其中所述的金属膜为厚度在20-90nm的Au膜或Ag膜。
6.如权利要求1所述的并行检测多个生物学信号的SPR生物传感器，其特征在于其中所述的化学修饰物层所用的化学修饰剂为11-巯基烷二酸、氨基硫酚、氨基硫醇、巯基乙二胺、十六烷巯基醇或其他含硫试剂。
7.如权利要求1所述的并行检测多个生物学信号的SPR生物传感器，其特征在于其中所述的交联剂层选用的交联剂为EDAC或戊二醛。
8.如权利要求1所述的并行检测多个生物学信号的SPR生物传感器的制备方法，其特征在于该生物传感器是通过下述技术方案获得的1)在基质的表面镀上金膜，使金属膜的厚度为20-90nm；2)此基质依次在浓硫酸∶过氧化氢＝1.5-4∶l的溶液、丙酮溶液或酒精溶液、二次水溶液中超声清洗，干燥；3)此基质浸于含有巯基的化学修饰物溶液中组装3-24小时；4)依次在酒精溶液和二次水溶液中清洗，干燥；5)在交联剂中，组装3-24小时；6)用加样器将多种生物分子按一定顺序定量点制在上述基质表面的不同位置；点与点之间的距离大于lmm，所用的生物分子的浓度从0.05mg/ml-20.0mg/ml不等；7)浸于0.01-0.5％(w/v)BSA封闭液中封闭过夜，2-8℃保存。
9.如权利要求1所述的SPR生物传感器在多个生物学信号并行检测中的应用，其特征在于该传感器可用于并行检测多种抗原、抗体，激素、受体，生物素、抗生物素蛋白，底物、酶或辅酶和核酸分子。
10.如权利要求8所述的SPR生物传感器在多个生物学信号并行检测中的应用，其特征在于它的检测是通过下述方式来实现的a)用完全相同的上述SPR生物传感器分别检测几份含有多种可与生物传感器上的生物分子特异性结合的目标分子，且各目标分子浓度已知并依次递增的样品，通过SPR检测仪记录不同时刻t、生物传感器上各生物分子处的SPR角ω的变化，根据ω与t的关系作动力学曲线；b)由动力学曲线可以得到反应达到平衡后，生物传感器上各生物分子的SPR平衡角ω0值，作此角度值与该点对应的目标分子浓度C的相关曲线，即得到对应于各目标分子的ω0/C标准曲线，该标准曲线置于检测仪数据库中备用；c)当检测未知浓度的溶液时，同1)仍根据生物传感器上各点的SPR角ω与时间t的关系作动力学曲线；d)由动力学曲线找出各SPR平衡角ω0值，将ω0值与对应的目标分子的标准曲线对照，可得出该目标分子的浓度。从而达到对多种目标分子进行定量检测的目的。
全文摘要
本发明涉及一种基于表面等离子体共振(SPR)原理、可以并行检测多个生物学信号的生物传感器。该生物传感器依次由基质，金属膜，化学修饰层，交联剂层和生物单分子层构成，其特征在于在生物单分子层的不同位置结合了多种生物分子，可并行定量检测生物样品中特定目标分子的浓度，并可以应用于疾病指标的检测，具有临床诊断应用的价值。本发明还提供了该生物传感器的制备方法和使用方法。本发明所述生物传感器使用方便，检测灵敏。
文档编号G01N33/53GK1421699SQ01132289
公开日2003年6月4日 申请日期2001年11月23日 优先权日2001年11月23日
发明者胡赓熙 申请人:上海数康生物科技有限公司