专利名称：生物传感器的制作方法
技术领域：
本发明涉及能迅速、高精度并且简便地定量试液中特定成分的生物传感器，尤其是胆固醇传感器。
背景技术：
作为现有的生物传感器的一例，说明葡萄糖传感器。
一般，广为人知的葡萄糖定量法是将葡萄糖氧化酶和氧电极或者过氧化氢电极相组合的方法。葡萄糖氧化酶以氧作为电子介质选择地氧化基质β-D-葡萄糖而生成D-葡糖酸-5-内酯，同时，氧被还原为过氧化氢。对葡萄糖的定量可以通过氧电极来测定这时的氧消耗量，或是通过由铂电极等构成的过氧化氢电极来测定过氧化氢的生成量。
但是，用上述方法，根据测定对象，会受溶氧浓度的很大影响且在无氧的条件下不可能进行测定。因此，开发了不用氧作为电子介质，而用铁氰化钾、二茂铁衍生物、醌衍生物等的金属络合物和有机化合物来作为电子介质的类型的葡萄糖传感器(日本公开特许公报1990年第062952号)。
此生物传感器具有用丝网印刷等方法在绝缘性基板上形成的由测定极、对电极和参照极构成的电极系和在此电极系上形成的含有亲水性高分子、氧化还原酶和电子介质的酶反应层。必要时可以添加缓冲剂在此酶反应层中。
如将含有基质的试液滴在此生物传感器酶反应层上，酶反应层即溶解，酶和基质反应，同时电子介质被还原。酶反应结束后，可以从电化学氧化此被还原了的电子介质而生成的氧化电流值求出试液里的基质浓度。
用此类型传感器可以以氧化电流值求得葡萄糖的浓度。此电流是在电极上氧化由酶反应结果生成的电子介质的还原体而生成的。
这样的生物传感器因为用了以测定对象作为基质的酶，所以，对于各种物质，在原理上都可能进行测定。例如，如用胆固醇氧化酶或胆固醇脱氢酶及胆固醇酯酶作为氧化还原酶，就可以测定用作各种医疗机构诊断指标的血清中胆固醇值。
因为胆固醇酯酶的酶反应进行得非常慢，所以通过添加适当的表面活性剂，来提高胆固醇酯酶的活性，可以缩短整个反应所需要的时间。
但是，由于在反应系内含有表面活性剂，此活性剂就会对血球产生不良影响，就不可能用全血测定。
如上面所述，在测定血液中的胆固醇值的情况下，因为在反应系中含有表面活性剂，所以此活性剂就对血液中的红血球产生不良影响。因为此原因，就不能像葡萄糖传感器一样测定全血。因此，就提出为了迅速地仅提供滤除了红血球的血浆给传感器，在试液供给通路的开口部附近配置过滤部件。但是，因为过滤后的血浆流入传感器的速度慢，不能保证恒定，所以应答值有波动，且血浆进入传感器时，常常有气泡生成，使测定变得不可能。
本发明目的为提供一种避免上述弊端，使过滤了血球的血浆迅速地到达电极系的经改良的生物传感器。
本发明还有提供一种高精度和应答性优异的以全血作为测定对象的胆固醇传感器的目的。
发明内容
本发明生物传感器具有绝缘性基板、在此基板上配置的含有测定极和对电极的电极系、至少含有氧化还原酶和电子介质的反应层、含有前述电极系和反应层的试液供给通路、试样供给部分和在此试样供给部分和试液供给通路之间设置的过滤血球的过滤器，并可以将经上述过滤器过滤了血球的血浆利用毛细现象吸引到上述的试液供给通路内。上述过滤器，其特征在于此过滤器进口侧的截面积比上述的试液供给通路的开口部截面积大。
这里用的过滤器由三维连接的具有空隙部的多孔体构成，此多孔体具有利用毛细作用将血液从上述试样供给部分向试液供给通路一侧移动、利用血浆和血球之间的流通阻力差来过滤血球的作用。用由玻璃纤维、纤维素、纸浆等最好是的亲水性的纤维构成的无纺布、滤纸和其它的多孔质体制作此过滤器。
上述过滤器，其进口侧截面积最好等于或大于位于试液供给通路的开口部的输出侧截面积。
图1是本发明一实施方式的生物传感器纵向剖面图。
图2是同一传感器除去反应层、隔离物和盖板的平面图。
图3是同一传感器的分解立体图。
图4是同一传感器的重要部分的放大剖面图。
图5是显示传感器的试样供给部分结构实例的纵向剖面图。
图6显示传感器的过滤器的变形例的平面简图。
图7显示传感器的过滤器的变形例的纵向剖面简图。
图8是本发明的其它实施方式的传感器的纵向剖面图。
图9是同一传感器的分解立体图。
图10是显示传感器的过滤器的变形例的纵向剖面简图。
图11是比较例的传感器的纵向剖面图。
图12是同一传感器的平面图。
图13是显示本发明的实施例和比较例的胆固醇传感器应答特性的图。
具体实施例方式
如上面所述，本发明是利用过滤器除去干扰物质血球，快速地使血浆流入传感器电极系的生物传感器。即，本发明是在含有电极系和反应层的试液供给通路和试样供给部分之间，配置具有过滤血球作用且进口侧截面积比试液供给通路的开口部截面积大的过滤器，利用此过滤器通过毛细现象将过滤了血球的血浆吸引到试液供给通路内的生物传感器。
本发明较好的实施方式是试液供给通路形成在上述基板和与此基板相组合的盖板部件之间。
本发明其他的较好实施方式是至少覆盖于上述过滤器和试液供给通路上的上述盖板部件为透明。
为了向电极系快速导入分离过血球的血浆，最好还要满足以下任一条件1)试液供给通路截面积等于或小于试液供给通路的开口部截面积。
2)过滤器，其电极一侧的端部的截面积等于或小于导入试液一侧，即进口侧截面积。
3)在不妨碍过滤器膨胀的情况下，将其用支持体支持。
即，更好的构造是从面对试样供给部分的过滤器进口侧到在试液供给通路终端开口的空气孔一侧之间的传感器内的试液流动的中空部分和过滤器截面积慢慢变小。
在过滤器电极一侧的前端部截面积小的情况下，过滤器整体形状为凸型、圆锥型、梯型等。
过滤器的前端部截面积小指的是支持过滤器电极一侧的前端的部在试液供给通路中变窄。
为了完全地除去干扰物质的血球，试液必须通过过滤器，为此过滤器配置于试样供给部分和试液供给通路之间的空间范围里，且最好有一个以上与过滤器支持部不接触的部位，即，环绕过滤器表面一周的空隙部位。如果没有此空隙部位，未通过过滤器的血球则有可能沿着过滤器支持部位流入电极系。
另外，把过滤器输出侧的截面积比进口侧截面积小的情况和从过滤器进口侧到输出侧的截面积都相同的情况相比较，前者的血球分离位置更靠近进口侧；然而，后者的情况下，因为血球分离位置更靠近输出侧，因此，会出现试液供给通路内有血球混入的情况。
由于有上述的结构和形状，就能除去试液中的干扰物且快速使血浆流入传感器内。
就过滤器电极侧的前端部和电极的位置关系来说，过滤器最好不和电极接触。
过滤部和电极式生物传感器的连接位置，通常可以在试液供给通路的开口部一侧的位置，但是，为了节省空间，也可以在空气孔一侧的位置。这时，试液供给通路开口部发挥了空气孔的作用。
盖板部件和隔离物等过滤器的支持部件最好为透明的。为什么呢？因为可以通过目视以过滤器过滤试液的工序和将经过滤的试液通过毛细现象吸引到试液供给通路内的工序以确认过滤是否成功。
作为电子介质，除了铁氰化钾以外，还可以选用胆固醇氧化酶等的氧化还原酶具有电子传递功能的氧化还原化合物。
所用的氧化还原酶是以测定对象作基质的酶。在以葡萄糖为测定对象的传感器中，用葡萄糖氧化酶。在测定用来作为诊断指标的血清中的胆固醇值时，用催化胆固醇氧化反应的胆固醇氧化酶或胆固醇脱氢酶和催化使胆固醇酯变化为胆固醇的反应过程的胆固醇酯酶。因为胆固醇酯酶的酶反应进行很慢，所以通过添加适当的表面活性剂来提高胆固醇酯酶的活性，可以缩短整个反应所需的时间。以上所述的酶配置在传感器内电极系上或此电极系近旁的位置。跟配置电极系的基板组合而在与基板之间具有形成向电极系提供试液的试液供给通路的盖板部件的传感器中，可以将上述的酶配置在试液供给通路的露出部分和试液供给通路的开口部等位置上。不管是在哪一个位置，能通过导入试液而使反应试剂层容易溶解并能达到电极系的位置为最好。为了保护电极和抑制所形成的反应层的脱落，最好靠近电极系形成亲水性高分子层。另外，也可以在电极系以外，以形成亲水性高分子层来作为在形成反应层时的基础，或在最下层的反应层里最好含有亲水性高分子。
含有电子介质的层最好和表面活性剂分离以提高其溶解性。另外，为了保证其贮存稳定性，最好将其和对胆固醇氧化反应有催化作用的胆固醇酯酶分离。
在测定血糖值的生物传感器中，有为了使试液容易导入反应层中，而形成含有脂质的层来覆盖电极系上形成了的层等的例子(例如，日本公开特许公报1990年第062952号)。本发明的测定胆固醇的生物传感器中，因为含有和脂质起同样作用的表面活性剂，所以，即使没有脂质层也可以。
可以用以下物质来作为亲水性高分子水溶性纤维素衍生物，尤其是除了乙基纤维素、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素以外，聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、明胶、聚丙烯酸和其盐、淀粉和其衍生物、马来酸酐聚合物及它的盐、聚丙烯酰胺、甲基丙烯酸酯树脂，聚甲基丙烯酸2-羟乙基酯等。
作为表面活性剂，可选用以下物质n-辛基-β-D-硫代葡糖苷、聚乙二醇单十二烷基醚、胆酸钠、十二烷基-β-麦芽糖苷、蔗糖单月桂酸酯、脱氧胆酸钠、牛磺脱氧胆酸钠、N，N-二(3-D-葡糖酰胺基丙基)脱氧胆酸酰胺和聚氧乙烯(10)辛基苯基醚。
作为脂质，可以适当使用卵磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺等的磷脂的两亲溶性脂质。
作为氧化电流的测定方法，和只有测定极和对电极的二电极方式相比，加上参比极的三电极方式更有可能进行正确的测定。
以下，通过具体的实施方式对本发明进行详细地说明。
图1是一实施方法的生物传感器的纵向剖面图，图2是除去其反应层、隔离物和盖板的平面图、图3是除去反应层和过滤器的生物传感器的分解立体图。
1显示聚乙烯对苯二甲酸酯的绝缘性基板。此基板1的左半部分1a的厚度薄，右半部分1b具有左半部分约2倍的厚度。在厚度薄的部分1a上，通过丝网印刷法印刷银膏以形成导线2、3和电极系的基础；然后把含有树脂粘合剂的导电性碳糊印刷在基板1上，形成包含有测定极4和对电极5的电极系。另外，将绝缘性糊印刷在特定范围里，形成绝缘层6。绝缘层6使测定极4和对电极5的露出部分面积保持恒定并部分覆盖导线2和3。在基板1厚度较厚的部分1b上，配置有上面有开口的凹陷部分7和8。
和上述基板1装配的隔离物11，为几乎覆盖基板1的绝缘层6的大小的平板部分11a，和覆盖基板部分1b的周围，并在基板1上形成收容后述过滤器的空间部分，由高度较高的略作U字形部分的11b构成。U字形部分11b在左端部16加上依次由高到低的锥度，使和平板部分11a相连接的部分变得和平板部分一样高度。另外，在基板1的凹陷部7和8之间对应于间隔部9这部分的上方，U字形部分11b上具有固定过滤器的固定部19，在平板部分11a上有连通上下在U字形部分一侧开口的切口12。
盖板21有分别覆盖隔离物11的平板部分11a和11b的部分21a和21b，在部分21b上，有对应于隔离物锥度16的倾斜部分26。盖板21还有和基板1切口12终端相连通的空气孔22和与凹陷部分8以及与隔离物11的固定部19的右方的开口部18相连通的透孔28。
在基板1上和/或盖板11的一侧形成反应试剂层，另外，在基板1上配置过滤器20，将隔离物11和盖板21组装在基板1上以形成图1所示的生物传感器。在图1上，10显示电极系。过滤器20，其后面部分的上下被基板1的间隔部9和盖板21的紧固部19夹住固定，而它的前端部被与基板1的试液供给通路的开口部相连接的部分和盖板的21的倾斜部分26夹住固定。而且，过滤器20其前端面对着在隔离物11的切口12部分形成的试液供给通路。
这样被固定了的过滤器20的位于基板1的凹陷部7上的部分，其周围一周不和基板及盖板部件连接。这样，由于存在过滤器20的一部分和过滤器支持部分不接触的地方，即，环绕过滤器一周的空隙部分，可以阻止没有通过过滤器而沿过滤器支持部分而来的血球流入向电极系。
在图1和图2里，F1表示过滤器20的进口侧的截面积，F2表示过滤器20的位于试液供给通路开口部的输出侧的截面积。再者，S1是表示试液供给通路开口部的截面积，S2是表示试液供给通路的截面积。
在本发明中，使S1＜F1，这样，滤除血球的血浆迅速地达到电极系。较好是S2＜F1，最佳的是F2＜F1。
在用此传感器来测定血液中的胆固醇值时，使试样的血液通过盖板21的透孔28部分供给到基板1的凹陷部8上。在这里，被供给的血液从过滤器20的端部向过滤器的内部渗透。在过滤器20的内部，因为血球的渗透速度比液体成分的血浆慢，所以，血浆从过滤器电极系一侧渗透出来，此渗透出来的血浆将溶解由酶等构成的加载在覆盖电极系的位置或此位置的垂直上方的盖板的里面的反应试剂，同时充满从电极系附近到空气孔22部分的整段试液供给通路。如充满整段试液供给通路的话，过滤器20内的液体流动也就停止，这时，血球就不会到达过滤器20的电极系一侧的端部，而在此位置滞留下来。因此，过滤器20的配置是为了造成血浆和血球的流通阻力差，而仅让充满整段试液供给通路的血浆量通过，并且使血球不能达到过滤器输出侧。本发明适合用平均孔径约为1-7μm的深过滤器(depth filter)。
这样，经过血球过滤，被血浆溶解了的反应试剂层和血浆中的测定成分(如果是胆固醇传感器的话，此成分为胆固醇)发生化学反应，经过一段时间，就可以测定电极反应的电流值而定量血浆中的成分。图4显示试液供给通路的电极系附近的反应试剂层的配置的实例。基板1的电极系上，形成有亲水性高分子的羧甲基纤维素钠盐(以下仅表示为CMC)层30和含有反应试剂(例如电子介质)的层31a。另外，在隔离物11组合在盖板21上的盖板部件的里面，试液供给通路露出的面上，形成有表面活性剂层32和含有氧化还原酶的反应试剂层31b。
图5、图6和图7显示传感器的变形例的简图。
图5显示试样供给部分不同的例子。图5(a)，如图1一样，由能接受试液的凹陷部构成试样供给部分8。图5(b)是具有利用过滤器20的端部上面露出处添加试液的试样供给部分8的例子。图5(c)，过滤器20进口侧端面和端部上面露出。因此，不仅可以添加试样至基板1上的试样供给部分8，还可以向过滤器20端部的上面添加试料。
图6是显示各种形状过滤器的平面图。图6(a)是从进口侧到输出侧宽相同的过滤器的例子。图6(b)表示加上锥度使从进口侧到输出侧的宽度依次变窄的而大致形成梯形。图6(c)是显示使进口侧宽度变得比输出侧宽度大而在中途改变宽度的例子。
图7显示过滤器的不同剖面形状。图7(a)至(c)是加上锥度而使进口侧剖面比输出侧剖面大。图7(d)和(e)是使进口侧剖面相同于输出侧剖面的图。
如上述图1和图5-7所示，构成试液供给通路的切口12与液体流通方向垂直的截面积都比过滤器20的截面积小。而且，过滤器20具有在其整体上大致一样的密度。这样本发明是通过使试液供给通路的截面积S2小于过滤器20进口侧的截面积F1，利用毛细现象，将通过过滤器滤除血球的血浆快速地吸引到试液供给通路内的传感器。将过滤器先端部的截面积变小，就能迅速地使血浆流入到传感器内。
即使把图5所示的试样供给部分、图6显示的过滤器的平面形状和/或如图7所示的过滤器剖面形状组合起来也能迅速地使血浆流入到试液供给通路内。
在如图所示构造的生物传感器中，过滤器进口侧的宽度最好为5mm以下，厚度为2mm以下；而试液供给通路开口部宽度最好为2mm以下，厚度为200μm以下。
图8是本发明的其他实施方式的生物传感器的纵向剖面图，图9为其传感器除去试剂层的分解立体图。
在绝缘性基板31上，如图1的情况形成导线32和33、分别和此导线连接的作用极34和对电极35以及绝缘层36。在此基板31上，组合有多个隔离物41、43、45、47和49以及盖板53，在隔离物43和盖板53之间，有过滤器51配置在透孔46、48和50的部分上。盖板52的透孔53构成试样供给部分，在隔离物41和43上配置的透孔42和44构成试液供给通路。因为使隔离物45和49的透孔46和50的直径大于过滤器51的直径，所以，在过滤器51的周围，形成用55和56来表示的包围过滤器51的空隙部分。隔离物47和过滤器51的外周有部分连接，起到确定过滤器位置的作用。隔离物41具有将上述试液供给通路的终端部与大气连通的一对空气孔54。这样如利用毛细现象将试液从构成试样供给部分的透孔53导入到配置在电极系上的过滤器51和试液供给通路，再使经过滤器过滤的血浆达到电极系，试液的移动即会停止。
这里，决定包围过滤器51的空隙部分55和56的高度的隔离物49和45的厚度最好在100μm以上。隔离物41，其透孔42的部分是提供试液和试剂反应场所的，其厚度最好为200μm以下。
此例中，于电极系上，形成CMC层61和电子介质层62，在隔离物43的里面形成含有酶和表面活性剂的层63。
如前所示，图10显示了沿着重力方向将试液从设置在盖板一侧的试样供给部分向电极系提供的传感器过滤器中的形状。图10(a)和图8一样是采用有相同剖面进口侧和输出侧的过滤器51的实例图。图10(b)是使输出侧截面积小于进口侧截面积的实例图。
以下，说明本发明的实施例。
实施例1
在具有图1-4的构造的胆固醇传感器中，反应层31a含有电子介质，反应层31b含有胆固醇氧化酶、胆固醇酯酶和表面活性剂，层32由表面活性剂构成。按照以下所示顺序制作此传感器。
首先，将5μl羧甲基纤维素钠盐的0.5wt％的水溶液滴在基板1的电极系上，在50℃的暖风干燥器中干燥10分钟，制成CMC层30。然后，滴4μl铁氰化钾水溶液(相当于铁氰化钾70mM)于CMC层30上，在50℃的暖风干燥器中干燥10分钟，形成含有铁氰化钾的反应层31a。
将2μl表面活性剂的聚氧乙烯(10)辛基苯基醚(TritonX-100)的2wt％乙醇溶液滴在由组合了盖板和隔离物的盖板部件的切口形成的凹陷部位，在室温下将其干燥3分钟，形成表面活性剂层32。上述的切口的宽度为2mm，长为4.5mm，隔离物的厚度为100μ。
将表面活性剂聚氧乙烯(10)辛基苯基醚(TritonX-100)添加在溶解了来自诺卡氏菌的胆固醇氧化酶(EC1.1.3.6，以下省略为ChOD)和来源于假单胞菌的胆固醇酯酶(EC.3.1.1.13，以下简略为ChE)的水溶液中。滴下1.5μl此混合水溶液在表面活性剂层32上，在-196℃的液氮中冷冻后，放于梨形烧瓶中，在冷冻干燥器中干燥一晚，就形成了含有480U/ml的胆固醇氧化酶、1200U/ml的胆固醇酯酶和2wt％的表面活性剂的反应层31b。
将冲切成上边2mm，下边4mm，高3mm的梯形的厚度为600μm，平均孔径为2.3μm的玻璃纤维滤纸如图2所示，不和作用极接触地配置在这样制作的传感器的基板1上。
此后，将上述盖板部件连接在基板上就制成了图1的胆固醇传感器。
比较例1按照图11和图12所示，除了将过滤器20的尺寸定为宽2mm，长27mm和厚度100μm以外，其余都和实施例1一样地组装胆固醇传感器。
在实施例1和比较例1中的胆固醇传感器A和B里，通过作为试液导入口的盖板21的透孔28将作为试液的全血20μl导入到基板1的凹陷部8上，3分钟后，以对电极为基准，在以测定极为正极的方向上加上+0.5V脉冲电压，5秒钟后，测定作用极和对电极之间流过的电流值。此结果在图13中显示。实施例1和比较例1传感器的过滤器的名义体积都约为5.4mm3。
图上很明确，如果用本发明传感器，胆固醇浓度和应答值之间可以得到良好的线性。
产业上利用的可能性通过本发明，能利用过滤器将干扰物质的血球除去，而且能迅速地将试样提供给电极系，能提供具优异应答特性的电化学生物传感器。
权利要求
1.生物传感器，它具有绝缘性基板、在此基板上配置的含有测定极和对电极的电极系、至少含有氧化还原酶和电子介质的反应层、含有前述电极系和反应层的试液供给通路、试样供给部分和在此试样供给部分和试液供给通路之间设置的过滤血球的过滤器，使得经上述过滤器过滤了血球的血浆能够通过毛细现象被吸引到上述的试液供给通路内，其特征在于，上述过滤器进口侧的截面积比上述的试液供给通路的开口部截面积大。
2.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述试液供给通路截面积等于或小于试液供给通路的开口部截面积。
3.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述过滤器，其进口侧截面积大于位于试液供给通路的开口部的输出侧截面积。
4.根据权利要求1-3中任一项记载的生物传感器，其特征在于，所述过滤器由三维连接的具有空隙部的多孔体构成，此多孔体具有利用毛细作用将血液从上述试样供给部分向试液供给通路一侧移动、利用血浆与血球之间的流通阻力差来过滤血球的作用。
5.根据权利要求1-4中任一项记载的生物传感器，其特征在于，在所述过滤器的试样供给部分与试液供给通路之间的范围里，有环绕过滤器表面一周的空隙部。
6.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述过滤器的输出侧前端部不和电极接触。
7.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述试液供给通路形成在所述基板和与此基板相组合的盖板部件之间。
8.根据权利要求7所述的生物传感器，其特征在于，所述的盖板部件的至少覆盖于所述过滤器和试液供给通路上的部分为透明的。
9.根据权利要求7所述的生物传感器，其特征在于，在所述的盖板部件上加载或固定有表面活性剂。
全文摘要
本发明提供一种使滤除血球的血浆迅速达到电极系的经改良的以全血为测定对象的生物传感器。本发明生物传感器具有绝缘性基板、在此基板上配置的含有测定极和对电极的电极系、至少含有氧化还原酶和电子介质的反应层、含有前述电极系和反应层的试液供给通路、试样供给部分和在此试样供给部分和试液供给通路之间设置的过滤血球的过滤器，并可以将经上述过滤器过滤了血球的血浆利用毛细现象吸引到上述的试液供给通路内。上述过滤器，其特征在于此过滤器的截面积比上述的试液供给通路的开口部截面积大。
文档编号G01N33/487GK1444730SQ01813616
公开日2003年9月24日 申请日期2001年7月26日 优先权日2000年7月31日
发明者长谷川美和, 山本智浩, 渡边基一, 池田信, 南海史郎 申请人:松下电器产业株式会社