专利名称：生物传感器的制作方法
技术领域：
本发明涉及能够对血液、血清及血浆等被检试样中的特定成分进行迅速、高灵敏度且方便地定量的生物传感器，特别涉及能够测定葡萄糖和总胆甾醇等的生物传感器。
背景技术：
以往的生物传感器以葡萄糖传感器为例进行说明。其代表例为通过丝网印刷等方法在绝缘性基板上形成至少包含测定极和配极的电极系统，在该电极系统上再形成包含亲水性高分子、氧化还原酶及电子传导体的酶反应层而获得的葡萄糖传感器。氧化还原酶采用了葡萄糖氧化酶，电子传导体采用了铁氰化钾、二茂合铁衍生物、苯醌衍生物等金属络合物和有机化合物等。根据需要可在酶反应层中加入缓冲剂。
在该生物传感器的酶反应层上滴下包含底物的试样溶液使酶反应层溶解，酶与底物发生反应，伴随该反应电子传导体被还原。酶反应结束后，能够通过被还原的电子传导体的电化学氧化的氧化电流值求得试样溶液中的底物浓度。
这种类型的葡萄糖传感器中，酶反应后生成的电子传导体的还原体在电极被氧化，由其氧化电流值求得葡萄糖浓度。
该生物传感器由于使用以测定对象物质为底物的酶，因此从理论上讲能够测定各种物质。例如，如果使用胆甾醇氧化酶或胆甾醇脱氢酶作为氧化还原酶，则能够测定各种医疗机构中用于诊断指南的血清中的胆甾醇值。
由于胆甾醇酯酶的酶反应进行得非常慢，所以通过添加合适的表面活性剂能使胆甾醇酯酶的活性有所提高，并可缩短整体反应所需的时间。
但反应系统中包含表面活性剂，该表面活性剂会对血细胞产生不良影响，利用葡萄糖传感器不能够对全血中的胆甾醇值进行测定。
因此，提出了为了仅将过滤除去血细胞而获得的血浆迅速地输入传感器内，在试样溶液供给通路的入口附近设置了过滤片(血细胞过滤部)的方案。图9所示为说明分离血液的原理的过滤片的简单截面图。
分离血细胞的方式包括如图9(a)所示的在过滤片a的试样溶液供给部侧面部分的侧端部滴下血液，沿水平方向过滤，从过滤片a的试样溶液供给通路的空气孔侧部分的端部使血浆渗出的水平分离方式；如图9(b)所示的在过滤片b的上部表面直接滴下血液，沿垂直方向过滤，从前述过滤片b的底面或其附近的端部使血浆渗出的垂直分离方式；以及如图9(c)所示的在过滤片c的试样溶液供给部侧面部分的上部表面直接滴下血液，沿垂直方向过滤的同时也沿水平方向过滤，从过滤片c的试样溶液供给通路的空气孔侧部分的端部渗出血浆的复合分离方式这3种方式。
以往大多数情况下使用的是水平分离(例如，日本专利特愿2000-399056号说明书)或复合分离(例如，日本专利特愿2001-152868号说明书)。
但是，如果过滤片与传感器的组合不合适，则被过滤片捕捉的血细胞会被破坏，导致血红蛋白的溶出。如果血细胞被破坏形成象血红蛋白那样的较小成分，则这种较小成分很难利用过滤片进行过滤。这样血红蛋白就会流入试样溶液供给通路中，结果导致测定出现误差。
这是因为吸收试样溶液前的过滤片厚度和吸收试样溶液后膨胀起来的过滤片的厚度差与自上而下保持过滤片的压紧部的间隔不合适的缘故。自上而下保持过滤片的压紧部的间隔对于膨胀后的过滤片的厚度如果过窄，则会阻碍过滤片的膨胀。这样，膨胀受到阻碍的过滤片的孔径不能够扩得足够大，结果使渗透的血细胞受到破坏。
针对上述情况，因试样溶液的不同，其血细胞比容值(血细胞容积比)也各不相同，因此过滤片的膨胀程度也不同，所以如果预先假设膨胀后的过滤片的厚度，并扩大设定前述压紧部的上下间隔，就可能使过滤片在保存过程中发生移位。
为了解决这一问题，考虑采用复合分离方式时，在前述过滤片的任一部分，使保持前述过滤片表面的压紧部仅与前述过滤片的上下的任一方接触(例如，日本专利特愿2001-152868号说明书)。
由于具备该结构，所以在保持过滤片的上下压紧部间的距离与过滤片吸收试样溶液后膨胀的厚度不合适的情况下，也不会妨碍过滤片的膨胀，能够进一步避免因膨胀受到限制而引起的血细胞被破坏所导致的测定误差。即，前述保持过滤片的压紧部不是沿前述过滤片自上而下的压紧，在过滤片膨胀时，压紧部以外的试样溶液供给部及空隙部的一部分可能出现膨胀，这样过滤片的孔径能够自由地变化，不会出现血细胞被破坏的现象。
但是，这些方法虽然作为减少试样溶液的量的方法是有效的，但存在所得生物传感器的结构复杂的问题。例如，垂直方向的阴影图中，使用三角形的平整的过滤片的情况下，使其前端的顶点部分插入试样溶液供给通路的入口(宽度0.8mm)的内侧约1mm处，这在制造上是非常困难的。
此外，采用水平分离及复合分离方式时存在比垂直分离方式的滤液流速慢的问题。对此，虽然所得生物传感器的结构能够简化，但作为胆甾醇传感器使用时，必须在与电极对向的部分负载试剂，因此从结构上讲采用普通的垂直分离方式是不可能的。其理由是结构上存在问题，试剂负载位置上也存在问题。
第1，例如，采用日本专利特愿昭62-180434号及特愿昭62-292323号各说明书中记载的垂直分离方式时，必须采用
图10～12所示的结构。
图10所示类型的生物传感器中，在绝缘性基板401上设置了工作极402及配极403，其上又设置了氧化还原酶层405、空隙部406、过滤片407及多孔体408。此时的过滤采用的是利用了重力的自然过滤法，但试样溶液中有气泡产生，试样溶液很难进入多孔体408中，流速慢。因此，滤液无法充分到达电极，存在测定精度不良的问题。所以，在上部设置泵型加压装置411，通过施加压力414来过滤试样溶液412。
日本专利特愿昭62-292323号说明书记载的传感器如图11及12所示，其中未设置加压装置，而是在传感器内设置了将通过了过滤片508的滤液导入电极502′、503′及504′的诱导层507。这样滤液被导入诱导层507，首先润湿电极，再借助电极表面的亲水性高分子层512扩散到电极上，这样就不会使工作极上产生气泡，从而能够提高测定精度。
图11及12中，在诱导层507的上部设置了过滤片508、保持框架509、多孔体510及罩盖511。在基板501的上部配置了电极502、503及504，还设置了绝缘层505。
但是，上述任一情况下，都必须设置加压装置及诱导层，存在传感器的结构复杂的问题。
与试剂的负载位置有关的问题如日本专利特愿2000-018834号的说明书所述。该说明书所揭示的胆甾醇传感器与血糖传感器不同，负载了浓度非常高的试剂。因此，如果象血糖传感器那样，将必要的试剂全部负载于一处，则会妨碍试剂的扩散，存在感应电流值的精度下降的问题。此外，试剂中含有血糖传感器中没有的表面活性剂，它对其他试剂的保存稳定性有不良影响，所以必须分开负载。因此，不可能采用试剂上下(电极上与罩盖侧)分开负载、电极上部具备过滤片的以往的结构。
因此，本发明的目的1是提供避免采用垂直分离方式时的上述不理想情况、通过血液的过滤分离血细胞而得到的血浆能够迅速到达电极系统的经改良的生物传感器。
第2，在采用水平分离方式(例如，日本专利特愿2000-236131号、特愿2000-399056号及特愿2001-152868号各说明书)、垂直分离方式(例如，日本专利特愿2001-180362号说明书)、复合分离方式中的任一过滤方式时，如果过滤片不合适，被过滤片捕集的血细胞被破坏，溶出血红蛋白。用过滤片很难过滤象血红蛋白那样小的血细胞成分，血红蛋白流入试样溶液供给通路内，导致测定误差。
特别是采用水平分离方式时，存在传感器结构复杂的问题，共同的问题是血细胞的混入屡屡造成测定误差。这是因为以往的玻璃纤维滤纸(深度过滤片)的保留比例为98％，有2％的部分流出。无论传感器体积如何减小，全血也会由厚玻璃纤维滤纸(例如，厚度为200～800μm)构成的过滤片吸收，存在试样量的减少有界限的问题。
因此，本发明的目的2是提供无上述不理想的情况、血细胞不会混入、被过滤的血浆在无压力条件下通过毛细管现象向试样溶液供给通路转移、滤液停留在空气孔中的经改良的生物传感器。此外，本发明的目的是得到指尖穿刺采血进行测定时、指尖的全血能够有效且容易地擦拭附着于传感器、作为测定对象的血浆能够迅速供给电极系统的生物传感器。
第3，使用2种以上过滤片的血细胞分离的以往例子如美国专利第5240862号说明书(申请人X-Flor B.V.及Primecare B.V.)及国际公开第96/15453号小册子(申请人Spectral Diagnostic Inc.)等记载。其特征是，试样溶液依次通过孔径较大的过滤片和孔径较小的过滤片。换言之，具有试样溶液从入口到出口依次通过孔径较大的过滤片和孔径较小的过滤片的特征。
但是，上述使用2种以上过滤片的技术中，在最下层设置不使血细胞通过的捕集比例为100％的过滤片的情况下，存在从试样溶液供给通路的空气孔侧的一部分获得的少量滤液不可能在未施加压力、依靠重力之类自由落体等移向中空的试样溶液供给通路的问题。即，存在不可能通过毛细管现象将滤液导入试样溶液供给通路的问题。
因此，本发明的目的3是提供无上述不理想的情况、使用具有不使血细胞通过的小孔径的过滤片作为第1过滤片、在无压力条件下利用毛细管现象使所得滤液移向试样溶液供给通路、所得滤液停留于空气孔的经改良的生物传感器。具体来说，本发明的目的是提供精度高、感应性良好、以全血作为测定对象的葡萄糖传感器和胆甾醇传感器。
发明的揭示为了达到上述目的，本发明提供了具备绝缘性基板、具有设置于前述基板上的工作极和配极的电极系统、至少含有氧化还原酶和电子传导体的反应层、包含前述电极系统和前述反应层并具有入口和空气孔的试样溶液供给通路、位于与前述试样溶液供给通路分离的位置的导入试样溶液的试样溶液供给部、以及设置于前述试样溶液供给通路和前述试样溶液供给部之间的过滤试样溶液的第1过滤片，由前述第1过滤片过滤的滤液利用毛细管现象被供给入前述试样溶液供给通路内的生物传感器，该传感器的特征是，前述试样溶液通过前述第1过滤片的方向和前述滤液通过前述试样溶液供给通路的方向垂直相交。
较好的是前述生物传感器中，在前述第1过滤片的前述试样溶液滴下部侧至前述试样溶液供给通路的入口侧的区域，至少具有1个将前述第1过滤片的表面围一圈的空隙部。
较好的是前述第1过滤片的前述试样溶液供给部侧的截面积比前述试样溶液供给通路的入口侧的截面积大。
较好的是前述第1过滤片的前述试样溶液供给部侧的截面积比前述第1过滤片的前述试样溶液供给通路侧的截面积大。
较好的是前述第1过滤片由玻璃纤维或纤维素纤维构成。
较好的是前述第1过滤片与前述电极系统不接触。
较好的是前述第1过滤片的至少一部分与前述绝缘性基板接触。
较好的是前述第1过滤片上涂有聚乙烯醇、乙基纤维素、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、琼脂糖、聚丙烯酸及其盐、淀粉及其衍生物、马来酸酐的聚合物及其盐、聚丙烯酰胺、甲基丙烯酸酯树脂及聚-2-羟基乙基甲基丙烯酸酯中的任一种。
较好的是前述反应层中包含用于检测总胆甾醇的试剂系统。
较好的是前述第1过滤片为圆柱状。此时，前述第1过滤片的圆形端面的直径最好在5mm以下。
此外，较好的是具有在前述第1过滤片的上部滴下前述试样溶液的入口。
较好的是在前述试样溶液供给部的底部具有与前述第1过滤片连通的孔。而且，前述试样溶液供给部的入口的尺寸比前述第1过滤片的尺寸小。较好的是前述第1过滤片的表面具有与构成本生物传感器的其他构成要素不接触的部分。
本发明的生物传感器中，前述第1过滤片最好由薄膜状的具有均一的孔径的过滤片构成。
较好的是在前述第1过滤片与前述基板之间设置亲水层。
较好的是在前述第1过滤片和前述试样溶液供给通路之间还具有第2过滤片。
较好的是前述第1过滤片的平均孔径比前述第2过滤片的平均孔径小。
较好的是前述第2过滤片为深度过滤片。
前述第1过滤片可与前述第2过滤片接触。
较好的是前述第2过滤片与前述试样溶液供给通路的入口接触。较好的是前述第2过滤片不与前述电极系统接触。
较好的是前述第1过滤片和前述第2过滤片的垂直方向下部不存在前述电极系统。
较好的是前述第2过滤片的前述试样溶液供给部侧的截面积比前述试样溶液供给通路的试样溶液流过方向的垂直方向的截面积大。
较好的是前述第1过滤片及/或前述第2过滤片中包含抑制试样溶液中的高密度脂蛋白、低密度脂蛋白或超低密度脂蛋白中的任一种所含的胆甾醇和前述氧化还原酶的反应的试剂。
对附图的简单说明图1为本发明实施方式之一的生物传感器的分解立体图。
图2为图1的生物传感器的合体立体图。
图3为省略了反应层等的图2的X-X线的主要部分的截面图。
图4为详细表示反应层的图2的X-X线的主要部分的截面图。
图5为本发明实施方式之一的生物传感器的分解立体图。
图6为图5的生物传感器的合体立体图。
图7为省略了反应层等的图6的Y-Y线的截面图。
图8为详细表示反应层的图6的Y-Y线的主要部分的截面图。
图9为用于说明血液分离的原理的过滤片装置的简单截面图。
图10为以往的生物传感器的纵截面图。
图11为另一以往的生物传感器的分解立体图。
图12为图11所示的生物传感器的纵截面图。
图13为详细说明本发明实施方式之一的生物传感器的第1过滤片部分的主要部分的截面图。
图14为详细说明本发明另一实施方式的生物传感器的第1过滤片部分的主要部分的截面图。
图15为详细说明本发明又一实施方式的生物传感器的第1过滤片部分的主要部分的截面图。
图16表示实施例1的生物传感器的感应特性。
图17表示实施例2的生物传感器的感应特性。
图18为本发明实施方式之一的生物传感器的分解立体图。
图19为图18的生物传感器的合体立体图。
图20为省略了图19所示的生物传感器的反应层等的X′-X′线的纵截面图。
图21为详细表示图19所示的生物传感器的反应层的X′-X′线的纵截面图。
图22表示本发明实施例1的试样溶液中的总胆甾醇的浓度和电流的感应值的关系。
图23表示本发明实施例2的试样溶液中的葡萄糖浓度和电流的感应值的关系。
图24为本发明实施方式之一的生物传感器的分解立体图。
图25为图24的生物传感器的合体立体图。
图26为省略了图25所示的生物传感器的反应层及电极系统等的X″-X″线的纵截面图。
图27为详细表示图25所示的生物传感器的反应层及电极系统等的X″-X″线的纵截面图。
图28表示本发明实施例5的对应于总胆甾醇的生物传感器的感应特性。
实施发明的最佳方式本发明的生物传感器具备绝缘性基板、具有设置于前述基板上的工作极和配极的电极系统、至少含有氧化还原酶和电子传导体的反应层、包含前述电极系统和前述反应层并具有入口和空气孔的试样溶液供给通路、位于与前述试样溶液供给通路分离的位置的导入试样溶液的试样溶液供给部、以及设置于前述试样溶液供给通路和前述试样溶液供给部之间的过滤试样溶液的第1过滤片，由前述第1过滤片过滤的滤液利用毛细管现象被供给入前述试样溶液供给通路内，该传感器的特征是，前述试样溶液通过前述第1过滤片的方向和前述滤液通过前述试样溶液供给通路的方向垂直相交。
通过具备上述技术特征，能够使所得生物传感器的结构简化。该生物传感器避免了采用垂直分离方式时的不理想情况，能够使通过血液的过滤分离血细胞而获得的血浆迅速到达电极系统。
此外，不会混入血细胞，使过滤的血浆在无压力的条件下通过毛细管现象移入试样溶液供给通路中，并使滤液达到空气孔。更具体地讲，本发明的生物传感器具有高精度，且感应性良好，能够应用于以全血为测定对象的葡萄糖传感器及胆甾醇传感器等。
本发明所用的电子传导体除了铁氰化钾之外，还可选自与胆甾醇氧化酶等氧化还原酶之间具有电子传导能力的氧化还原型化合物。
氧化还原酶是以测定对象物为底物的酶，以葡萄糖为测定对象的传感器中使用葡萄糖氧化酶。测定用于诊断指南的血清中的胆甾醇值时，采用催化胆甾醇的氧化反应的胆甾醇氧化酶或胆甾醇脱氢酶及催化胆甾醇酯转变为胆甾醇的过程的胆甾醇酯酶。由于胆甾醇酯酶的酶反应进行得非常慢，所以可通过添加合适的表面活性剂等方法，使胆甾醇酯酶的活性有所提高，这样就能够缩短整体反应所需时间。
含有电子传导体及氧化还原酶等试剂的反应层配置在传感器内的电极系统上或其近旁。具备与设置了电极系统的基板结合、与基板之间形成了向电极系统供给试样溶液的试样溶液供给通路的罩盖构件的传感器中，可在露出于前述试样溶液供给通路的部分或试样溶液供给通路的入口部等处设置前述反应层。即，前述反应层只要在试样溶液供给通路内即可，可设置在绝缘性基板及罩盖构件的任一处。最好不论在哪一个位置，前述反应层都能够容易地溶解于导入的试样溶液中，直至电极系统。此外，为了保护电极，抑制形成的反应层的剥离，最好在电极系统上连接形成亲水性高分子层。除了电极系统之外，最好使亲水性高分子层作为形成反应层时的基底层形成，或者，在反应层由多层构成时，使亲水性高分子包含于最下层。
为了提高含有电子传导体的反应层的溶解性，最好使该反应层与表面活性剂分开设置。此外，为了获得保存稳定性，最好使催化胆甾醇氧化反应的胆甾醇氧化酶及胆甾醇酯酶分离。
测定血糖值的生物传感器中，有为了易于将试样溶液导入反应层而形成将电极系统上形成的层等覆盖的含有脂质的层的例子(例如，日本专利特开平2-062952号公报)。本发明的测定胆甾醇的生物传感器，最好采用冷冻干燥法形成反应层的一部分(例如，日本专利特愿2000-018834号说明书)；或在罩盖构件表面用表面活性剂或通过等离子照射等进行亲水处理。采用上述构成的情况下，即使不设置脂质层也没关系。
作为亲水性高分子，除了乙基纤维素、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素等水溶性纤维素衍生物之外，还包括聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、明胶、琼脂糖、聚丙烯酸及其盐、淀粉及其衍生物、马来酸酐的聚合物及其盐、聚丙烯酰胺、甲基丙烯酸酯树脂或聚-2-羟乙基甲基丙烯酸酯等。
表面活性剂可使用正辛基-β-D-硫葡糖甙、聚乙二醇单十二烷基醚、胆酸钠、十二烷基-β-麦芽苷、蔗糖单月桂酸酯、脱氧胆酸钠、脱氧牛磺胆酸钠、N，N-双(3-D-葡糖酰胺丙基)脱氧胆酰胺或聚氧乙烯(10)辛基苯醚等。在不影响本发明效果的前提下，也可使用其他表面活性剂。
此外，使用脂质时，例如，可使用卵磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺等磷脂质，较好是使用亲水亲油性脂质。
氧化电流的测定方法有仅包括测定极和配极的二电极方式，以及还增加了参考极的三电极方式。其中，从传感器的结构简单化及成本考虑，较好的是二电极方式，如果要求更精密的测定，则最好采用三电极方式。
以下，参考附图，通过具体实施方式
对本发明进行详细说明。
实施方式1本发明的实施方式1的生物传感器具备绝缘性基板、具有设置于前述基板上的工作极和配极的电极系统、至少含有氧化还原酶和电子传导体的反应层、包含前述电极系统和前述反应层并在终端部侧具有空气孔的试样溶液供给通路、用于导入试样溶液的试样溶液供给部、以及设置于前述试样溶液供给通路和前述试样溶液供给部之间的过滤试样溶液的第1过滤片，由前述第1过滤片过滤的滤液利用毛细管现象被吸引入前述试样溶液供给通路内，该传感器的特征是，前述第1过滤片不侵入前述试样溶液供给通路内，前述试样溶液通过前述第1过滤片的方向是垂直方向，前述血浆从前述试样溶液供给通路的入口朝向前述空气孔的通过方向为水平方向。
本发明实施方式1中的生物传感器中，作为血细胞分离的方法采用了垂直分离方式，作为试样溶液采用了血液，从第1过滤片的试样溶液供给通路入口侧渗出的血浆在试样溶液供给通路中，从入口朝向其终端部的空气孔慢慢溶解试剂的同时水平流动。这样就能够不改变试样溶液供给通路内上下分离负载的试剂的位置，实现传感器结构的简化。
由于前述第1过滤片不侵入前述试样溶液供给通路内，所以过滤片不与试样溶液供给通路内的反应层中所含的试剂接触，该试剂很难向过滤片内扩散。这样试剂浓度就不会出现不均一，能够实现稳定的传感器精度。
图1为实施方式1的生物传感器的分解立体图。如图1所示，本发明的生物传感器具有聚对苯二甲酸乙二酯等绝缘性树脂形成的绝缘性基板1。图1中，通过喷镀法或蒸镀法等在基板1的左侧上面形成钯部分，再利用激光修边法形成包含工作极2和配极3的电极系统。电极的面积由后述的隔板5上的狭缝8的宽度决定。
与前述基板1组合的隔板5上形成了构成所得生物传感器中的试样溶液供给通路的狭缝8、狭缝8的入口7及装载第1过滤片4的孔6。罩盖9上除了形成装载第1过滤片4的连通部10之外，还形成了空气孔11。
过滤片支承板12上形成了空隙部13和直接支承第1过滤片的突起的过滤片支承部(突起部)14。此外，在构成试样溶液滴下部的上罩盖15上形成了与第1过滤片4的上部表面连通的开口部16。如后述的实施例2所示，过滤片支承板12由多个构件形成。
上述基板1、隔板5、罩盖9、过滤片支承板12及上罩盖15一体化时，与狭缝8连通的孔6、形成于罩盖9的孔10、形成于过滤片支承板12的空隙部13及形成于上罩盖15的开口部16连通。
作为血细胞过滤部的第1过滤片4由玻璃纤维制滤纸形成，具有0.5～5μm的孔径、2～5mm的直径和200～1000μm高度(厚度)的圆柱状的形状。过滤片的孔径是粒子数的98％被过滤片保留时的粒径。例如，使用孔径5μm的过滤片过滤粒径5μm的粒子时，被过滤片保留的粒子比例为98％。
组装该传感器时，如后所述，在基板1的规定部分形成反应层。此外，基于图1所示的位置关系，如后所述，由罩盖9和隔板5组合形成的合体基板A的狭缝8形成的凹部(试样溶液供给通路)中，在规定构件形成反应层。此外，基于图1所示的位置关系，制得过滤片支承板12和上罩盖15组合而成的合体基板B。基板1、合体基板A、第1过滤片4及合体基板B按照图1的虚线及点划线所示的位置设置。
按照图1的结构获得的本发明的生物传感器的简单立体图如图2所示。图2中的X-X线的截面图如图3所示。如图3的截面图所示，本发明的生物传感器中，形成第1过滤片4和其他构件不接触的空隙部13。为了完全除去作为妨碍物质的血细胞，为了使试样溶液通过过滤片，必须在开口部16至入口7的区域中设置至少一处与过滤片支承部不接触的地方，即设置至少1个围过滤片表面一圈的空隙部13。
图2省略了反应层及电极系统，图4为表示反应层及电极系统的对应于图3的部分放大截面图。基板1的电极2及3上形成了亲水性高分子层17和反应层18a。此外，在相当于试样溶液供给通路的顶部的罩盖9的下面形成了反应层18b。图4所示的其他构件与图3所示的相同。
为了便于理解其结构，图1～4所示的生物传感器由过滤片4及5种构件(基板)制得。但是，上罩盖15和过滤片支承板12可由1个构件形成，它们和罩盖9也可由1个构件形成。此外，因第1过滤片4的厚度的不同，可省略过滤片支承板12或过滤片支承部14。
实施方式2图5为进一步改良上述实施方式1的生物传感器的实施方式2的生物传感器的分解立体图。如图5所示，本发明的生物传感器具有由聚对苯二甲酸乙二酯等绝缘性树脂等形成的绝缘性基板101。图5中，通过喷镀法或蒸镀法等在基板101的左侧上面形成钯部分，再利用激光修边形成包含工作极102和配极103的电极系统。电极的面积由后述的在隔板105上形成的狭缝108的宽度决定。
与前述基板101组合的隔板105上形成了构成组装后所得的生物传感器的试样溶液供给通路的狭缝108、狭缝108的入口107及直径小于第1过滤片104的装载第1过滤片104的孔106。此外，在罩盖109上形成了直径小于第1过滤片104的装载第1过滤片104的孔110及空气孔111。
上述实施方式1的过滤片支承板12由1块板状体构成，但实施方式2的过滤片支承板112由过滤片支承板112a、112b及112c构成。
过滤片支承板112a上形成了直径大于第1过滤片104的空隙部113a，过滤片支承板112b上形成直径与空隙部113a相同的空隙部113b和直接支承第1过滤片104的突起的过滤片支承部(突起部)114。此外，过滤片支承板112c的形状与过滤片支承板1 12a相同，形成了空隙部113c。
构成试样溶液滴下部的上罩盖115上形成了与第1过滤片104的上部表面连通的开口部116。
上述基板101、隔板105、罩盖109、过滤片支承板112a、112b、112c及上罩盖115一体化时，与狭缝108连通的孔106、形成于罩盖109的孔110、形成于过滤片支承板112a的空隙部113a、形成于过滤片支承板112b的空隙部113b、形成于过滤片支承板112c的空隙部113c及形成于上罩盖115的开口部116连通。
作为血细胞过滤部的第1过滤片104由玻璃纤维制滤纸形成，具有0.5～5μm的孔径、3mm的直径和500～1000μm的高度(厚度)的圆柱状的形状。构成玻璃纤维制滤纸的纤维被涂上了聚乙烯醇(PVA)。
组装该传感器时，首先基于图5所示的位置关系，在隔板105上装载罩盖109获得合体基板C。如后所述，罩盖109及隔板105合体时由狭缝108形成的凹部(试样溶液供给通路)中形成反应层。此外，基于图5所示的位置关系，在过滤片支承板112a上装载过滤片支承板112b及过滤片支承板112c，并在其上装载上罩盖115获得合体基板D。
基板1及合体基板A按照图5所示的位置关系组合，在连通的孔106及110的正上方设置第1过滤片104。此外，基板1、合体基板C及合体基板D按照右端一致的位置关系组合。
按照图5的构成获得的本发明的生物传感器的简单立体图如图6所示。图6的Y-Y线的截面图如图7所示。
图7中省略了反应层及电极系统，图8为对应于表示反应层及电极系统的图7的部分放大截面图。在基板101的电极系统(102及103)上形成了亲水性高分子层117及反应层118a。此外，在相当于试样溶液供给通路的顶部的罩盖109的下面形成了反应层118b。图8所示的其他构件与图7所示的相同。
为了便于理解其结构，图5～8所示的本发明的生物传感器由第1过滤片104和7种基材制得。但是，罩盖109和隔板105能够由1个构件形成。此外，因第1过滤片104的厚度的不同，可省略过滤片支承板112a及112b或过滤片支承板112b及112c。另外，还可省略过滤片支承部114。
为了用图1～4或图5～8所示的生物传感器对血液中的胆甾醇进行测定，例如，向上罩盖15或115的开口部16或116供给通过穿刺由指尖采集的作为试样溶液的血液。供给的血液从试样溶液供给部侧向第1过滤片内浸透并过滤。然后，作为血细胞以外的滤液的血浆由过滤片的试样溶液供给通路侧渗出。渗出的血浆溶解负载于覆盖电极系统的位置及/或罩盖9或109背面的反应层，填满电极系统近旁，甚至延展到空气孔11或111的整个由狭缝8或108构成的试样溶液供给通路8′或108′。如果填满整个试样溶液供给通路8′或108′，则滴在第1过滤片4或104上的液体停止流动。
作为第1过滤片4或104，较好的是使用具有不连续且不均质的内部结构、具有不均一的孔径分布的过滤片。因此，第1过滤片4或104内部的流路形态最好是不规则的。此外，过滤在过滤片4或104的内部进行。上述实施方式2中，构成过滤片104的纤维上可涂布PVA。
经过上述血细胞过滤的过程，被血浆溶解的反应层和血浆中的测定成分(例如，葡萄糖、总胆甾醇或低密度脂蛋白(LDL)胆甾醇等)发生化学反应，经过一定时间后，通过电极反应测定电流值，能够对血浆中的成分进行定量。
如上所述，图4及8所示的是试样溶液供给通路8′或108′中的电极系统近旁的反应层的配置例。基板1或101的电极系统2及3或102及103上形成了含有羧甲基纤维素(以下简称为CMC)等的亲水性高分子层17或117及含有电子传导体等反应试剂的反应层18a或118a。此外，罩盖9或109和隔板5或105组合而获得的合体基板A或C中，在露出于罩盖9或109的试样溶液供给通路8′或108′的面上，形成了含有氧化还原反应酶的反应层18b或118b。
特别是上述实施方式1中，过滤片支承板12的孔10除了过滤片支承部14之外，不与第1过滤片4接触，这样不会妨碍第1过滤片4的膨胀。因此，不可能破坏试样溶液中的血细胞。
具有图1～4所示结构的生物传感器中，最好前述试样溶液供给通路的宽度在1.5mm以下，高度在150μm以下，长度在4.5mm以下。
本发明的生物传感器的体积最好在0.05μl以上1.0125μl以下。此外，前述电极系统最好由贵金属形成的电极构成。由于前述试样溶液供给通路的宽度最好在1.5mm以下，因此由丝网印刷电极决定的电极面积的精度不佳。但是，贵金属电极能够以0.1mm的宽度进行激光修边处理，这样就能够提高电极面积的确定精度。
特别是实施方式1的生物传感器，如图13所示，第1过滤片4的试样溶液供给通路入口侧的至少一部分可与基板1、隔板5及罩盖9接触，例如，如图14所示，可斜切第1过滤片4的试样溶液供给通路入口侧而设置倾斜部。这样通过在与基板1的接触面设置朝向入口7开口的倾斜部，易于将滤液导入试样溶液供给通路8′中。
此外，如图13所示，前述第1过滤片的试样溶液供给部侧的截面积(F1)最好比前述试样溶液供给通路的入口7的截面积(S1)大。这样就能够获得在传感器的试样溶液供给通路8′内被过滤的血浆达到饱和速度的效果。
如图15所示，前述第1过滤片的试样溶液供给部侧的截面积(F1)最好比前述试样溶液供给通路的入口7侧的与基板1连接的试样溶液供给通路入口侧的截面积(F2)大。这样就能够获得在传感器的试样溶液供给通路8′内被过滤的血浆达到饱和速度的效果。此外，图13～15中省略了基板1、第1过滤片4、隔板5及罩盖9以外的构成要素。
实施方式3本发明的实施方式3的生物传感器具备绝缘性基板，具有设置于前述基板上的测定极和配极的电极系统，至少含有氧化还原酶和电子传导体的反应层，与前述基板连接的含有前述反应层且在终端部具有空气孔的试样溶液供给通路，导入试样溶液的试样溶液滴下部，以及不侵入前述试样溶液供给通路内、设置于前述试样溶液供给通路及试样溶液滴下部之间、且在垂直方向过滤前述试样溶液的第1过滤片；滤液利用毛细管现象被吸入前述试样溶液供给通路内，从前述试样溶液供给通路的入口朝向前述空气孔沿水平方向通过。该传感器的特征是，前述第1过滤片由孔径均一且不变形的薄膜过滤片构成，前述第1过滤片的下部与前述电极系统不接触。
构成薄膜过滤片的材料包括聚酯、聚碳酸酯和硝基纤维素等。通过使用这种薄膜过滤片，可简化所得生物传感器的结构，防止因血细胞混入而出现的测定误差，还能够减少试样用量。
本发明的生物传感器中，作为血细胞分离方法使用了垂直分离方式。前述第1过滤片由具有连续均质的内部结构、均一的孔径及规则的内部流路的薄膜过滤片构成，所以能够发挥几乎100％的捕集率。这种情况下，孔径最好为0.1～10μm，厚度最好为5～30μm。
前述第1过滤片使用玻璃纤维滤纸时，试样溶液在过滤片内部被过滤，过滤片本身吸收了较多的试样溶液，所以需要大量的试样溶液。与此相反，使用薄膜过滤片的情况下，试样溶液在过滤片表面被过滤，过滤片本身不会吸收试样溶液，这样就能够减少所用试样溶液的量。
本发明的生物传感器中，较好的是在前述第1过滤片和前述基板间设置亲水性处理部。
作为试样溶液使用全血时，因过滤而在前述第1过滤片的试样溶液供给通路入口侧渗出的血浆由于毛细管现象通过亲水性层在基板上展开，然后向前述电极系统的方向移动。
然后，血浆从试样溶液供给通路的入口侵入该试样溶液供给通路内，最后到达空气孔而填满整个试样溶液供给通路内部。
与日本专利特愿2001-180362号说明书记载的生物传感器的结构相同，由于前述第1过滤片不侵入前述试样溶液供给通路内，所以前述过滤片与前述基板接触而不与电极系统接触。因此，不会因前述过滤片与电极系统接触而出现测定误差，能够实现稳定的传感器精度。
图18是本发明的较好实施方式的生物传感器的分解立体图。图19是图18所示的生物传感器的合体立体图，图20是图19所示的生物传感器的X′-X′线的纵截面图，省略了反应层等。
如图18所示，本发明的生物传感器由绝缘性基板201、隔板205、罩盖209、双面带219、第1过滤片204及试样溶液滴下部222构成。
绝缘性基板201由聚对苯二甲酸乙二酯等绝缘性树脂构成。在绝缘性基板201的左侧上面通过喷镀法或蒸镀法等形成了钯部分，再利用激光修边形成了包含工作极202及配极203的电极系统。
在绝缘性基板201上形成了空气孔211b，电极系统的面积由后述的形成于隔板205上的狭缝208的宽度决定。此外，对与第1过滤片204接触的绝缘性基板201的右端部分225进行后述的亲水处理。
组装后获得的生物传感器中，与绝缘性基板201组合的隔板205上形成了构成试样溶液供给通路的狭缝208、狭缝208的入口207及装载第1过滤片204的孔206。
此外，在罩盖209上形成了装载第1过滤片204的孔210和空气孔211a，该空气孔211a与罩盖209、隔板205及绝缘性基板201组合时，通过试样溶液供给通路与形成于绝缘性基板201的空气孔211b连通。
配置于罩盖209上面的双面带219上形成了装载第1过滤片204的孔220。这里使用的双面带只要是在与试样溶液滴下部222之间支承起第1过滤片204的同时能够接合试样溶液滴下部222和罩盖209的材料即可。因此，除了双面带之外，还可使用两面具有粘合层的板状体。
在试样溶液滴下部222上形成了与第1过滤片204连通的孔223。
上述绝缘性基板201、隔板205、罩盖209及双面带219一体化时，与狭缝208连通的孔206、形成于罩盖209的孔210及形成于双面带219的孔220连通。此外，如上所述，形成于绝缘性基板201的空气孔211b与形成于罩盖209的空气孔211a连通。
用于分离血细胞的第1过滤片204由薄膜过滤片构成，过滤片所具有的孔的尺寸只要不会通过血细胞即可(例如，5μm)。
此外，本发明的生物传感器在组装前，第1过滤片204具有直径5mm的圆形，装配前形成了凹陷221，组装后的生物传感器如图20所示，配置的第1过滤片204具有近似圆筒状的形状，其上部具有开口部及带沿的边缘部。
组装上述生物传感器时，首先如后所述，在绝缘性基板201的必要的规定部分形成反应层218a。此外，如图18所示，使绝缘性基板201、罩盖209及隔板205的右端对齐组合获得合体基板E，由狭缝208形成的凹状的试样溶液供给通路208′(参考图20)中，如后所述，在规定构件上形成反应层218b。
然后，将合体基板E和双面带219的右端对齐组合制得合体基板F，在连通的孔206、孔210及孔220的正上方设置第1过滤片204。
在粘合第1过滤片204和双面带219时，使用不会对过滤片造成损伤的发泡苯乙烯等制得的圆柱形棒，预先轻轻挤压第1过滤片204的中央部分形成凹陷221。然后，使通过棒的挤压而从孔中露出的边缘部221′(参考图20)与双面带219粘合，整个边缘部221′与双面带219粘合后撤棒。
最后设置试样溶液滴下部222。试样溶液滴下部222所具有的孔223与第1过滤片204的凹陷221相通。
如图20的截面图所示，本发明的生物传感器中，作为试样溶液使用全血时，为了完全除去作为妨碍物质的血细胞，必须使试样溶液通过过滤片204。为使过滤的血浆迅速被吸引并供给至试样溶液供给通路208′，第1过滤片204必须设置在试样溶液供给通路208′的入口207附近，但不要浸入试样溶液供给通路208′内。
图19中省略了反应层及电极系统，图21为表示反应层及电极系统的对应于图20的部分放大图。如图20所示，在基板201的电极202及203上形成了亲水性高分子层224及反应层218a。此外，在相当于试样溶液供给通路的顶部的罩盖209的下面形成反应层218b。
为了便于理解其结构，图18～21所示的生物传感器由5种构件制得，但隔板205和罩盖209形成的合体基板E可由单一的构件形成。
为了利用图18～21所示的生物传感器对血液中的底物(例如，胆甾醇)进行测定，在试样溶液滴下部222的孔223滴下作为试样溶液的血液。滴下的血液中只有血细胞被第1过滤片204的试样溶液供给部侧的上部表面捕集，只有血浆从试样溶液供给通路入口侧的表面渗出。渗出的血浆由入口207侵入试样溶液供给通路208′内，在溶解负载于覆盖电极系统的位置及/或罩盖209背面的反应层的同时填满试样溶液供给通路208′内。
即，从第1过滤片204渗出的血浆填满电极近旁，甚至填满直至空气孔211b及211a的整个试样溶液供给通路208′。液体一旦填满整个试样溶液供给通路208′，第1过滤片204的液体的流动就会停止。
经过上述血细胞过滤的过程，溶解于血浆的反应层和血浆中的测定成分(例如，胆甾醇)发生化学反应，经过一定时间后，通过电极反应测定电流值，便能够对血浆中的成分进行定量。
图21为表示试样溶液供给通路208′的电极系统近旁的反应层及设置于第1过滤片204和绝缘性基板201界面的亲水性层的配置例的纵截面图。
在绝缘性基板201的电极系统上形成了含有CMC等亲水性高分子的亲水性层224及含有电子传导体等反应试剂的反应层218a。
组合绝缘性基板201、罩盖209及隔板205而获得的合体基板E中，在露出于试样溶液供给通路208′的罩盖9的面上形成含有氧化还原反应酶的反应层218b。在绝缘性基板201的右端、即绝缘性基板201和第1过滤片204的接触部分形成含有CMC等亲水性高分子的亲水性层225。
前述电极系统较好为贵金属电极，前述试样溶液供给通路208′的宽度最好在2mm以下，所以由丝网印刷电极决定电极面积的精度不佳。与此相反，使用贵金属电极的情况下，可利用激光修边法进行0.1mm宽度的修边处理，籍此提高电极面积的决定精度。
实施方式4本发明的实施方式4的生物传感器具备绝缘性基板，具有设置于前述基板上的测定极和配极的电极系统，至少含有氧化还原酶及电子传导体的反应层，含有前述基板及前述反应层的试样溶液供给通路，设置于前述试样溶液供给通路的终端部侧的空气孔，导入试样溶液的试样溶液滴下部，以及不侵入前述试样溶液供给通路内、设置于前述试样溶液供给通路及试样溶液滴下部之间、且沿垂直方向过滤前述试样溶液的第1过滤片及位于前述第1过滤片的下游侧的第2过滤片；滤液利用毛细管现象被吸入前述试样溶液供给通路内，从前述试样溶液供给通路的入口朝向前述空气孔沿水平方向通过。该传感器的特征是，前述第1过滤片的平均孔径小于第2过滤片的平均孔径。
如上所述，采用2种以上血细胞分离过滤片的以往技术中，最上面的过滤片用于前处理，最下面的过滤片用于最终的处理，所以最上面的过滤片的孔径不应比最下面的过滤片的孔径小(美国专利第5240862号说明书及国际公开第96/15453号小册子)。
与此相反，本发明的生物传感器中使用第1过滤片和第2过滤片这2种过滤片，第1过滤片的作用是几乎完全分离血细胞，到达第2过滤片的血细胞非常少。第2过滤片的作用是吸收从第1过滤片的试样溶液供给通路入口侧出来的极少量滤液，该滤液供给到试样溶液供给通路。
从孔径较小的第1过滤片向中空的试样溶液供给通路直接供给滤液时如果不施加压力是不可能实现的，但通过在第1过滤片和试样溶液供给通路之间设置第2过滤片，能够完全过滤血细胞，且能够仅将经过第2过滤片的滤液迅速供给到试样溶液供给通路内。此外，能够完全防止血细胞流入试样溶液供给通路内，消除测定误差。
为了利用毛细管现象从第2过滤片迅速向试样溶液供给通路内吸引滤液，试样溶液供给通路的容积非常重要，本发明中最好在2μl以下。一般，毛细管现象是指细管在液体中直立时管内液面在管外液面之上(或之下)的现象。利用液体的表面张力和管壁的互相作用(附着力)的大小，决定被吸入管内的液体量，使用细管时能够比使用粗管时吸收更多的液体到管内。因此，为了将滤液迅速供给到试样溶液供给通路内，试样溶液供给通路最好具有与2μl以下的细管同等的结构。
图24为本发明的较好实施方式的生物传感器的分解立体图。图24所示的本发明的生物传感器具有由聚对苯二甲酸乙二酯等绝缘性树脂形成的绝缘性基板301。图24中，在绝缘性基板的左侧上面通过喷镀法或蒸镀法等形成钯部分，再利用激光修边形成含有工作极302及配极303的电极系统。电极面积由后述的隔板305上形成的狭缝308的宽度决定。
组装后获得的生物传感器中，与绝缘性基板301组合的隔板305上形成了构成试样溶液供给通路的狭缝308、狭缝(试样溶液供给通路)的入口307和装载第2过滤片326的孔306。罩盖309上形成了装载第2过滤片326的孔310和空气孔311a，隔板327上形成了孔320，试样溶液滴下部322上形成了与过滤片304连通的孔323。
上述绝缘性基板301、隔板305、罩盖309及隔板327一体化时，与狭缝308连通的孔306、形成于罩盖309的孔3 10及形成于隔板327的孔320连通。
分离血细胞的第1过滤片304由薄膜过滤片构成，其孔的尺寸(孔径)只要不通过血细胞即可(例如，0.1～5μm)。例如，第1过滤片304被裁成边长6mm的正方形，厚度为0.1～40μm左右。
吸引血浆的第2过滤片326由玻璃纤维滤纸构成，它被裁成直径2.5mm、高(厚)500～1000μm的圆柱状。其孔径最好在0.1μm以上，且比第1过滤片的孔径大。
组装生物传感器时，组合罩盖309和隔板305的情况下，由狭缝308形成的凹陷的试样溶液供给通路308′(参考图26)中，如后所述在规定构件形成反应层后，使绝缘性基板301、隔板305、罩盖309及隔板327的右端对齐组合在一起。
如图24的点划线所示，在孔306、孔310及孔320形成的连通孔设置第2过滤片326。最后，在隔板327上设置第1过滤片305，在其上设置试样溶液滴下部322。试样溶液滴下部322的孔323与第1过滤片305连通。
按照图24的构成获得的本发明的生物传感器的简单立体图如图25所示。图25的X″-X″线的截面图如图26所示。图26中省略了反应层及电极系统等。
如图26的截面图所示，本发明的生物传感器中，为了从作为试样溶液的全血完全除去作为妨碍物质的血细胞，试样溶液必须通过第1过滤片305。被过滤的血浆又迅速被吸引供给到试样溶液供给通路308′，第2过滤片326必须与第1过滤片305及试样溶液供给通路308′的入口307接触。
图26中省略了反应层及电极系统，图27为表示反应层及电极系统的对应于图26的部分放大图。在绝缘性基板301的电极302及303上形成亲水性高分子层328及反应层318a。此外，在相当于试样溶液供给通路308′的顶部的罩盖309的下面形成反应层318b。
为了便于理解其结构，图24～27所示的生物传感器由5种构件制得。但是，隔板305和罩盖309能够由1个构件G形成，它们和隔板327、304及322也可由1个构件H形成。或者，根据第2过滤片326的厚度可除去隔板327。
为了采用图24～27所示的生物传感器测定血液中的胆甾醇，在试样溶液滴下部322的孔323滴下作为试样溶液的血液。滴下全血后，第1过滤片305的试样溶液供给部侧的上部表面仅捕集了血细胞，仅有血浆从第1过滤片的试样溶液供给通路侧的表面渗出。渗出的血浆填满整个第2过滤片326。如果第2过滤片内血浆呈饱和状态，则血浆从入口307侵入试样溶液供给通路308′内，在溶解负载于覆盖电极系统的位置或罩盖309的背面的反应层的同时填满试样溶液供给通路308′。即，从第2过滤片326渗出的血浆填满电极近旁，甚至到达空气孔311a的部分填满整个试样溶液供给通路308′。一旦整个试样溶液供给通路308′被液体填满，则第2过滤片326及第1过滤片305内的液体的流动停止。
经过上述血细胞过滤的过程，被血浆溶解的反应层和血浆中的测定成分(例如，胆甾醇传感器时为胆甾醇)发生化学反应，一定时间过后，通过电极反应测定电流值，能够对血浆中的成分进行定量。
如上所述，图27表示试样溶液供给通路308′的电极系统近旁的反应层的配置例。基板301的电极系统上形成了CMC等亲水性高分子层328及含有电子传导体等反应试剂的反应层318a。此外，组合罩盖309和隔板305的罩盖构件的背面的露出于试样溶液供给通路308′的面上形成了含有氧化还原反应酶的反应层318b。
前述电极系统较好为贵金属电极。前述试样溶液供给通路的宽度最好在2mm以下，所以由丝网印刷电极决定电极面积的精度变差。与此相反，贵金属电极能够以0.1mm的宽度进行激光修边处理，提高电极面积的确定精度。
以下，通过实施例对本发明进行详细说明，但本发明并不仅限于此。
实施例1制作具有图1～4所示的实施方式1的结构、测定对象为总胆甾醇的生物传感器，该传感器的反应层18a中含有电子传导体，反应层18b中含有胆甾醇氧化酶、胆甾醇酯酶及表面活性剂。
首先，在基板1的电极系统上滴下CMC的0.5wt％水溶液5μl，于50℃的温风干燥机中使其干燥10分钟，形成亲水性高分子层17。然后，在亲水性高分子层17上滴下铁氰化钾水溶液4μl(相当于铁氰化钾70mM)，于50℃的温风干燥机中使其干燥10分钟，形成含有铁氰化钾的反应层18a。
在溶解了来自诺卡氏菌的胆甾醇氧化酶(EC1.1.3.6ChOD)及来自假单胞菌的胆甾醇酯酶(EC.3.1.1.13ChE)的水溶液中添加以Triton X-100表示的作为表面活性剂的聚氧乙烯(10)辛基苯醚。将0.4μl的该混合液滴在隔板5和罩盖9一体化而形成的凹部(相当于罩盖9的试样溶液供给通路8′的上侧的部分)，用-196℃的液氮预冷冻后，用冷冻干燥机使其干燥2小时，形成含有450U/ml的胆甾醇氧化酶、1125U/ml胆甾醇酯酶及2wt％表面活性剂的反应层18b(图4)。
获得以LDL胆甾醇为测定对象的生物传感器时，可使用能够选择性地溶解LDL的表面活性剂。这样LDL胆甾醇导入反应系统，能够对LDL胆甾醇进行测定。对于LDL以外的脂蛋白(乳糜、高密度脂蛋白(HDL)、超低密度脂蛋白(VLDL))的酶反应由于受到表面活性剂的抑制，所以这些脂蛋白不会被导入胆甾醇的反应系统中，反应液中残存了脂蛋白。
传感器的各种尺寸较好是狭缝宽0.8mm、狭缝长(试样溶液供给通路的入口至空气孔的长度)4.5mm、隔板5的厚度(基板1到罩盖9的距离)100μm。
在厚约700μm的玻璃纤维滤纸上打上直径2.5mm的圆形孔，制得圆柱状的第1过滤片4。在基板1、隔板5、罩盖9及过滤片支承板12合体制得的孔6、孔10及空隙部13形成的空间设置第1过滤片4。
然后，在过滤片支承板12的上部设置上罩盖14，制得具有图1～4所示结构的生物传感器。
从所得生物传感器的开口部16滴下作为试样溶液的全血10μl或标准血清，180秒后以配极为基准在阳极方向的工作极施加+0.2V的脉冲电压，5秒钟后测定流过工作极和配极之间的电流值，作为其结果的感应特性示于图16。
从图16可明显看出，本发明的传感器能够在总胆甾醇浓度和感应值之间获得良好的线性。
实施例2制作具有图5～8所示的实施方式2的结构、测定对象为总胆甾醇的生物传感器，该传感器的反应层118a中含有电子传导体，反应层118b中含有胆甾醇氧化酶、胆甾醇酯酶及表面活性剂。
首先，在基板101的电极系统上滴下CMC的0.5wt％水溶液5μl，于50℃的温风干燥机中使其干燥10分钟，形成亲水性高分子层117。然后，在亲水性高分子层117上滴下铁氰化钾水溶液4μl(相当于铁氰化钾70mM)，于50℃的温风干燥机中使其干燥10分钟，形成含有铁氰化钾的反应层118a。
在溶解了来自诺卡氏菌的胆甾醇氧化酶(EC1.1.3.6ChOD)及来自假单胞菌的胆甾醇酯酶(EC.3.1.1.13ChE)的水溶液中添加以Triton X-100表示的作为表面活性剂的聚氧乙烯(10)辛基苯醚。将0.4μl的该混合液滴在隔板105和罩盖109-体化而形成的凹部(相当于罩盖109的试样溶液供给通路108′的上侧的部分)，用-196℃的液氮预冷冻后，用冷冻干燥机使其干燥2小时，形成含有450U/ml的胆甾醇氧化酶、1125U/ml胆甾醇酯酶及2wt％表面活性剂的反应层118b(图8)。
获得以LDL胆甾醇为测定对象的生物传感器时，可使用能够选择性地仅溶解LDL的表面活性剂。这样LDL胆甾醇导入反应系统，能够对LDL胆甾醇进行测定。对于LDL以外的脂蛋白(乳糜、HDL、VLDL)的酶反应由于受到表面活性剂的抑制，所以这些脂蛋白不会被导入胆甾醇的反应系统中，反应液中残存了脂蛋白。
在涂布了PVA的玻璃纤维滤纸上打上直径2.5mm的圆形孔，制得第1过滤片104。
然后，在前述基板101和合体基板C上设置第1过滤片104。接着，过滤片支承板112a、112b、112c及上罩盖115一体化而获得的合体基板B粘合于第1过滤片104上，制得具有图5～8所示结构的生物传感器。
从所得生物传感器的开口部116滴下作为试样溶液的全血10μl，180秒后以配极为基准在阳极方向的测定极施加+0.2V的脉冲电压，5秒钟后测定流过工作极和配极之间的电流值，作为其结果的感应特性示于图17。
从图17可明显看出，本发明的传感器能够在胆甾醇浓度和感应值之间获得良好的线性。
实施例3制作具有图18～21所示的实施方式3的结构、测定对象分别为总胆甾醇及LDL胆甾醇的生物传感器，该传感器的反应层218a中含有电子传导体，反应层218b中含有胆甾醇氧化酶、胆甾醇酯酶及表面活性剂。
首先，在基板201的电极系统上及与第1过滤片204接触的面上分别滴下CMC的0.5wt％水溶液，于50℃的温风干燥机中使其干燥10分钟，形成CMC层224及亲水性层225。
然后，在CMC层224上滴下铁氰化钾水溶液4μl(相当于铁氰化钾70mM)，于50℃的温风干燥机中使其干燥10分钟，形成含有铁氰化钾的反应层218a。
在溶解了来自诺卡氏菌的胆甾醇氧化酶(EC1.1.3.6ChOD)及来自假单胞菌的胆甾醇酯酶(EC.3.1.1.13ChE)的水溶液中添加以Triton X-100表示的作为表面活性剂的聚氧乙烯(10)辛基苯醚。将0.4μl的所得混合液滴在露出于罩盖209的试样溶液供给通路208′的部分，用-196℃的液氮预冷冻后，用冷冻干燥机使其干燥2小时，形成含有450U/ml的胆甾醇氧化酶、1125U/ml胆甾醇酯酶及2wt％表面活性剂(HLB值为13～15的例如花王株式会社制乳化剂乳化剂B66或阳离子性表面活性剂)的反应层218b(以总胆甾醇为测定对象的生物传感器)。
第1过滤片204采用在Whatman公司制环微孔薄膜(孔径5.0μm、厚度7.0～23μm)或CORNING公司制滤血薄膜(孔径4.7～5.0μm、厚度11μm)或MILLIPORE公司制等微孔薄膜(孔径5.0μm、厚10μm)上打上直径5mm的圆形孔而形成的过滤片。该薄膜是具有均一孔径及规则的内部流路的连续的均质过滤片，具有约5μm的孔径。
然后，基于图18所示的位置关系，将合体基板E和合体基板F的右端对齐组合，再粘合第1过滤片204，制得具有图18～21所示结构的生物传感器。
在所得生物传感器中的成为试样溶液添加部的孔223中加入作为试样溶液的全血5μl，150秒后以配极为基准在阳极方向的测定极施加+0.2V的脉冲电压，5秒钟后测定流过工作极和配极之间的电流值，其结果示于图22。图22表示试样溶液中的总胆甾醇的浓度和电流的感应值的关系。
从图中可明显看出，本发明的传感器能够在总胆甾醇浓度和感应值之间获得良好的线性。
实施例4本实施例制作具有图18～21所示的实施方式3的结构、测定对象为葡萄糖的生物传感器，该传感器的反应层218a中含有电子传导体及葡萄糖氧化酶。该葡萄糖传感器中未形成反应层218b。
首先，与实施例3同样，形成CMC层224及亲水性层225。此外，在CMC层224上滴下4μl的含有50mM铁氰化钾及250U/ml葡萄糖氧化酶的水溶液，于50℃的温风干燥机中使其干燥10分钟，形成反应层218a。
其他步骤与实施例3相同，制得以葡萄糖为测定对象的本发明的生物传感器。
在所得生物传感器中的成为试样溶液添加部的孔223中加入作为试样溶液的全血5μl，25秒后以配极为基准在阳极方向的测定极施加+0.2V的脉冲电压，5秒钟后测定流过工作极和配极之间的电流值，其结果示于图23。图23表示试样溶液中的葡萄糖浓度和电流的感应值的关系。
从图23可明显看出，本发明的传感器能够在葡萄糖浓度和感应值之间获得良好的线性。
实施例5本实施例制作具有图24～27所示的实施方式4的结构的测定总胆甾醇的生物传感器，该传感器的反应层318a中含有电子传导体，反应层318b中含有胆甾醇氧化酶、胆甾醇酯酶及表面活性剂。
首先，在绝缘性基板301的电极系统上滴下CMC的0.5wt％水溶液5μl，于50℃的温风干燥机中使其干燥10分钟，形成含有CMC的亲水性高分子层324。
然后，在CMC层324上滴下铁氰化钾水溶液4μl(相当于铁氰化钾70mM)，于50℃的温风干燥机中使其干燥10分钟，形成含有铁氰化钾的反应层318a。
在溶解了来自诺卡氏菌的胆甾醇氧化酶(EC1.1.3.6ChOD)及来自假单胞菌的胆甾醇酯酶(EC.3.1.1.13ChE)的水溶液中添加以Triton X-100表示的作为表面活性剂的聚氧乙烯(10)辛基苯醚。将0.4μl的该混合液滴在罩盖309和隔板305一体化而形成的构件G的凹部(狭缝308，即试样溶液供给通路308′)，用-196℃的液氮预冷冻后，用冷冻干燥机使其干燥2小时，形成含有450U/ml的胆甾醇氧化酶、1125U/ml胆甾醇酯酶及2wt％表面活性剂的反应层318b。
将环微孔薄膜(平均孔径5μm、厚度8～23μm、Whatman公司制)裁成正方形制得第1过滤片。将Rapid 24(最大孔径22μm、厚度约340μm、Whatman公司制)裁成圆形制得第2过滤片。
然后，将绝缘性基板301、合体构件G和第2过滤片326一体化组合而成的构件粘合于隔板327、第1过滤片304及试样溶液滴下部322一体化组合而成的构件H，制得具有图24～27所示结构的胆甾醇传感器。
在以上制作的生物传感器的试样溶液滴下部添加作为试样溶液的全血10μl，180秒后以配极为基准在阳极方向的测定极施加+0.2V的脉冲电压，5秒钟后测定流过工作极和配极之间的电流值，其结果示于图28。图28表示总胆甾醇测定传感器的感应值和总胆甾醇浓度的关系。横轴为富士ドライケム的实测值(总胆甾醇浓度)，纵轴为本实施例的感应电流值。
从上述结果可知，未对试样溶液进行前处理直接滴入生物传感器，也能够通过电极系统进行浓度测定，在胆甾醇浓度和感应值之间获得良好的线性。
实施例6本实施例制作具有图24～27所示的实施方式4的结构、以LDL胆甾醇为测定对象的生物传感器。反应层318a中含有电子传导体，反应层318b中含有胆甾醇氧化酶、胆甾醇酯酶及表面活性剂。除了第2过滤片326负载可使LDL以外的脂蛋白、特别是HDL凝集的物质之外，其他步骤与实施例5相同，制得生物传感器，并采用同样方法进行测定。
凝集或吸附HDL的物质包括多孔性二氧化硅或抗HDL抗体。
在第2过滤片326滴下抗HDL抗体和牛血清白蛋白的水溶液，用-196℃的液氮预冷冻后，用冷冻干燥机使其干燥2小时。按照图24所示，制作配有能够捕集血浆中的LDL以外的脂蛋白、特别是HDL的前述第2过滤片的生物传感器。
实施例7本实施例制作具有图24～27所示的实施方式4的结构、以HDL胆甾醇为测定对象的生物传感器。反应层318a中含有电子传导体，反应层318b中含有胆甾醇氧化酶、胆甾醇酯酶及表面活性剂。此外，第2过滤片326中含有凝集HDL以外的脂蛋白的物质。
本实施例中，除了使第2过滤片326负载凝集HDL以外的脂蛋白的物质之外，其他操作与实施例1的方法相同，制得生物传感器。具体来讲，在第2过滤片326上滴下作为凝集HDL以外的脂蛋白的物质的2mM的氯化镁和50mM的磷钨酸，用-196℃的液氮预冷冻后，用冷冻干燥机使其干燥2小时。然后，按照图24所示，制作配有能够捕集HDL以外的脂蛋白的第2过滤片326的生物传感器。
产业上利用的可能性本发明的生物传感器利用重力使试样溶液沿垂直方向过滤，再利用毛细管现象使试样溶液向电极等的测定部移动。所以，不需要压力等就能够迅速供给试样溶液，并进行迅速的测定。此外，由于试样溶液供给通路内不会产生气泡，所以能够进行高精度的测定。即使是在与电极分离的位置负载测定试剂的情况下，也能够使过滤片和测定试剂分别独立组装于本发明的生物传感器，且在制作工艺上比较容易。
由于第1过滤片具有与过滤片支承部不接触的空隙部，所以能够获得没有顺着与过滤片支承部的接触部血液中的血细胞不被过滤而供给到试样溶液供给通路的误差小的生物传感器。
此外，由于第1过滤片的试样溶液供给部侧的截面积(F1)比试样溶液供给通路侧的截面积(S1)大，所以能够获得向生物传感器内迅速供给血浆的效果。第1过滤片的试样溶液供给部侧的截面积(F1)比第1过滤片的与基板连接的截面积(F2)大，所以能够获得向生物传感器内迅速供给血浆的效果。
由于将过滤片实质上未膨胀的薄膜过滤片用于本发明的生物传感器中，所以能够充分过滤血液中的血细胞成分，以高精度测定总胆甾醇等。此外，由于过滤片实质上未膨胀，所以在希望减少试样量的情况下有效。此外，由于在第1过滤片和基板间设置了亲水层，所以通过了前述第1过滤片的试样溶液能够迅速供给到试样溶液供给通路，这样能够缩短测定时间。
另外，由于在第1过滤片和试样溶液供给通路之间设置了第2过滤片，所以通过了前述第1过滤片的试样溶液能够迅速供给到试样溶液供给通路，这样能够缩短测定时间。
权利要求
1.生物传感器，具备绝缘性基板、具有设置于前述基板上的工作极和配极的电极系统、至少含有氧化还原酶和电子传导体的反应层、包含前述电极系统和前述反应层并具有入口和空气孔的试样溶液供给通路、位于与前述试样溶液供给通路分离的位置的导入试样溶液的试样溶液供给部、以及设置于前述试样溶液供给通路和前述试样溶液供给部之间的过滤试样溶液的第1过滤片，由前述第1过滤片过滤的滤液利用毛细管现象被供给入前述试样溶液供给通路内，其特征在于，前述试样溶液通过前述第1过滤片的方向和前述滤液通过前述试样溶液供给通路的方向垂直相交。
2.如权利要求1所述的生物传感器，其特征还在于，在前述第1过滤片的前述试样溶液滴下部侧至前述试样溶液供给通路的入口侧的区域，至少具有1个将前述第1过滤片的表面围一圈的空隙部。
3.如权利要求1或2所述的生物传感器，其特征还在于，前述第1过滤片的前述试样溶液供给部侧的截面积比前述试样溶液供给通路的入口侧的截面积大。
4.如权利要求1～3中任一项所述的生物传感器，其特征还在于，前述第1过滤片的前述试样溶液供给部侧的截面积比前述第1过滤片的前述试样溶液供给通路侧的截面积大。
5.如权利要求1～4中任一项所述的生物传感器，其特征还在于，前述第1过滤片由玻璃纤维或纤维素纤维中的任一种构成。
6.如权利要求1～5中任一项所述的生物传感器，其特征还在于，前述第1过滤片与前述电极系统不接触。
7.如权利要求1～6中任一项所述的生物传感器，其特征还在于，前述第1过滤片的至少一部分与前述绝缘性基板接触。
8.如权利要求1～7中任一项所述的生物传感器，其特征还在于，前述第1过滤片上涂有聚乙烯醇、乙基纤维素、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、琼脂糖、聚丙烯酸及其盐、淀粉及其衍生物、马来酸酐的聚合物及其盐、聚丙烯酰胺、甲基丙烯酸酯树脂及聚-2-羟基乙基甲基丙烯酸酯中的任一种。
9.如权利要求1～8中任一项所述的生物传感器，其特征还在于，前述反应层中包含用于检测总胆甾醇的试剂系统。
10.如权利要求1～9中任一项所述的生物传感器，其特征还在于，前述第1过滤片由薄膜状的具有均一的孔径的薄膜过滤片构成。
11.如权利要求10所述的生物传感器，其特征还在于，在前述第1过滤片与前述基板之间设置了亲水层。
12.如权利要求1～11中任一项所述的生物传感器，其特征还在于，在前述第1过滤片和前述试样溶液供给通路之间还具有第2过滤片。
13.如权利要求12所述的生物传感器，其特征还在于，前述第1过滤片的平均孔径比前述第2过滤片的平均孔径小。
14.如权利要求12或13所述的生物传感器，其特征还在于，前述第2过滤片为深度过滤片。
15.如权利要求12～14中任一项所述的生物传感器，其特征还在于，前述第1过滤片与前述第2过滤片接触。
16.如权利要求12～15中任一项所述的生物传感器，其特征还在于，前述第2过滤片与前述试样溶液供给通路的入口接触。
17.如权利要求12～16中任一项所述的生物传感器，其特征还在于，前述第2过滤片不与前述电极系统接触。
18.如权利要求12～17中任一项所述的生物传感器，其特征还在于，前述第1过滤片和前述第2过滤片的垂直方向下部不存在前述电极系统。
19.如权利要求12～18中任一项所述的生物传感器，其特征还在于，前述第2过滤片的前述试样溶液供给部侧的截面积比前述试样溶液供给通路的试样溶液流过方向的垂直方向的截面积大。
20.如权利要求12～19中任一项所述的生物传感器，其特征还在于，前述第1过滤片及/或前述第2过滤片中包含抑制试样溶液中的高密度脂蛋白、低密度脂蛋白或超低密度脂蛋白中的任一种所含的胆甾醇和前述氧化还原酶的反应的试剂。
全文摘要
本发明提供了经过血液的过滤而获得的血浆能够迅速到达电极系统、具有高精度和良好感应特性的生物传感器。该传感器具备绝缘性基板、具有设置于前述基板上的工作极和配极的电极系统、至少含有氧化还原酶和电子传导体的反应层、包含前述电极系统和前述反应层并具有入口和空气孔的试样溶液供给通路、位于与前述试样溶液供给通路分离的位置的导入试样溶液的试样溶液供给部、以及设置于前述试样溶液供给通路和前述试样溶液供给部之间的过滤试样溶液的第1过滤片，由前述第1过滤片过滤的滤液利用毛细管现象被供给入前述试样溶液供给通路内，前述试样溶液通过前述第1过滤片的方向和前述滤液通过前述试样溶液供给通路的方向垂直相交。
文档编号G01N33/49GK1599865SQ0281112
公开日2005年3月23日 申请日期2002年12月27日 优先权日2002年3月1日
发明者长谷川美和, 山本智浩, 渡边基一, 中南贵裕, 池田信, 吉冈俊彦, 南海史朗 申请人:松下电器产业株式会社