专利名称：一种检测目标微生物和靶分子的检测设备的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种利用免疫电化学方法检测目标微生物和靶分子的检测设备。
本实用新型各部件按照如
图1所示相互连接，其中Y1，Y2，Y3，Y4，Y5，Y6，Y7，Y8，Y9，Y10，Y11，Y12，Y13，Y14，Y15均为三通(参见图4)，I5为二通阀(参见图4)。符号0为四通。图1中直线部分为内径为1mm的管路，其中1和2为二个微型泵(见附图2、3)，各与二个二通阀(在泵的两侧，未标出)相接后，可实现流路内液体流动的正反方向变换。本实用新型所采用的泵和二通阀及三通阀均购买于美国的The lee Company。3为生物敏感元件(见图8和图9)，内部有固定化抗体的膜或玻璃珠，在这里称作反应池。4为样品池(见图12)，内部装有底物α-萘酚磷酸盐。5为电化学检测器(见图11)，由工作电极(W)、参比电极(R)和对电极(C)组成，形成一个流动电解质的电解池。6对应由三氯乙酸配制的洗液。7，17，13，19，20表示与底物缓冲液(pH为9.8的二乙醇胺溶液)相接。8，10，11，15，18(其中10可通过三通Y11与11相通)表示与废液相连。9为PBS溶液。12为待检测样品。14为酶结合物。16为底物溶液。
二通可进行开、关操作。由于每个三通都有一个公共端，与另两端相通，而另两端却不互通，所以三通在流路中的连接对控制内部溶液的走向非常重要。图5是各三通阀的标识图，各阀的端口方向均与图1中各阀的相应位置对应，是一种平移关系。在进行流路安装时，一定要注意所有各阀的A端均为公共端。
图1中泵1与泵2均为可变流量体积的微型泵。每个泵的重量只有300克，流速在0-7500微升/分钟之间可调。这种微型泵完全可以替代蠕动泵。微型泵、阀技术的成熟与商品化，也是我们能够进行自动化、便携式微生物检测器设计的前提之一。
本实用新型检测设备所使用的电化学检测器(图1中的5)，其结构如图10和图11所示，它主要由三部分组成，即工作电极66(W)、参比电极68(R)和辅助电极69(C)。这三个电极的形状一样(见图11中右下侧的电极元件71、72、73)，中间孔径为1mm，柱高12mm，柱外径10mm，其制作方法是在有机玻璃柱的全部表面涂上一层导电材料，工作电极和辅助电极涂上导电碳浆，参比电极涂上一层Ag-AgCl浆，这三个电极组装到一个设计好的有机玻璃腔体内，形成左侧的电化学电极检测器，在中间形成一个流路通道，构成一个流动反应液的电解池。
图中66、68、69为三个电极的引线孔，在实际应用中采用了导电的铜螺丝，拧入三个孔后，分别与71、72、73导电的表面相连接，铜螺丝的外部再分别与恒电位仪相接。各部件的关系是71装入部件65的上部内腔中，然后拧上64，然后72装入67的上部内腔中，65再拧到67上部，接下来73装入67的下面内腔中，70再拧到67的下端上，从而形成了一个电化学检测器。
本实用新型检测设备当中使用的底物样品池(图1当中的4)，其结构如图12所示。该样品池的设计有两方面的目的，一是为了便于流路中样品的充分有效混合，二是为了便于储存底物。图12中74为阀门，在接入流路后打开，在储存时关上，避免底物溢出，也可避免水份等进入。75、76为有机玻璃材料，这两部分可通过螺丝拧合在一起，77对应所指为两部分的螺纹。内腔中间孔柱部分的直径为8mm，上下高8mm，内腔上下总高为20mm。
本实用新型检测设备当中的生物敏感元件反应池和探头的设计方案如下如图8、9所示，图中的检测元件都由有机玻璃材料制成。图8膜元件由55、56、57、58四部分组成，各部分的关系是抗体膜57可放在内壁有一圈平台的底座58内，56为一有锥形孔的有机玻璃柱，可以压在膜的周边上，55为一带有螺纹的有机玻璃罩，可以拧在58(也有螺纹)上，在拧55时，可产生一个向下的压力，使56压紧中间的膜，从而在检测时不致于被水流冲下来。
图9与图8类似，几部分之间也是压接在一起的。在部件62和59内都有一个内壁平台，当下面的圆形不锈钢网60放在62的平台上后，放入圆形孔柱61，其下沿压在底下的钢网周边部分，然后在61的空腔内装入玻璃珠，上面盖上第二个钢网60，接下来盖上部件59，59的螺纹拧到62的螺纹上，59的平台可产生一个向下的压力，使各部件间相互压紧在一起。
两种元件的设计外形尺寸一致，可以在流路的多探头设计中互换。设计元件内膜和玻璃珠与溶液有效接触面的直径为6-8mm。元件内腔高(上下出入口间距)为16mm。玻璃珠层厚为5mm左右，玻璃珠的直径为0.6mm-1mm，固定于两层薄不锈钢丝网之间。
对于上述这两种元件的结构和双锥形几何形状进行如此设计，目的是为了增大膜或玻璃珠与溶液的作用面积，提高酶催化反应的效率和产量，提高灵敏度。另外也有利于彻底的漂洗和反应，使其不存在死角。
对于上述元件，在选用玻璃珠的尺寸上，发明人考虑到相同重量的玻璃珠，珠的直径越小，其表面积与体积比越大，因此，流过小玻璃珠元件的样品溶液中的检测物与玻璃珠表面上抗体结合的概率更大。在兼顾便于抗体固定化操作和元件通透性好的前题下，本实用新型选用了直径0.6mm-1mm的玻璃珠。
本实用新型上述两种元件当中使用的尼龙膜和玻璃珠固相载体表面，需要进行修饰，对于修饰方法的选择，我们考虑了如下因素本实用新型采用孔径为3μm和5μm的尼龙膜(购于美国的Pall Corporation)。根据现有技术报道，可供选用的尼龙膜有两种，一种表面带有羧基(C膜)，另一种带有胺基(B膜)，带有羧基的需用碳二亚胺活化，与抗体形成-CONH-酰胺键的共价连接。而带有胺基的尼龙膜可用戊二醛法与抗体生成亚胺结构-CH＝N-的共价链接，此不饱和键可用NaBH4或NaCNBH3还原，生成-CH2-NH-，这种饱和键要稳定的多。发明人在实验中对两种膜的两种抗体固定化方法进行了研究，结果表明，在控制好实验条件的情况下，二者均能有效用于检测体系。由于本实用新型使用碱性磷酸酶体系，检测工作的pH值为9.8，且在检测过程中需用pH为3-3.5的三氯乙酸洗液漂洗膜片，在这样的酸、碱性条件变化下，通过酰胺键而形成的抗体链接在操作方法不当时可能会水解或部分水解。比如，实用新型人在实验中发现，在用三氯乙酸洗液漂洗膜后，如果接下来在流路内直接泵入pH为9.8的底物缓冲液，就会出现酰胺键的水解，而当在这两个步骤之间加一个pH为7.2的PB缓冲液的泵入操作后，就可避免酰胺键的水解。
对于玻璃珠，本实用新型先进行了胺基化，使玻璃珠表面带有可利用的胺基，后面可用戊二醛法链接抗体，不过需用一个较长的连接臂(linker)，如2HN-PEG-NH2分子量为3400，这样可减少抗体与抗原结合的空间位阻，也可增加抗体的活性。另外一个不用戊二醛的方法是用半氧化状态的葡聚糖(分子量约为4000)法，在这个分子上有丰富的醛基，可直接与抗体和玻璃珠的胺基结合，然后再用还原剂(NaCNBH3)还原，从而使抗体和玻璃珠共价偶联。关于这方面的方法技术参见Biotechnol.Bioengineering，24，1069-1080；J.Biochem.Biophys.Methods 45(2000)211-219；Applied and Environmental Microbiology.Mar.2001.p.1300-1307.除此之外，还可利用Pall Cooperation的另一种载体膜ImmunodyneABC Membrane，这种膜可直接在其表面在中性pH值下以共价方式固定化抗体，非常方便。总之，膜和玻璃珠表面的修饰及抗体的固定化方法已相当成熟，可方便地运用于生物传感器元件的制作中。
上述元件当中的两种免疫载体表面，在检测过程当中会出现非特异吸附现象。因此，需要对免疫载体表面的非特异吸附进行处理。本实用新型采用漂洗的方法进行处理，目的是去除免疫载体表面的非特异性吸附。
同ELISA方法一样，酶结合物的非特异吸附会有严重的干扰作用，主要表现在引起假阳性结果。因此在免疫学检测中，一般采用封闭的方法来防止非特异吸附。同样，采用尼龙膜和玻璃珠为载体的免疫学检测也存在这个问题。采用传统的BSA封闭的方法，在PBS漂洗液中加各种表面活性剂Tween、Triton以及脱脂奶粉封闭等，都没能有效去除非特异吸附。经分析，如果采用常规封闭膜方法，在用于流动液路中时，其封闭效果会受到很大影响。一方面流动相的反复运动对膜的作用不均衡，可能使吸附在膜和玻璃珠表面的封闭剂脱落下来。另一方面，用于检测中的各种溶液的pH值也会变化，这都可能导致封闭剂的脱落。在这种情况下，寻找一种有效的非特异去除方法是必须的。
本实用新型在抗体的固定化中使用了共价结合的方法，所以单纯的物理方法不会洗掉抗体。同时，抗原抗体之间的结合也是非常牢固的，一般的漂洗方法也不能使它们拆分，在这个前提下，本实用新型从漂洗而非封闭的角度来去除非特异吸附。
下面是本实用新型的一种漂洗方法，其出发点是找到一种材料和一个相应的pH值范围，在这个pH值范围之内，抗原抗体的结合不被拆分，而非特异吸附引起的结合作用可以被破坏掉，从而去除非特异吸附。经一系列试验表明，三氯乙酸在一定条件下能满足这一条件。具体方法是配制PB溶液，浓度为30mM，pH为7.2，在其中加入三氯乙酸，使其浓度达到0.6-1M，然后调pH值至3-3.5(抗体固定化载体不同，pH值稍有变化)，即可用作两种载体的漂洗液。三氯乙酸的作用是在一定pH值下改变非特异吸附蛋白的带电性质，从而使其沉淀下来。
本漂洗方法对两种免疫载体都适用。实施例2是对此漂洗液是否有效去除了非特异吸附的验证实验。
如前所述，现有技术中采用尼龙膜在对实际样品进行检测时发生了堵塞现象(见B.C.Weimer，M.K.Walsh，C.Beer，et.a1.，Solid-phase Capture of Proteins，Sporesand Bacteria，Applied and Environmental Microbiology，Mar.2001，vol.67，No.3，1300-1307)。由于膜用于免疫元件中有其优点，如元件易于小型化、表面积与体积比高等，本实用新型在继续采用膜为固定化抗体的前提下，为解决堵塞这个问题，本实用新型通过控制流过免疫膜的反应液和漂洗液的方向变换与流速，可避免滤膜的堵塞问题。具体过程为当免疫滤膜与正向流过的反应液反应时，如果有较大粒子杂质存在，则会吸附在膜的正面上。这样，本实用新型可以控制漂洗液的方向由膜的背面向正向流，并且加大流速，如反应阶段流速通常为几百微升/分钟，漂洗速度可为几毫升/分钟，则吸附堵塞在膜正面的杂质粒子就会被冲洗掉。同时，本实用新型采用大孔径的膜(5微米)也有利于避免膜的堵塞。
下面以单探头直接检测炭疽芽孢为例，就本实用新型检测设备的工作原理说明如下在检测开始之前，反应池(敏感元件)3中有一针对炭疽芽孢的抗体膜(或玻璃珠元件)，当待检样品12由泵1输送通过反应池3时，如果样品中有炭疽芽孢存在，则与固定化抗体生成抗体-芽孢结合物，并就地结合在膜(或玻璃珠)的表面。经漂洗后，再由泵1将酶结合物14输送通过反应池3，与膜上的抗体-芽孢结合物反应，生成抗体-芽孢-抗体-AP结合物。然后，用漂洗液6去除可能存在的非特异吸附，尤其是样品中不含有芽孢时，酶结合物抗体-AP的非特异吸附会引起检测结果的假阳性。下一步是泵1将底物α-萘酚磷酸盐溶液输送(图1中方向向下)通过反应池3，如果有芽孢存在，则形成的抗体-芽孢-抗体-AP结合物上的AP催化α-萘酚磷酸盐水解，产生α-萘酚，后者在通过电化学检测器5时，在工作电位为+350mv下被氧化，并产生相应的电流，作为检测信号。如果样品中没有芽孢，则不会形成抗体-芽孢-抗体-AP结合物，也就不会检测到电流信号。
检测中泵2的作用是自动配制底物溶液和标定检测的本底值，这是本实用新型检测仪器实现全自动化操作设计的一部分。这种设计的考虑基于底物以溶液状态长时间存在有可能会发生自然水解，从而影响检测的准确性。因此，本实用新型将设备设计为在仪器没有工作的情况下，其底物样品池储存于低温下，在执行检测工作之前，随时在检测流路中接入底物样品池(见图12)。在检测过程中由程序控制自动配制底物液。这种作用是通过泵2所在的循环体系来实现的。泵2在循环体系内工作时，将样品池中的底物冲洗到底物缓冲溶液中，达到自动配制溶液的目的。在碱磷酶催化体系中，底物为α-萘酚磷酸盐，其缓冲液为DB(二乙醇胺)溶液，pH为9.8。在混合前，20处只为底物缓冲液，在经过图1中20-Y13-2-Y14-4-20的循环后，20处的底物缓冲液变成了底物溶液，即可达到混合底物液的目的。
另外，底物样品准备系统也有预标定检测本底的作用。即由泵2系统在检测开始之前按泵1进行检测工作时相同的流速标定一个底物溶液的本底电流值，标定时间为检测前的一分钟，标定流路为20-Y13-泵2-Y14-Y12-5-18(waste)。泵1停，泵2检测马上开始。在这个本底值之上的底物催化电流变化作为判定检测结果的可靠依据。
本实用新型设备的全部流路管道内径为0.8-1mm，这样可以节约样品的试剂量。采用高效微型泵替代蠕动泵，减小仪器的体积并提高自动化。各二、三通阀均为微型结构。
为了实现对多种微生物的同时检测要求，可以设计多重组分的检测方法，该方法可以通过将多种抗体固定于单一载体(如膜、玻璃珠)上来实现，也可以通过检测设备的设计而实现，多重组分检测的设计主要涉及以下几种方案1、多种抗体固定于单一载体的方案如果检测系统当中的载体是免疫膜元件，在其免疫膜上同时固定多种抗体(共价结合)，这样当样品中有一种或几种抗原与膜上的抗体相对应，就会产生检测信号。可选择的制备方法有将多种抗体等量均匀混合，在同一条件下同时以共价形式结合到膜上去。(采用美国Pall Cooperation生产的ImmunodyneABC Membrane可方便地实现这一目的，因为这种膜可直接在其表面共价结合抗体而不需任何双功能基团如戊二醛)。
如果检测系统当中的载体是玻璃珠元件，制备方法有其特殊性。可将同一批玻璃珠分成若干份，每一份固定化一种抗体，然后每一种抗体的玻璃珠取相同数量进行均匀混合，装入元件内即可。
在抗体的固定化过程中，固定化一种抗体和固定化几种抗体的反应条件是完全一样的。下述的实施例1描述了单一抗体的固定化过程，用与实施例1完全相同的方法，可以在其它玻璃珠表面固定化对应于其它待检测抗原的抗体。制备好各种固定化抗体的玻璃珠后，均匀混合，即可制备含有多种抗体的玻璃珠元件。
关于尼龙膜的表面抗体固定化方法，参见文献报道(Ihab Abdel-Hamid，DmitriIvnitski，Plamen Atanasov，Ebtisam wilkins，Flow-through immunofiltration assaysystem for detection of E.Coli 0157H7，Biosensors & Bioelectronics14(1999)309-316.)。关于玻璃珠的抗体固化方法，参见本实用新型的实施例1。
2.单通道多探头方案为了实现对多种微生物的同时检测和适应抗体活性满足多次检测的要求，本实用新型还涉及了可以设计多重组分的检测方法，其方案之一是单通道多探头方案。
如图6所示，21、22、23、24为四个免疫检测元件(以膜元件为例)，每一个三通阀有一个公共端。图中，各三通阀的端口方向如下Y16与25相连的左端为公共端；Y18与Y16相连的一端为公共端；Y19与Y18相连的一端为公共端；Y21与Y19相连的一端为公共端；Y23与26相连的左端为公共端；Y17与29相连的一端为公共端；Y20与30相连的一端为公共端；Y22与31相连的一端为公共端；25、26为替换图1中生物敏感元件3的两个流路接口。29、30、31、32为四个小三通，内径为0.8mm。
通过控制各三通阀的开关和走向，可以控制和选择检测时流路的走向，因此能够对其中任一或全部元件进行操作而不互相影响。流路控制举例如下溶液通过全部元件时的流路顺序是-25-Y16-21-29-22-30-23-31-24-Y23-26-；检测21时的流路顺序是-25-Y16-21-29-Y17-27-Y19-28-Y21-32-Y23-26-；检测22时的流路顺序是-25-Y16-Y18-Y17-29-22-30-Y20-28-Y21-32-Y23-26-；检测23时的流路顺序是-25-Y16-Y18-27-Y19-Y20-30-23-31-Y22-32-Y23-26-；检测24时的流路顺序是-25-Y16-Y18-27-Y19-28-Y21-Y22-31-24-Y23-26-；溶液不通过任何元件时的流路顺序是-25-Y16-Y18-27-Y19-28-Y21-32-Y23-26-；虽然图6中所示为四个探头，根据需要可相应增加为四个以上，如八个或更多。每个检测探头是可更换的。下面的说明也以四探头膜元件为例。这种设计在检测中的应用说明如下(1)用于检测一种明确的目标分析物(如炭疽芽孢)在这种使用情况下，21、22、23、24四个元件上都固定有同一种芽孢抗体，则四个元件至少可完成四次相同的检测工作，同时这种设计解决了多次使用中单一元件的抗体活性容易降低的问题。各元件上的抗体是以干态形式存在于固相表面上的，所以它在常温下保持活性的时间要长得多(非工作状态下存放于冰箱内)。
(2)用于检测一种或一种以上可疑的分析物(如某一种生物恐怖试剂，可能为炭疽、鼠疫、天花和土拉中的一种或几种)这种用途可有两种实现方式，一种是在多探头设计中的每个元件上固定化一种抗体，如四探头上固定四种抗体(如分别对应于炭疽、鼠疫、天花和土拉)，在检测时依次进行分别的检测。
另一种方式是，在第一个元件上固定化多种抗体，比如21上面同时有三种微生物的相应抗体，而22、23、24上分别有对应于炭疽、鼠疫、天花的一种抗体。在进行检测时，如果元件21给出阳性结果，则说明存在可疑微生物，则继续检测22、23、24三个元件，进一步确认是哪一种。同样，这种检测功能可以扩展，比如检测八种分析物。
单通道多探头设计比较适用于检测情况下的应用，而对于有监测需要的场合，则需进一步设计双通道多探头的设备。
3、双通道多探头设计本实用新型多重组分检测方法的另一种方案是双通道多探头方案。如图7所示，在图6的基础上进行扩展设计，其左右两侧与图6的结构完全相同。图中53、54为溶液的出入口，Y40和Y41为两个三通，它们与53和54相连的一端为公共端，在检测时，可随时改变流路内溶液的走向，即可在左右两套检测体系间进行转换。其中33、34、35、36、43、44、45、46为八个检测元件，Y24、Y25、Y26、Y27、Y28、Y29、Y30、31、Y32、Y33、Y34、Y35、Y36、Y37、Y38、Y39为三通阀。37、38、39、40、41、42、47、48、49、50、51、52为小硬三通。各三通阀的端口方向是右侧四个与图6中完全相同，左侧各阀的端口方向与右侧成镜像对应关系。
用于监测时，右侧的33、34、35、36四个元件都为多种抗体膜(或玻璃珠)，比如，它们上面都有四种对应于不同抗原的抗体，且四个元件相同。左侧的四个元件43、44、45、46为单一种类抗体膜，每一种元件对应一种抗原。
这套系统用于监测的工作原理是右侧的四个元件依次连续工作，对外部采集送来的样品进行连续检测，当检测到阳性信号后，马上启动左侧检测系统，进一步分析确认是哪一种或几种抗原。因此，从功能上看，这套系统的右侧起到报警的作用，左侧为检测的作用。
用于监测时，检测器连续自动工作的持续时间很重要，这种设计正满足了这种要求。检测顺序为由33至36，如果以每个元件上的抗体活性只能满足一次检测为准，则无需更换元件就能完成四次检测，监测时间大大延长。
本实用新型上述多探头设计的实际应用过程，类似于下述实施例5的多探头循环底物增强信号检测模式操作过程，每一步都涉及各泵、阀的开关转换，由程序自动控制进行。例如，如图7所示，在执行监测任务时，一种含有未知细菌的样品被采集送到此检测器样品池，此时34号元件执行检测任务，于是可进行以下检测步骤泵1工作，将样品泵入并通过34号元件，样品中的未知细菌与元件上的对应抗体结合，再与酶结合物作用后，形成Ab-Ag-Ab-AP夹心结构，与底物作用后，产生的催化水解产物在电化学检测器上氧化，产生电流信号，仪器报警，并启动左侧的检测体系。左侧的四个元件依次检测样品，结果发现只有元件45(假设为炭疽抗体元件)有响应信号，则可断定样品中有炭疽芽孢。其实，这种设计在应用上是很灵活的，比如用于七种分析物的检测在元件33上固定化有七种抗原的抗体，34、35、36、43、44、45、46上分别有对应七种不同抗原的抗体，则这种设计可检测七种不同的抗原。
当图7中两侧通道上的元件个数分别增加到八个时，完成一次连续监测的时间又增加一倍。以一个小时提供一个监测结果为准，则此检测器可完成八个小时的连续自动监测任务。
本实用新型还对监测器的检测信号放大进行了设计，目的在于从流路设计和操作方式上提高检测灵敏度。主要有三种途径一是延长底物溶液与酶作用的时间，增加催化水解产物的浓度，从而提高电化学电极上氧化电流的强度。这种作用的实现是通过泵1所在的左侧循环体系来实现的(见图1泵1-Y5-3-0-Y7-Y6-Y1-泵1)。反应池3敏感元件上的碱性磷酸酶AP(即Ab-Ag-Ab-AP结合物上的AP)不断地催化底物分解，时间越长，循环次数越多，流路中固定体积溶液内产生的催化水解产物浓度越高，从而起到放大检测信号的作用。
第二种途径是延长样品溶液与抗体膜作用的时间。这种方式比较适用于样品量少的情况，在这种情况下，提高样品中待检测抗原与固定化抗体的结合率是提高检测灵敏度的关键。于是对固定体积的样品溶液反复循环通过抗体元件，尽可能多地将有限体积溶液内的抗原结合到抗体膜上。这个过程对应于Ab-Ag-Ab-AP夹心结构中Ag的量增加后，AP的量也相应增加。由于酶量增加会提高底物水解速度和水解产物的量，其结果是水解产物的浓度增大，因此起到放大信号的作用。此过程对应的循环是通过泵1所在的右侧流路体系来实现的(见图1)，为泵1-Y1-Y4-12(菌样)-Y11-Y10-0-3-Y5-泵1。
第三种途径是针对待检测抗原浓度低而溶液量又较大的样品(比如100ml，100cell/ml)，采用滤膜在流路内过滤富集检测物的方法。具体操作是在与样品12和Y4之间加一个大孔径(8μm)滤膜过滤器(图1中没有标出)，同时在Y11与12之间加一个小孔径(如0.22μm)滤膜过滤器(图1中没有标出)，检测样品溶液从Y4进入流路，流经路线(逆时针方向，见图1)样品12-大孔径过滤器-Y4-Y3-Y2-Y15-Y1-1-Y5-10-Y11-小孔径滤器-waste。在这个过滤操作中，样品溶液没有经过反应池3。这样设计的出发点是在泵1高速运转(7ml/min)下，流路内溶液的快速流动不利于固定化抗体与抗原的结合，同时，如此大量的样品溶液也容易在抗体膜上积累杂质吸附物，从而影响抗体的活性。因此，采取过滤的方法将样品溶液中的待检测物首先快速富集在小孔径滤膜过滤器上，然后再用少量PBS(如5ml)溶脱下来并缓速(如0.5ml/min)通过反应池3，使样品中的抗原与固定化抗体高效地结合。
这种操作方式的好处是，即使样品溶液量很大，分析物浓度很低，也会得到快速而灵敏的检测。
上述三种信号放大途径可根据需要结合并用。
本实用新型检测设备样机能自动进样、自动检测及自动清洗流路。为了实现便携，进行了直流(电池)和交流两种电源设计。
设计检测样机的尺寸为43cm×40cm×35cm。该检测器完成一次检测任务的设计时间为30分钟。
如图13所示，其主要结构和功能如下
1)试剂、样品区此部分有7个试剂瓶，体积各为250ml，分别为样品、PBS、洗液、酶结合物、去离子水、底物缓冲液(DB)以及用于配制底物液的底物缓冲液(DB)。它们通过流路管道与检测系统相连。
2)流路检测系统见图1的设计结构，所有的泵、阀以及检测器等都布置在一个面板上面。对于多探头的应用，图6和图7的结构分别设计在另两个独立面板上，在需要时替换图1中的检测器3。替换时，这二块面板的支脚插于图1面板上，并位于它上层。如图14所示。
3)恒电位仪可以从市场上购买，如江苏江分电分析仪器有限公司生产的小型CH-1型恒电位仪(2mA-1PA)。其作用是在检测中设定工作电位，并用于测量电流-时间曲线。
4)可编程控制器可以从市场上购买，如采用松下电工生产的可编程控制器，型号为FP0，经扩展后，可进行32路控制。在检测中，可以对所有泵、阀等的开关、转换进行自动控制。
5)电源可以从市场上购买，如朝阳电源厂生产的型号为4NIC-K48的产品。可提供12、24伏直流电，用于驱动所有的部件。
6)数据采集器主要完成数据的采集工作。同时外加通迅功能。
7)控制面板和显示器可进行参数和指令的输入操作。可进行声光报警。
8)计算机接口可与电脑相连，用于测试中控制程序有关参数的修改和设定。
9)直流电源为满足便携和无交流电源的场合。
10)废液瓶回收由8，10，11，15，18排出的废液。体积为500ml。
本检测器在使用上便于操作，操作者无需具备较深的专业知识，检测过程中只需准备样品和选择检测模式即可使用。
利用本实用新型监测器进行检测，设计了四种检测模式，根据检测目的的不同，可以选择以下不同的检测模式1.直接检测模式这种检测方式无信号放大过程，直接将底物通过敏感元件进行检测。主要适用于含有较高浓度分析物的样品。其实施过程见实施例3。
2.循环底物增强信号检测模式这种检测方式只是在直接检测的基础上增加了一个信号的放大操作，在图1右侧的“1-Y5-3-0-Y7-Y6-Y1-泵1”循环体系内，延长底物液与敏感元件上AP作用的时间，提高催化水解产物的浓度，主要适用于含有待检测物浓度低或量少的样品。详见实施例5。
3.样本富集直接检测模式这种检测方式与直接检测方式基本一样，只是多了一个样品的富集过程。这种方式适用于样品量较大而待检测物浓度又较低的样品，将大量的样品溶液通过敏感元件，其中的待检测物就会较多地结合在敏感元件上。再一个是适用于样品量较少的情况，通过反复循环，提高有限量样品内待检测物的结合率。这两种方式都可以实现放大检测信号的作用。
4.样本富集与循环底物增强信号检测模式这种检测方式是对前两种放大检测方式的结合运用，是一种双重放大响应信号的检测过程。也就是在对样品进行富集之后，再加上一个底物的循环过程。这种检测方式适用于样品内待检物的量极少的情况。
这四种检测模式在使用时，可根据实际情况进行灵活选择和综合运用。
另外，每个检测模式中应有一个流路的检测后清洗程序，每一个检测循环进行一次。可分为两种情况，一为连续检测之间的流路清洗，避免上一次检测中在流路管道内的残留物影响下一次的检测。二为检测任务结束后的彻底清洗，这些过程都由程序自动控制来实现。
本检测系统的设计在应用上具有灵活性，除了可以通过改变相关的操作来完成各种生物靶分子的检测之外，还可以通过改变酶催化体系而用于其它分析物如含磷化学毒剂、含磷农药等的检测，兼用作生物、化学分析物检测的平台。方法原理举例将胆碱酯酶(acetylcholine esterase(AChE))固定于载体膜或玻璃珠上，用氯乙酰硫胆碱(acetylthiocholine chloride(ATCh))作为催化底物，在前者的催化下，后者水解生成硫胆碱(thiocholine)。待检测的含磷化合物为胆碱酯酶的抑制剂，它浓度的大小和量的多少与胆碱酯酶催化活性的降低程度成正比，而胆碱酯酶活性的降低将导致水解产物硫胆碱的相应减少，因此，含磷化合物与硫胆碱的生成量有直接的对应关系。硫胆碱是一种电活性物质，可直接用电化学方法检测它在工作电极上的氧化电流变化[参考文献见Sensors and Actuators，79(2001)48-57]，也可用间接的方法，即，电化学活性催化水解产物硫胆碱也可先经K3[Fe(CN)6]氧化生成K4[Fe(CN)6]，然后再在电位+0.3V下检测[Fe(CN)6]-4在工作电极上氧化生成[Fe(CN)6]-3的电流信号，，从而检测含磷化合物的有无及多少[参考文献Biosensors & Bioelectronics 15(2000)323-329]。检测步骤与下述硫胆碱检测方法基本相同，只是在其中的(1)和(3)中分别增加一个这样的电化学活性底物的转换过程。
用我们所设计的检测系统进行有机磷毒剂和农药的检测时，在操作上较微生物检测更为简便，所利用的检测设备资源也可根据需要相应地减少，或者说可以在检测系统图1的基础上进行重新更为简单的设计。由于是直接对底物进行催化，所以检测步骤也大为减少，从而降低了成本，也加快了检测的速度。
以直接电化学信号检测过程为例，其检测过程大致可分为三步1)标定一个本底催化检测信号值，即在pH为7.5(此pH下胆碱酯酶活性最高)的pB(0.1M)液中加入一定浓度的底物，在经过元件时，水解生成硫胆碱，后者在经过电化学电极时在电位0.7V下被氧化，产生可以检测的电流信号。2)用一定体积的含磷化合物样品溶液通过此元件，此步将降低固定化酶的活性。3)重复步骤1)的过程，得到一个酶活性降低后的催化电流值，然后与步骤1)的电流值比较，根据电流变化的大小计算出磷化合物的浓度。
另外，通过液路和多探头的合理分配，此检测设备可同时具备用于微生物和化学毒剂检测的功能。比如多探头中的一部分接入固定化抗体元件，另一部分接入胆碱酯酶元件，液路中配齐两检测体系所需的各种溶液，就可完成双重检测任务。
另外，还可将DNA探针、PNA探针以及适配子(aptamer)共价结合在本实用新型的两种固相载体其表面上，以用于相关目标微生物和靶分子的检测。
本实用新型与现有技术相比具有以下几个方面的优点1、本实用新型的检测方法已经实现仪器化和自动化。而现有技术只是搭建了一个简单的半自动化的检测装置。
2、本实用新型在设计免疫电化学传感器结构时，将生物敏感元件与电化学检测器分璃设计，如图1所示，反应池3(中间深色为生物敏感元件)与检测器5(电化学电极)是彼此分离的。而现有技术中，二者是紧密结合在一起的。
分离式设计的好处是(1)可以对生物敏感元件单独进行反应、漂洗等操作，从而避免这些操作过程影响电极本身的稳定性。反应液中的某些成分有可能影响电极的性质(如钝化)，所以分离式设计可以避免这一点。
(2)要实现多探头、多通道设计，如果继续采用传统生物传感器中生物敏感元件与换能器(电极)紧密结合的设计方式，就必须有相同多的免疫电化学生物传感器，比如八通道，就要有八个免疫电化学生物传感器，八个检测器上的八套电极引线(每套三根)也需要相应匹配的恒电位仪，流路设计上也变得复杂，结果是成本升高，技术上难以实现。同时，生物敏感元件的更换变得困难。
而采用分离式设计，只需一个电化学检测器，一个恒电位仪，就可满足多通道检测的要求。
本实用新型的这种设计带来的好处是大大扩展和提高了检测器的功能和性能，这种设计方法是对传统生物传感器概念的一个突破。
3.本实用新型优化了用于检测的酶催化体系。现有技术采用的是辣根过氧化物酶(HRP)催化过氧化氢氧化碘化钠生成碘分子的催化体系。由于在没有HRP催化的情况下，过氧化氢也很快氧化碘化钠生成碘分子，这套催化体系不稳定。而本实用新型采用的AP催化体系中的α-萘酚磷酸盐则相当稳定。
4.本实用新型采用了放大信号的流路设计和操作方式，提高了检测灵敏度，所以在检测原始样品方面更具优势。
5.本实用新型实现了底物样品混合的自动化。
6.本实用新型实现了同时检测多种分析物的设计。
7.本实用新型解决了检测器中抗体活性问题(可更换的多探头设计)。
8.本实用新型解决了现有技术中膜易于堵塞的问题。
9.本实用新型解决了流路中固相载体上非特异吸附的问题。
10.本实用新型检测系统的设计在应用上具有灵活性，除了可以通过改变相关的操作来完成各种生物靶分子的检测之外，还可以通过改变酶催化体系而用于其它分析物如含磷化学毒剂、含磷农药等的检测，兼用作生物、化学分析物检测的平台。
上述各种技术和方法的应用，为微生物和其它目标分子检测器的实用化奠定了基础。
图3是本实用新型检测设备所采用的泵的实物图；图4是本实用新型检测设备所采用的二通阀和三通阀的实物图；图5是各三通阀的安装方位图；图6是本实用新型多探头检测设备的单通道四探头设计图；图7是本实用新型多探头检测设备的双通道多探头设计图；图8是本实用新型检测设备所用膜元件及其结构分解图；图9是本实用新型检测设备所用玻璃珠元件及其结构分解图；图10是本实用新型检测设备所用电化学电极检测器的结构示意图；图11是本实用新型检测设备所用电化学电极检测器的结构分解图；图12是本实用新型检测设备所用底物样品池及其结构分解图；图13是本实用新型检测设备样机效果简图；图14是本实用新型检测设备当中多探头与单探头的结构位置关系图。
具体实施方式
实施例1玻璃珠的炭疽芽孢抗体的固定化选取直径为1mm的玻璃珠(中性)5g，装入20mm的试管内，加入分析纯硝酸(68％)至正好没过玻璃珠，在恒温水浴中100℃下加热1h，然后洗净。此步的目的是为了洗净玻璃珠的表面，同时也为了在玻璃珠表面生成大量的-OH基团。
将上述玻璃珠和10％的APTES(3-aminopropyltriethoxysilane)溶液(pH调至4)加在-起，在70℃的水浴条件下，反应3个小时。然后弃去溶液，将玻璃珠在110℃下干燥过夜。用去离子水洗净后，再在80℃烘箱内干燥过夜。此步在玻璃珠表面生成-O-Si-(CH2)3-NH2基团。
在玻璃珠表面生成-NH2后，采用戊二醛共价偶联法偶联抗体。戊二醛的浓度为2.5％(0.03MPBS溶液，pH7.0)，室温下与玻璃珠反应1h，在溶液中加入NaCNBH3(10mg/ml)还原西佛碱(Schiff base)-NH1＝CH1-(CH2)3-CHO， 生成饱和的-NH2-CH2-(CH2)3-CHO，而醛基不被还原。
配PEG-ab(两端带有3-氨基丙基的聚乙二醇，平均分子量3350)PBS溶液为30mg/10ml，加入漂洗后的上述玻璃珠，室温下反应1h，再用NaCNBH3还原。漂洗后，再与戊二醛反应，条件同前。然后再用NaCNBH3还原。此步引入连接臂(Linker，即PEG-ab)，提高固定化抗体与样品中待检测抗原结合的灵活性和有效性。
上述玻璃珠漂洗后，加入到含有兔抗炭疽芽孢IgG的溶液中(0.5ml的PBS中加入15μl浓度为23mg/ml的兔抗炭疽芽孢IgG溶液而得)，室温下反应1h，同样用NaCNBH3还原，漂洗后，放于4℃下保存。
上述所用的linker可以有很多种，如采用半氧化状态的葡聚糖(分子量约为4000)，在这个分子上有丰富的醛基，可直接与抗体和玻璃珠的胺基结合，然后再用还原剂(NaBH4)还原，从而使抗体和玻璃珠共价偶联。
在抗体的固定化过程中，IgG的纯度和效价应足够高，这样才能保证固定化抗体的活性。实施例2漂洗液去除非特异吸附的验证实验首先，取一张空白尼龙膜(孔径5微米)，放入图5的膜元件中，然后将此元件接在蠕动泵流路管的一端。用新买来的山羊抗兔IGg的碱性磷酸酶结合物配制样品，取5微升加入2ml的PBS(0.1M，pH＝7.4，NaCl0.15M)中，然后在泵的作用下，将此溶液以流速为1ml/min的速度全部流过膜片，进完此样品后，再用PB液(pH7.2，0.03M)以流速5ml/min的速度进行漂洗5分钟，结果表明，溶液中的山羊抗兔IGg的碱性磷酸酶结合物几乎全部吸附在膜的表面。证明方法是在蠕动泵流路的出液口端以每30秒一次的频率进行采集样品，然后与取出的膜片一起分别加入底物PNPP，进行显色反应，结果只有膜片很快显示黄色，而其它几个液体样品均不显色。说明存在严重的非特异吸附，同时用PB液无法漂洗掉非特异吸附的酶结合物。
然后，证明三氯乙酸漂洗液的有效性。重复上面的实验过程，各条件都不变，只改变PB液为三氯乙酸漂洗液(0.6M，pH3.5)，用它洗3分钟后，再用PB(pH7.2)液洗3分钟(此步的目的是使膜片所处的环境回到中性的缓冲溶液状态，以利于酶活性的恢复。在pH＝3.5下，酶活性受到拟制)。对取出的膜片进行显色，结果表明非特异吸附去除得很彻底，在2个小时没有观察到的黄色出现。
进一步进行如下实验，以说明三氯乙酸漂洗液没有使酶活性丧失以及没有使检测中形成的固定化抗体-抗原-抗体夹心结构破坏。先在膜的表面将抗体以共价方式结合上去，然后与含有芽孢的样品在流路中反应，再与酶结合物反应，用三氯乙酸漂洗液漂洗后，经PNPP显色，在十分钟时可观察到明显的黄色。
由于三氯乙酸漂洗液是在pH为3-3.5较低的情况下达到较好的漂洗效果的(pH值高于4时，漂洗效果不好)，本实用新型进一步进行了如下对比实验，以说明pH值不是去除非特异吸附的主要原因，先用盐酸直接将上述的PB液(pH7.2，0.03M)调至pH值为3.5，再用柠檬酸和柠檬酸钠(浓度为0.6M)调配成一个pH值为3-3.5的缓冲液，然后用这两个溶液分别替代上述第一步中的PB并重复漂洗实验，结果显示二者皆无法有效去除非特异吸附，取出的膜片在底物PNPP中都很快显色。
因此，三氯乙酸漂洗液的良好漂洗效果应该是在此pH值下三氯乙酸分子与非特异吸附酶结合物(为一种蛋白)发生了特定的作用所致，可能主要是改变了非特异吸附蛋白的带电性质所致。实施例3炭疽芽孢的单探头直接检测如图1所示，反应池(敏感元件)3中有一针对炭疽芽孢的抗体膜(或玻璃珠元件)，在检测开始之前，先由泵2系统在检测开始之前按泵1进行检测工作时相同的流速标定底物溶液的本底电流值，标定时间为检测前的一分钟，标定流路为20-Y13-泵2-Y14-Y12-5-18(waste)，泵1停，泵2检测马上开始。将待检样品12由泵1输送通过反应池3，如果样品中有炭疽芽孢存在，则与固定化抗体生成抗体-芽孢结合物，并就地结合在膜(或玻璃珠)的表面。经漂洗后，再由泵1将酶结合物14(含有碱性磷酸酶AP标记的芽孢抗体反应液)输送通过反应池3，与膜上的抗体-芽孢结合物反应，生成抗体-芽孢-抗体-AP结合物。然后，用漂洗液6去除可能存在的非特异吸附。进一步由泵1将底物α-萘酚磷酸盐溶液输送通过反应池3，如果有芽孢存在，则形成的抗体-芽孢-抗体AP结合物上的AP催化α-萘酚磷酸盐水解，产生α-萘酚，进一步通过电化学检测器5，电化学监测器的工作电位为+350mv，α-萘酚在此电位下被氧化，并产生相应的电流，生成检测信号。记录仪等开始记录并处理数据。实施例4单探头循环底物增强信号模式检测本实施例中带下划线‘—’的部分为流路中导通的标志。以下所有步骤中，Waste表示废液的出口方向，“底缓”代表底物缓冲液。泵正转方向在图1中对应向上。反之亦然。如图1所示，按照下述步骤顺序进行检测1)开机预热1分钟。此时流路内有去离子水(上次使用后所注入)。
去离子水的作用是保持流路内无干扰性电解质，同时也是为了仪器在储存过程中免于腐蚀。
2)泵1工作并反转，PBS注入流路系统。
PBS流经路线PBS-Y4-Y3-Y2-Y15-Y1-1-Y5-3-0-I5-Y9-Y10-Y11-wastePBS的作用是使流路内处于有利于抗原抗体反应的环境。
3)泵1工作并正转，菌样流经路线waste-Y3-Y2-Y15-Y1-1-Y5-3-I5-Y9-Y10-Y11-菌样样品内待检测物(如芽孢)与固定化抗体发生结合作用的过程。
4)PBS漂洗，泵1反转。
PBS-Y4-Y3-Y2-Y15-Y1-1-Y5-3-I5-Y9-Y10-Y11-waste5)进抗体酶结合物(Conjugate)。泵1正转，路线为waste-Y3-Y2-Y15-Y1-1-Y5-3-I5-Y9-Y10-conjugate酶标记抗(Ab-AP)与固定化载体上Ab-Ag发生结合作用的过程。
6)用漂洗液漂洗，泵反转泵1反转，洗液流经路线洗液-Y15-Y1-1-Y5-3-I5-Y9-Y10-Y11-waste此步去除可能的非待异吸附。
7)PBS漂洗，泵1反转。
PBS-Y4-Y3-Y2-Y15-Y1-1-Y5-3-I5-Y9-Y10-Y11-waste此步恢复有利于标记酶催化活性的溶液环境，因为在前面的漂洗液中酶的活性受到拟制。
8)进底缓排气泡泵1反转，底缓-Y2-Y15-Y1-1-Y5-waste9)进底缓泵1反转，底缓-Y2-Y15-Y1-1-Y5-3-Y12-18waste10)进底缓泵1反转，底缓-Y2-Y15-Y1-1-Y5-3-Y7-Y6-waste11)排可能存在的气泡泵1正转，底缓-Y9-I5-3-Y5-1-Y1-Y15-Y2-Y3-waste9)、10)11)、12)几步的操作的安排是为了清除流路内前几步反应时留下的干扰物，同时使其处于有利于酶催化底物水解的底物缓冲液(DB，pH9.8)环境。
12)泵反转，底物-Y8-Y7-Y6-Y1-1-Y5-waste
此步操作是进底物溶液。同时将由进底物时带来的气泡从Y5处排出，以避免进入反应池。
13)泵反转，底物-Y8-Y7-Y6-Y1-1-Y5-3-I5-Y9-Y10-Y11-waste目的是为了使Y7-o-3-Y5-1-Y1-Y6-Y7循环内充满底物溶液。
14)泵正转，Y7-o-3-Y5-1-Y1-Y6-Y7内底物液循环。
15)检测泵1反转，泵2停止工作(泵2体系在泵1体系进行工作时，也在进行底物样品的混合工作，并且在检测开始之前进行了本底的标定)底物-Y8-Y7-Y6-Y1-1-Y5-3-Y12-5-18waste此时，记录仪等开始记录并处理数据，如有阳性检测结果，则进行报警。
在上述各步中，流速和时间是根据需要进行设定和变化的。实施例5多探头循环底物增强信号模式检测如图1和图6所示，待检样品中可能有ABCD四种细菌中的一种或几种，图6中四个元件上分别固定化有相应的四种抗体。每一个元件的检测之前有一个泵2系统标定本底的过程，即由泵2系统在检测开始之前按泵1进行检测工作时相同的流速标定一个底物溶液的本底电流值，标定时间为检测前的一分钟，标定流路为20-Y13-泵2-Y14-Y12-5-18(waste)。然后按照下述步骤进行检测，其中带下划线‘—’的部分为流路中导通的标志，以下所有步骤中，Waste表示废液的出口方向，“底缓”代表底物缓冲液，泵正转方向在图1中对应向上，反之亦然。在1)-11)步骤中，-(25-26)-代表溶液通过图6中全部元件，即-25-Y16-21-29-22-30-23-31-24-Y23-26-。检测步骤如下1)开机预热1分钟。此时流路内有去离子水(上次使用后所注入)。
2)泵1工作并反转，PBS注入流路系统。
PBS流经路线PBS-Y4-Y3-Y2-Y15-Y1-1-Y5-(25-26)-I5-Y9-Y10-Y11-waste3)泵1工作并正转，菌样流经路线waste-Y3-Y2-Y15-Y1-1-Y5-(25-26)-I5-Y9-Y10-Y11-菌样4)PBS漂洗，泵1反转。
PRS-Y4-Y3-Y2-Y15-Y1-1-Y5-(25-26)-T5-Y9-Y10-Y11-waste5)进Conjugate。泵1正转，路线为waste-Y3-Y2-Y15-Y1-1-Y5-(25-26)-I5-Y9-Y10-conjugate
6)用漂洗液漂洗，泵1反转，洗液流经路线洗液-Y15-Y1-1-Y5-(25-26)-I5-Y9-Y10-Y11-waste7)PBS漂洗，泵1反转。
PBS-Y4-Y3-Y2-Y15-Y1-1-Y5-(25-26)-I5-Y9-Y10-Y11-waste8)进底缓排气泡泵1反转，底缓-Y2-Y15-Y1-1-Y5-waste9)进底缓泵1反转，底缓-Y2-Y15-Y1-1-Y5-(25-26)-Y12-waste10)进底缓泵1反转，底缓-Y2-Y15-Y1-1-Y5-(25-26)-Y7-Y6-waste11)排气泡泵1正转，底缓-Y9-I5-(25-26)-Y5-1-Y1-Y15-Y2-Y3-waste上面的1)-11)步与实施例1所述的单探头循环底物增强信号检测模式检测中的对应步骤完全一致。不同是用多探头替代了单探头，而且图6中的元件21、22、23、24在以上的1)-11)步骤中彼此相通(图6中流路导通的各部分为25-Y16-21-29-22-30-23-31-24-Y23-26-)，并进行了完全相同的反应和处理。经过上面的1)-11)步的过程，如果样品中有ABCD中的一种或几种细菌，则应该在相对应的抗体元件表面形成了Ab-Ag-Ab-AP结合物，以下则是对不同元件的分别检测元件21检测有反应，则报警。下述12)一15)步骤当中的-(21)-代表21检测时的流路，在图6中，对应通路为-25-Y16-21-29-Y17-27-Y19-件21的检测步骤如下12)泵反转，底物-Y8-Y7-Y6-Y1-1-Y5-waste此步是在反应池之前排除可能存在的气泡。
13)泵1反转，底物-Y8-Y7-Y6-Y1-1-Y5-(21)-I5-Y9-Y10-Y11-waste此步使流路管道内充满均匀的底物溶液。
14)泵正转，Y7-o-(21)-Y5-1-Y1-Y6-Y7循环，提高催化水解产物的浓度。
15)检测泵1反转，泵2停止工作，底物-Y8-Y7-Y6-Y1-1-Y5-(21)-Y12-5-waste此时，记录仪等开始记录并处理数据。
元件22检测下述16)-20)的检测步骤当中，-(21)-代表对上-次检测流路的清洗，其对应于图6的流路是-25-Y16-21-29-Y17-27-Y19-28-Y21-32-Y23-26-；(-25-26-)代表的流路顺序在图6中是-25-Y16-Y18-27-Y19-28-Y21-32-Y23-26-；-(22)-代表元件22的检测通路，图6中对应于-25-Y16-Y18-Y17-29-22-30-Y20-28-Y21-32-Y23-26-，元件22的检测步骤如下16)清洗上一次检测的流路泵1反转，泵2停止工作。
底缓-Y8-Y7-Y6-Y1-1-Y5-(21)-Y12-waste17)泵1反转，底缓-Y2-Y15-Y1-1-Y5-(25-26)-Y7-Y6-waste此步是为了漂洗图1中的0-Y7部分，以保证流路内无残留的干扰物，如上一次水解产物等。
18)泵1反转，底物-Y8-Y7-Y6-Y1-Y5-(22)-I5-Y9-Y10-Y11-waste19)泵正转，Y7-o-(22)-Y5-Y1-Y6-Y7循环，20)检测泵1反转，泵2停止工作，底物-Y8-Y7-Y6-Y1-Y5-(22)-Y12-5-waste此时，记录仪等开始记录并处理数据。
元件23检测下述21)-26)的检测步骤当中，-(22)-代表对上一次检测流路的清洗，其对应于图6的流路是-25-Y16-Y18-Y17-29-22-30-Y20-28-Y21-32-Y23-26-；(-25-26-)代表的流路顺序在图6中是-25-Y16-Y18-27-Y19-28-Y21-32-Y23-26-；(23)代表元件23的检测通路，图6中对应的流路连通部分为-25-Y16-Y18-27-Y19-Y20-30-23-31-Y22-32-Y23-26-。元件23的检测步骤如下21)清洗流路泵1反转，泵2停止工作，底缓-Y8-Y7-Y6-Y1-1-Y5-(22)-Y12-5-waste23)泵1反转，底缓-Y2-Y15-Y1-1-Y5-(25-26)-Y7-Y6-waste24)泵1反转，底物-Y8-Y7-Y6-Y1-1-Y5-(23)-I5-Y9-Y10-Y11-waste25)泵正转，Y7-o-(23)-Y5-1-Y1-Y6-Y7循环。
26)检测泵1反转，泵2停止工作，底物-Y8-Y7-Y6-Y1-Y5-(23)-Y12-waste此时，记录仪等开始记录并处理数据。
元件24检测下述27)-33)的检测步骤当中，-(23)-代表对上一次检测流路的清洗，其对应于图6的流路是-25-Y16-Y18-27-Y19-Y20-30-23-31-Y22-32-Y23-26-；(-25-26-)代表的流路顺序在图6中是-25-Y16-Y18-27-Y19-28-Y21-32-Y23-26-；-(24)-代表元件24的检测通路，图6中对应的流路连通部分为-25-Y16-Y18-27-Y19-28-Y21-Y22-31-24-Y23-26-。元件24的检测步骤如下27)清洗流路泵1反转，泵2停止工作，底缓-Y8-Y7-Y6-Y1-1-Y5-(23)-Y12-waste28)泵1反转，底缓-Y2-Y15-Y1-1-Y5-(25-26)-Y7-Y6-waste29)泵1反转，底物-Y8-Y7-Y6-Y1-1-Y5-(24)-I5-Y9-Y10-Y11-waste30)泵正转，Y7-o-(24)-Y5-1-Y1-Y6-Y7循环，31)检测泵1反转，泵2停止工作，底物-Y8-Y7-Y6-Y1-1-Y5-(24)-Y12-5-waste此时，记录仪等开始记录并处理数据。
32)清洗流路泵1反转，泵2停止工作，底缓-Y8-Y7-Y6-Y1-Y5-(24)-Y12-5-waste33)泵1反转，底缓-Y2-Y15-Y1-1-Y5-(24)-Y7-Y6-waste检测结束。
权利要求1.一种检测目标微生物和靶分子的检测设备，其特征在于该设备包括两个微型泵(1、2)、一个生物敏感元件(3)、一个样品池(4)、一个电化学检测器(5)、多个三通阀(Y1，Y2，Y3，Y4，Y5，Y6，Y7，Y8，Y9，Y10，Y11，Y12，Y13，Y14，Y15)、一个二通阀(I5)和一个四通阀(0)，生物敏感元件(3)的一端通过一个三通阀(Y5)与泵(1)相连，泵(1)的另一端与三通阀(Y1)相连，此三通阀(Y1)的其中一端连续连接四个三通阀(Y15、Y2、Y3、Y4)，为不同液体提供出入口，生物敏感元件(3)的另一端与一个四通阀(0)相连，该四通阀(0)的一端通过两个三通阀(Y6、Y7)与泵(1)另一端的三通阀(Y1)相连，形成一个回路，上述四通阀(0)的另外两端分别连接一个二通阀(I5)和一个三通阀(Y12)，此三通阀(Y12)的一端与电化学检测器(5)相连，另一端通过一个三通阀(Y14)与泵(2)相连，泵(2)的另一端与一个三通阀(Y13)相连，此三通阀(Y13)的另外两个端各自与底物缓冲液(19、20)相连，上述泵(2)另一端的三通阀(Y14)与样品池(4)相连，样品池(4)的另一端与底物缓冲液(20)相连，形成一个循环流路，上述二通阀(I5)连续连接三个三通阀(Y9、Y10、Y11)，以提供多个液体出入口，其中出入口(10)与Y10和Y11之间的小三通相连，通过三通(Y11)与出入口(11)相通将废液排出，同时通过与12相连形成一个不经过反应池的泵1所在的第二个回路，三通阀(0)相连的四通阀(Y7)的一端再连接一个三通阀(Y8)，以提供两个液体出入口。
2.根据权利要求1所述的设备，其特征在于所说的电化学检测器(5)由工作电极(W)、参比电极(R)和辅助电极(C)组成，形成一个流动电解质的电解池。
3.根据权利要求1所述的设备，其特征在于生物敏感元件(3)被四探头或八探头或多探头检测器所代替，多探头数量的增加通过在四探头或八探头检测器中加入一个或几个免疫元件单元而实现，其中四探头检测器检测器的一端(25)与三通阀(Y5)相连接，另一端(26)与四通阀(0)相连接，以替换生物敏感元件(3)，该四探头检测器由四个免疫检测元件(21、22、23、24)和多个三通阀(Y16、Y17、Y18、Y19、Y20、Y21、Y22、Y23)组成，其中三通阀(Y16)与接口(25)相连的左端为公共端，另外两端分别与免疫检测元件(21)和三通阀(Y18)相连接，四个免疫检测元件(21、22、23、24)之间各以小三通(29、30、31)相连接，其中免疫检测元件(24)通过三通阀(Y23)与检测器接口(26)相连接，此三通阀(Y23)的另一端与一个小三通(32)连接，而小三通(32)分别与另外两个三通阀(Y21、Y22)连接，其中一个三通阀(Y22)与两个免疫检测元件(24、23)之间的小三通31连接，另一个三通阀(Y21)与三通(28)连接，三通(28)的另外两个端口各自连接一个三通阀(Y19、Y20)，这两个三通阀(Y19、Y20)相互连接，其中一个三通阀(Y20)与两个免疫检测元件(22、23)之间的小三通(30)连接，另一个三通阀(Y19)与三通阀(27)连接，三通(27)的另外两个端口各自连接一个三通阀(Y18、Y17)，这两个三通阀(Y18、Y17)相互连接，其中一个三通阀(Y17)与两个免疫检测元件(21、22)之间的小三通(29)连接，另一个三通阀(Y18)与三通阀(Y16)连接；八探头检测器的两个接(53、54)分别与两个三通阀(Y40、Y41)连接，而这两个三通阀(Y40、Y41)的另外两端各连接两个前面所述的四探头检测器，上述的接口(53、54)分别与检测设备的三通阀(Y5)和四通阀(0)相连接，以替换生物敏感元件(3)，上述四探头检测器的四个免疫检测元件(21、22、23、24)或八探头检测器的各个免疫检测元件是可更换的。
4.根据权利要求1所述的设备，其特征在于所说的生物敏感元件有两种膜元件或玻璃珠元件，两种元件的内腔都呈双锥形，以保持中间的膜和玻璃珠在流路内与溶液有较大的接触面积，膜元件由带有螺纹的有机玻璃罩(55)、有锥形孔的有机玻璃柱(56)、抗体膜(57)和底座(58)组成，抗体膜(57)放在内壁有一圈平台的底座(58)内，有机玻璃柱(56)压在膜的周边上，有机玻璃罩(55)拧在有螺纹的底座(58)上，使有机玻璃柱(56)压紧中间的膜(57)；对于玻璃珠元件，其部件底座(62)和带有螺纹的有机玻璃罩(59)内都有一个内壁平台，当下面的圆形不锈钢网(60)放在底座(62)的平台上后，放入圆形孔柱(61)，其下沿压在底下的钢网周边部分，然后在圆形孔柱(61)的空腔内装入玻璃珠(63)，上面盖上第二个钢网(60)，接下来盖上有机玻璃罩(59)，有机玻璃罩(59)的螺纹拧到底座(62)的螺纹上，机玻璃罩(59)的平台可产生一个向下的压力，使各部件间相互压紧在一起，两种元件的设计外形尺寸一致，可以在流路的多探头设计中互换。
专利摘要本实用新型公开了一种检测目标微生物和靶分子的检测设备，检测设备部件包括两个微型泵、一个生物敏感元件、一个样品池、一个电化学检测器、多个三通阀、一个二通阀和一个四通阀，并通过一定的连接关系相连。本实用新型可以对检测样品直接进行检测，无需培养富集，具有检测快速、灵敏和自动化操作的特点。通过多通道、多探头设计，它可同时对多种目标分析物进行检测。
文档编号G01N27/28GK2593195SQ0320091
公开日2003年12月17日 申请日期2003年1月14日 优先权日2003年1月14日
发明者纪军, 杨瑞馥, 王津, 郭兆彪, 周蕾 申请人:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所