专利名称：抗铜二元信号传导系统调控因子突变体及其构建和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子微生物学领域，具体的说是一种抗铜二元信号传 导系统调控因子突变体及其构建和应用。
背景技术：
目前微量元素污染，包括铜污染，已成为一严重的世界性问题。 在生物体内铜能够催化产生有害过氧化物，由此造成生物膜及核酸物 质的损伤，因而铜被用于细菌病的防控。针对此，许多细菌，尤其是 病原菌，都发展出一种或多种抗铜机制。目前已发现的抗铜系统通常
由多个蛋白组成，包括CopA， CopB， CopC， CopD， CopS，和CopR。其 中CopR是一个转录调控蛋白，CopS为一个组氨酸激酶，CopA，B， C， D 等直接参与铜的转运与排除。CopR和CopS构成一个受铜调控的二元信 号传导系统；在没有铜时，CopR和CopS皆无生物活性；当铜存在时， CopS被激活，成为有活性的激酶；激活后的CopS通过磷酸化CopR5' 端的一个靶位点而激活CopR;激活后的CopR则调控c(^4，S， C， Z)等 基因的表达。由于CopR调控主要抗铜元素的表达，是信号传导通路中 的关键因子，因而其表达与活性皆受到严格调控。破坏这种调控，使 得C叩R活性失调，尤其是具功能活性的CopR的持续性存在，导致细 菌毒力的减弱，这主要是因为具活性的的CopR将激活co;^，A C， D 等的表达，造成CopA，B， C, D等蛋白的大量合成；由于这些蛋白能够 在细胞膜上形成外排泵，使得胞内物质流失以及能量的大量消耗，从 而消弱细菌的生长和侵染能力。
发明内容
本发明目的在于提供一种抗铜二元信号传导系统调控因子突变体 及其构建和应用。
为实现上述目的，本发明釆用的技术方案为 一种抗铜二元信号传导系统调控因子突变体为序列表SEQ ID No. 1
中的碱基序列。
突变体的构建方法 l)质粒pLCl构建以质粒pEGFP为模板，PF1和PR4为引物进行 PCR扩增，扩增产物与质粒pBS-T连接，得质粒pBSLl;质粒pBSLl 与质粒pBR322用EcoRI/BamHI双酶切后分别回收l楊p和3986bp片 段；将该两段片段用T4DNA连接酶连接，得质粒pBLl;将质粒pBLl 用BamHI酶切回收4. 3kb片段，回收片段与Linker - 1连接即得质粒 pLCl; 所述弓l物PF1为5， - ATAGAATTCATTTAAATGCAGCTGGCACGA -3',
PR4为5， - GGATCCACACAACATACGAGC -3，；
2) 质粒LC104构建以荧光假单胞菌TSS1为模板，CRF19和CRR9 为引物和Pfu DNA聚合酶进行PCR扩增，产物纯化后与步骤1)所得质 粒pLCl用Smal酶切后回收的片段连接，连接液转入大肠杆菌后在含 安卡青霉素、IPTG和Xgal的LB培养基上培养，筛选转化子提取质粒， 即为质粒LC104 ; 其中所述引物 CRF19为 5 '-
ATCATGAAATTGGCTGGTTTGG -3， ， CRR9为5， - GATATCTTATTCCGACCCCGTC
-3，；
所述荧光假单胞菌TSS1保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普 通微生物中心CGMCC,保藏编号为CGMCC No. 2329,保藏时间2008 年1月9曰。
3) 质粒pJR20的构建将质粒pDN18用EcoRI/BamHI酶切，回收 7. 8kb片段与T4DNA连接酶进行连接，连接液转化入大肠杆菌DH5 oc后 在含有四环素的LB固体培养基上培养，筛选转化子提取质粒，即为 pJR20;
4) 质粒pJC104的构建将步骤2)所得质粒pLC104用Swal酶切， 回收650bp片段；步骤3)所得质粒pJR20用Swal酶切，回收7. 8kb 片段；将两段回收片段T4DNA连接酶连接，连接液转化入大肠杆菌DH5 oc后在含四环素的LB固体培养基上培养，筛选转化子提取质粒，即为 能够表达具有序列表SEQ ID No. 1中的碱基序列的抗铜二元信号传导 系统调控因子突变体的质粒pJC104。
突变体的应用所述抗铜二元信号传导系统调控因子突变体具有降 低细菌毒力的作用。
本发明具有如下优点
1. 本发明的非调控型抗铜系统调控因子突变体具组成型活性，不 受铜的影响。
2. CRC104的表达方法稳定有效。本发明的方法能够使CRC104在
细菌中长期稳定存在。
3. 具潜在的病害防治应用性。本发明通过CRC104在荧光假单胞菌 中持续性表达而显著降低细菌毒力，因而在病害控制中有应用潜能。
4. 本发明中的CRC104为一种人工筛选的CopR突变体，具功能活 性但不具备5'端磷酸化调控位点，所以其活性不依赖于铜。CRC104 在荧光假单胞菌中持续性表达能够显著降低细菌毒力，因而其在病害 防治上具有应用潜能。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行 举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。
在本发明实施例中所涉及到的常规性实验方法均釆用如下方法1. 质粒提取、DNA(PCR)产物纯化、DNA片段从凝胶中回收、细菌基 因组DNA提取皆使用"天根生化科技(北京)有限公司"的相应试剂盒。
2. 质粒、DNA连接液转化进入大肠杆菌皆用Hanahan方法 (Sambrook and Russel 1: Molecular Cloning: A Laboratory Mamiual.
Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001 );
3. 所有限制性内切酶和连接酶皆购自于"纽英伦生物技术有限公 司"，北京。
实施例1
抗铜二元信号传导系统调控因子突变体为序列表SEQ ID No. 1中的 碱基序列。
抗铜二元信号传导系统调控因子突变体的构建 l)质粒pLCl的构建 以lOOng质粒pEGFP (购自于美国Cbnetech公司)为模板，用下列
弓l物(各0. 5uM)进行PCR: PF1 (5， - atagaattcatttaaatgcagctggcacga -3 ，，划线碱基为 EcoRI和Swal位点)，PR4 (5 ，-GGATCCACACAACATACGAGC _3，， 划线碱基为BamHI位点)；PCR条 件为在94。C60s预变性模板DM,然后94°C 40s， 54°C 60s， 72°C 60s, 5个循环后改为94°C 40s， 60°C 60s， 72°C 60s, 25个循环后再在72°C 延伸反应lGmin条件下进行PCR扩增。PCR产物用天根DNA产物纯化试 剂盒纯化后与载体PBS-T (购自于"天根生化科技有限公司"，北京) 于室温连接2-3小时，连接混合液转化大肠杆菌DH5oc后在含有100 ug/ml安卡青霉素Up)、 40ug/ml Xgal (5-溴-4-氯-3-吲哚-P -D-乳 糖苷)和24 ug/ml异丙基-P-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的LB固体培养 基上培养18-20小时，筛选出白色转化子，即为质粒pBSLl。将pBSLl 与质粒pBR322(购自"纽英伦生物技术有限公司"，北京)用EcoRI/BamHI 双酶切后分别回收140bp和3986bp片段；将该2片段用T4DNA连接酶 于室温连接2 - 3小时，连接液转化入大肠杆菌DH5 a后在含有安卡青 霉素(Ap， 50ug/ml )的LB固体培养基上培养18-20小时，筛选出白
色转化子，挑取1个转化子，提取质粒，测序验证为正确重组质粒。 将该质粒命名为pBLl。将pBLl用BamHI酶切回收4. 3kb片段，将该片 段 与 Linker — 1 ( 序 歹'J :5， -
atcc-3，(购自上海生工生物工程技术服务公司)，用T4DNA连接酶于室 温连接2 - 3小时，连接液转化入大肠杆菌DH5 a后在含有Ap( 50ug/ml ) 的LB固体培养基上培养18-20小时，筛选出白色转化子，挑取l个转 化子，提取质粒，测序表明其为正确重组质粒。将该质粒命名为pLCl。 所述LB组成成分按重量百分比计1.0%蛋白胨，0.5%酵母粉，1.0% 氯化钠，97. 5%蒸馏水。 2) 质粒pLC104的构建
以lul荧光假单胞菌TSS1为模板，用引物CRF19、 CRR9(分别为 0.5uM)和PfuDNA聚合酶(5U)进行PCR扩增;PCR条件为:94。C 60s 预变性模板DNA，然后940C 40s， 52。C 60s, 72flC 60s, 5个循环后改 为94。C40s， 56°C60s， 72°C 60s, 25个循环后再在72°C延伸反应10min。 PCR产物用天根DNA产物纯化试剂盒纯化。将步骤1 )所得质粒pLCl 用Smal酶切，回收4. 3kb片段；将该片段与上述纯化的PCR产物用 T4DNA连接酶于室温连接2-3小时，连接液转化入大肠杆菌DH5a后 在含有Ap (50ug/ml)的LB固体培养基上培养18-20小时，筛选出白 色转化子，挑取1个转化子提取质粒，测序表明其为正确重组质粒。 将该质粒命名为pLC104。
所述弓i物CRF19为 5' - ATCATGAAATTGGCTGGTTTGG -3， , CRR9为5， -GATATCTTATTCCGACCCCGTC —3，，戈寸线碱基为EcoRV位点)，所述荧光假
单胞菌TSS1保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 CGMCC，保藏编号为CGMCCNo. 2329,保藏时间2008年1月9曰，分 类命名焚光j戸i单胞菌尸seudofflo12as /7iJorescei!S。
3) 质粒pJR20的构建
质粒pDN18 (Marx， C. L &Lidstrom. M. E. (2001) Development of improved versatile broad—host range vectors for use in methylotrophs and other Gram-negative bacteria. Aficrob!'o_/ogy 147， 2065 2075.)用EcoRI/BamHI酶切，回收7. 8kb片段；将该片段 与Linker — 2序歹寸为5， _ GAATTCATTTAAATGTTTAAACGGATCC-3，(购自 上海生工生物工程技术服务公司)，用T4DNA连接酶于室温连接2 - 3小 时，连接液转化入大肠杆菌DH5a后在含有15ug/ml四环素(Tc )的LB 固体培养基上培养18-20小时，筛选出白色转化子，挑取l个转化子提取 质粒，测序表明其为正确重组质粒。将该质粒命名为pJR20。 4)质粒pJC104的构建
将步骤2)质粒pLC104用Swal酶切，回收650bp片段；将步骤3 ) 质粒pJR20用Swal酶切，回收7.8kb片段。将两片段用T化NA连接酶 于室温连接2-3小时，连接液转化入大肠杆菌DH5cx后在含有Tc (15ug/ml )的LB固体培养基上培养18-20小时，筛选出白色转化子， 挑取1个转化子提取质粒，测序表明其为正确重组质粒。即为具有序 列表SEQ ID No. 1中的碱基序列的抗铜二元信号传导系统调控因子突 变体pJC104。 序列表SEQ ID No. 1为(a) 序列特征 參长度315 bp *类型碱基序列 *链型单链 *拓扑结构线性
(b) 分子类型双链DNA
(c) 假设否
(d) 反义否
(e) 最初来源荧光假单胞菌
(f) 特异性名称CRC104 实施例2
与实施例l不同之处在于
突变体的构建D质粒PLC1的构建PCR扩增产物纯化后与载体 pBS-T (购自于"天根生化科技有限公司"，北京)于室温连接3-4小 时，连接混合液转化大肠杆菌DH5cx后在含有100 ug/ml安卡青霉素 (Ap)、 40ug/ml Xgal(5-溴-4-氯-3-吲哚-乳糖苷)和24 ug/ml 异丙基-P -D-硫代半乳糖苷(IPTG)的LB固体培养基上培养20-24小 时，筛选出白色转化子，即为质粒pBSLl。将pBSLl与质粒pBR322 (购 自"纽英伦生物技术有限公司"，北京)用EcoRI/BamHI双酶切后分别 回收140bp和3986bp片段；将该2片段用T4DNA连接酶于室温连接3 -4小时，连接液转化入大肠杆菌DH5oc后在含有安卡青霉素(Ap, 50ug/ml)的LB固体培养基上培养20-24小时，筛选出白色转化子提 取质粒，将该质粒命名为pBLl。将pBLl用BamHI酶切回收4. 3kb片段， 将该片段与Linker-1，用T4DNA连接酶于室温连接3 - 4小时，连接 液转化入大肠杆菌DH5a后在含有Ap (50ug/ml )的LB固体培养基上 培养20-24小时，筛选出白色转化子提取质粒，将该质粒命名为pLCl。
2) 质粒pLC104的构建将步骤l)所得质粒pLCl用Smal酶切， 回收4. 3kb片段与纯化的PCR产物用T4DNA连接酶于室温连接3-4小 时，连接液转化入大肠杆菌DH5cc后在含有Ap (50ug/ml)的LB固体 培养基上培养20-24小时，筛选出白色转化子提取质粒，将该质粒命 名为pLC104。
3) 质粒pJR20的构建质粒pDN18用EcoRI/BamHI酶切，回收7.8kb 片段；将该片段与Linker-2用T4DNA连接酶于室温连接3-4小时，连 接液转化入大肠杆菌DH5cx后在含有15ug/ml四环素(Tc )的LB固体培 养基上培养20-24小时，筛选出白色转化子提取质粒，将该质粒命名为 pJR20。
4)质粒pJC104的构建将两片段用T4DNA连接酶于室温连接3-4 小时，连接液转化入大肠杆菌DH5a后在含有Tc ( 15ug/ml )的LB固
体培养基上培养20-24小时，筛选出白色转化子提取质粒，即为具有
序列表SEQ ID No. 1中的碱基序列的抗铜二元信号传导系统调控因子 突变体pJC104。 实施例3
抗铜二元信号传导系统调控因子突变体所述抗铜二元信号传导系 统调控因子突变体具有对荧光假单胞菌降低细菌毒力的作用。
调控因子突变体在荧光假单胞菌TSS1中的表达
1 )菌株TSSl/pJC104和TSS1/JR20的构建将调控因子突变体质 粒pJC104转化入大肠杆菌Sm兀(购于西班牙"Biomedal"公司)后 在含有Tc (15ug/ml )的LB固体培养基上培养18-24小时，挑取1个转 化子，命名为S17入兀/pJC104。将TSS1和S17X兀/pJC104在LB液体培养 基中过夜培养，然后将二者以体积比为1: 3比例混合(总体积lml ), 将混合液离心(5000g, 4°C, 10min),收集菌体；将菌体悬浮于lml LB 液体培养基中，取0. lml置于固体LB培养基上于30t保温6 - 8小时， 而后将细菌悬浮于lml液体LB，取0. lml在含有Ap ( 50ug/ml )和Tc (15 ug/ml)的LB固体培养基上培养24 - 30小时，挑取1个转化子， 命名为TSSl/pJC104。 TSS1/JR20的构建同上。
2) 调控因子突变体质粒pJC104表达检测将TSSl/pJC104和 TSS1/JR20分别于LB培养基中28。C摇动培养至OD,0. 7,用SV Total RNA提取试剂盒(购于美国"Promega"公司)提取总RNA。用荧光定 量PCR试剂盒(购于Takara )和ABI 7300实时荧光定量PCR仪(A卯l ied Biosystems)进行PCR反应，检测调控因子突变体质粒pJC104在 TSSl/pJC104和TSS1/JR20中的表达。结果表明调控因子突变体质粒 pJC104在TSSl/pJC104中的表达比在TSSl/pJR20中升高了 75倍。
3) 调控因子突变体质粒pJC104表达对细菌毒力的影响将 TSSl/pJC104和TSS1/JR20分别于LB培养基中28。C摇动培养至OD鋼 0.5,离心(5000g, 4°C， 10min)收集菌体；将菌体悬浮于PBS ( pH 7. 4 ) 中至终浓度为lx108 cfu/ml,分别命名为TSSl/pJC104悬浮液和 TSS1/JR20悬浮液。将44条牙鲆随机分为A和B两组，每组22条。A 组每条鱼腹腔注射0. lml上述TSSl/pJC104悬浮液，B组每条鱼腹腔注 射O. lml上述TSSl/JR20悬浮液，在14天内观察每组鱼的死亡数。结 果表明A组的总死亡率为31.2%， B组的总死亡率为68. 2%,说明调 控因子突变体质粒pJC104表达显著(P < 0. 01)降低了细菌的毒力。 其中PBS组成成分为0. 8gNaCl， 0. 02g KC1， 0. 358g Na2HP04. 12H20， 0. 024g NaH2P04 ( pH 7. 4 )。
序列表
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院海洋研究所
<120〉抗铜二元信号传导系统调控因子突变体及其构建和应用
<130〉
〈160〉 1
<170〉 Patent.In version 3. 1
<210> 1
<211> 315
<212> 腿
<213〉荧光假单胞菌
<220>
<221〉 CRC104
<222〉 (1).. (315) <223〉
<400〉 1 atgaaattggctggtttggaggtggacctcctcaaacgcagggttatccgcgcaggcaaa60
cgtatagatctaacggccaaagagcttgcgttgctcgaattgctgctccgtcgtcgaggc120
gaggttctgcccaagtcgcttattgcttcccaggtct,gggacatgaactttgaca.gcgat180
actaacgtcatcgaggttgctgtcagg鄉c1xagagcaatgatt.t,tgag240
gtcaagcttatccacacctctcgaggcatggggtacatgctggatgcgccggsttcgggg300
acggggtcgg31权利要求
1.一种抗铜二元信号传导系统调控因子突变体，其特征在于为序列表SEQ I D No.1中的碱基序列。
2. —种按权利要求1所述的抗铜二元信号传导系统调控因子突变 体的构建方法，其特征在于1) 质粒pLCl构建以质粒pEGFP为模板，PF1和PR4为引物进行 PCR扩增，扩增产物与质粒pBS-T连接，得质粒pBSLl;质粒pBSLl 与质粒PBR322用EcoRI/BamHI双酶切后分别回收140bp和3986bp片 段；将该两段片段用T4DNA连接酶连接，得质粒pBLl;将质粒pBLl 用BamHI酶切回收4. 3kb片段，回收片段与Linker - 1连接即得质粒pLCl;所述引物PF1为5， — ATAGAATTCATTTAAATGCAGCTGGCACGA -3，， PR4为5， - GGATCCACACAACATACGAGC "3，；2) 质粒LC104构建以荧光假单胞菌TSS1为模板，CRF19和CRR9 为引物和Pfu DNA聚合酶进行PCR扩增，产物纯化后与步骤1)所得质 粒pLCl用Smal酶切后回收的片段连接，连接液转入大肠杆菌后在含 安卡青霉素、IPTG和Xgal的LB培养基上培养，筛选转化子提取质粒， 即为质粒 LC104 ; 其中所述引物 CRF19 为 5 ，-ATCATGAAATTGGCTGGTTTGG -3， ， CRR9为5， - GATATCTTATTCCGACCCCGTC-3，；3) 质粒pJR20的构建将质粒pDN18用EcoRI/BamHI酶切，回收 7.8kb片段与T4DNA连接酶进行连接，连接液转化入大肠杆菌DH5 a后 在含有四环素的LB固体培养基上培养，筛选转化子提取质粒，即为 pJR20;4) 质粒pJC104的构建将步骤2)所得质粒pLC104用Swal酶切， 回收650bp片段；步骤3)所得质粒pJR20用Swal酶切，回收7. 8kb 片段；将两段回收片段T4DNA连接酶连接，连接液转化入大肠杆菌DH5 a后在含四环素的LB固体培养基上培养，筛选转化子提取质粒，即为 能够表达具有序列表SEQ ID No. 1中的碱基序列的抗铜二元信号传导 系统调控因子突变体的质粒pJC104。
3. —种按权利要求1所述的抗铜二元信号传导系统调控因子突变 体的应用，其特征在于所述抗铜二元信号传导系统调控因子突变体 具有降低细菌毒力的作用。
全文摘要
本发明涉及分子微生物学领域，具体地说是一种抗铜二元信号传导系统调控因子突变体及其构建和应用。抗铜二元信号传导系统调控因子突变体为序列表SEQ ID No.1中的碱基序列。其表达方法将以荧光假单胞菌TSS1为模板，用引物CRF19和CRR9 PCR扩增所得产物连接表达质粒pLC1得质粒pLC104，后者经SwaI酶切与质粒pJR20连接得质粒pJC104，后者转化入荧光假单胞菌TSS1得菌株TSS1/pJC104。本发明所得调控蛋白是一种突变型荧光假单胞菌抗铜系统调控因子，其在致病性荧光假单胞菌TSS1中的表达能够显著降低细菌的毒力。
文档编号C12N15/31GK101348522SQ200810138848
公开日2009年1月21日 申请日期2008年8月1日 优先权日2008年8月1日
发明者黎 孙, 敏 张, 胡永华 申请人:中国科学院海洋研究所