专利名称：一种基于电荷耦合装置的在线自校正激光诱导荧光检测方法
技术领域：
本发明涉及一种激光诱导荧光共聚焦检测方法，具体地说涉及了一种在线自校正微量分析激光诱导荧光检测方法及系统以及与该检测器联用的液相色谱仪、毛细管电泳仪和芯片电泳仪及检测方法。
背景技术：
激光诱导荧光(LIF)检测是所有检测方法中灵敏度最高的方法之一，激光诱导荧光检测的光学系统分为非共聚焦和共聚焦两种，现在常用的是共聚焦的激光诱导荧光检测。商品仪器中使用的激光器一般价格比较昂贵、使用寿命不长、结构和操作也相对复杂。半导体激光器(或称激光二极管)以其价格低、体积小、寿命长、稳定可靠的优势迅速引起了人们的注意。商品化半导体激光器(一般大于630nm)已广泛使用，近年来可稳定使用的400--415nm短波长蓝绿激光器已经推向市场。发射波长在荧光染料集中的400～500nm区域的半导体激光器在LIF研究中不但具有很强的实际应用价值，而且具有极大的发展潜力。
在光电检测器件中，有光电倍增管(PMT)，普通或增强型电荷耦合器件(CCD或ICCD)、和高灵敏度的光子记数器等。由于PMT应用早，技术比较成熟，所以应用范围最广，常见于文献报道和商品化的检测器，优点是灵敏度比较高，但是价格高，对外界杂散光和不稳定的激发光源带来的的影响非常敏感，所以检测系统不得不完全避光或者置于避光的装置内，并稳定激光强度。普通CCD主要用于检测荧光成像，或者将整个图像荧光强度作为检测的对象；ICCD的主要优点在于提高对光信号的敏感度和信噪比，但是在已有的文献报道中应用这两种光电转化器件时难以解决外界杂散光和不稳定的激发光源带来影响的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种在线自校正的激光诱导荧光检测方法和使用该检测方法的高效液相色谱仪、毛细管电泳和芯片电泳仪和相应的高效液相色谱检测方法、毛细管电泳检测方法和芯片电泳检测方法。
为实现上述目的，本发明采用采用比较经济的器件；在采集程序上，在荧光采集区的非样品区增加了一个参比光校正区，以此来扣除外界干扰光的影响。
本发明提供了一种基于电荷耦合装置的在线自校正激光诱导荧光共聚焦检测方法光电转换器件产生的电信号经由计算机采集后，用视频信号中的非样品区光强作为参比光信号，采用参比光校正的方法，扣除样品光强中的背景光干扰信号。
具体来说由激光光源发出的激光通过滤光片照射到半透半反镜，反射后的光通过显微镜的物镜聚焦后照射到样品区，样品受激发产生的荧光又通过该物镜收集，并透过半透半反镜后到达光电转换器件，光电转换器件产生的电信号经过信号转换装置转换成数字信号，再由计算机软件采用参比光校正的方法来扣除背景光的干扰信号，并作出谱图。
所述的参比光校正的方法具体来说，可以是首先获取视频数字信号并显示，然后选取视频信号的样品区和非样品区；在开始荧光信号采集时，由实时显示视频图象并实时累加某一时间点视频信号中非样品区的光强作为参比光信号值，同时累加该时间点视频信号中样品区的光强作为样品光信号值，将样品光信号值按选取面积的比例扣除掉参比光信号值作为该时间点实际检测的荧光信号值，记录该时间点的时间值和该荧光信号值，将荧光信号值显示在谱图中该时间点的相应位置，然后继续采集下一个时间点的视频信号和荧光信号值，直至到设定的采集时间结束或被中断，从而实时地显示视频图象并记录和显示由各时间点检测到的荧光信号值绘制的谱图。
可以应用本发明上述方法的一种激光诱导荧光检测系统是由激光源、显微光学系统、光电转换器件、信号转换装置以及计算机处理记录系统组成；由激光源发出的激光通过滤光片照射到半透半反镜，一部分光反射并通过显微镜的物镜，聚焦后照射到毛细管或芯片的样品检测区，样品受激发产生的荧光又通过该物镜收集，并沿竖直方向到达半透半反镜，一部分光线透过后再沿竖直方向到达光电转换器件，产生的视频电信号传输到计算机内的视频捕捉卡，被转换成数字信号，由自校正视频荧光检测计算机程序对视频数字信号处理时，选取视频信号中的非样品区光强作为参比光信号，对样品光信号进行校正，使记录的荧光信号数据对周围光线的干扰不敏感，并实时地给出样品在通道内的荧光和样品的分离谱图。
上述的显微光学系统可以是普通的光学显微镜或倒置显微镜，或其它含精密三维光学调节装置的显微光学平台。
上述的激发光源可以是普通激光器、半导体激光器等小型激光器。
上述的光电转换器件为电荷耦合器件(CCD或ICCD)。
上述的模数转换器件是与自校正视频荧光检测计算机程序相匹配的视频捕捉卡或其它模/数转换电路卡。
自校正视频荧光检测计算机程序根据上述方法编制，能够对视频数字信号进行处理，可以选取参比光区域对样品光信号进行校正，实时地给出样品在通道内的荧光和样品的分离谱图。
上述检测系统用于液相色谱分析仪器，是将液相色谱流通池光通道固定在本检测系统的光通道上的样品位置上，流通池的两端分别接色谱柱或者流动相出口，色谱柱的另一端与高压泵相连接。
上述毛细管电泳仪，将毛细管的检测窗口固定在本检测系统的样品位置上，毛细管的两端可以分别接样品或者缓冲溶液，并分别用铂丝与高压电源的两极相连。
上述微流控芯片分析仪器，将加工有微通道的微流控芯片的检测窗口固定在本检测系统的样品位置上，微通道的两端可以分别接样品或者缓冲溶液，并分别用铂丝与高压电源的两极相连。
本发明提供的检测器既可以单独使用进行微量分析可以和液相色谱仪以及毛细管电泳、微流控芯片联用，进行实时在线检测。使用时只要将样品区调节到检测位置，即可使用自校正视频荧光检测计算机程序来获取所需要的样品区荧光光强随时间变化的谱图。
上述在线自校正的激光诱导荧光检测方法可以用于液相色谱检测，其方法是使用基于电荷耦合装置的激光诱导荧光检测，并且在电荷耦合装置采集到的视频信号中选取非样品区光强作为参比光信号，采用参比光校正的方法，扣除样品光强中的背景光干扰信号。
上述在线自校正的激光诱导荧光检测方法可以用于毛细管电泳检测，其方法是使用基于电荷耦合装置的激光诱导荧光检测，并且在电荷耦合装置采集到的视频信号中选取非样品区光强作为参比光信号，采用参比光校正的方法，扣除样品光强中的背景光干扰信号。
上述在线自校正的激光诱导荧光检测方法可以用于微流控芯片检测，其方法是使用基于电荷耦合装置的激光诱导荧光检测，并且在电荷耦合装置采集到的视频信号中选取非样品区光强作为参比光信号，采用参比光校正的方法，扣除样品光强中的背景光干扰信号。
图1共聚焦LIF检测系统的原理2自校正视频荧光检测计算机程序的界面图3亚甲蓝和耐尔蓝的在毛细管电泳-LIF分离谱4亚甲蓝和耐尔蓝的芯片电泳-LIF分离谱5亚甲蓝间接检测小檗碱的芯片电泳-LIF谱6亚甲蓝间接检测L-苯丙氨酸的微芯片电泳-LIF谱7亚甲蓝间接检测小牛胸腺DNA的微芯片电泳-LIF谱图具体实施方式
下述实施例有助于理解本发明，但并不限制本发明的内容。
本发明激光诱导荧光检测器基本结构如图1所示。(1)为激光光源；(2)为激光光路的固定和校准装置；(3)、(7)均为滤光片；(4)为半透半反镜；(5)为显微镜的物镜；(6)为分离通道；(8)为光电转换器件，可以是CCD或ICCD；(9)为视频捕捉卡或者其它模/数转换电路卡；(10)、(11)为计算机及处理程序；(12)、(13)分别是所选的荧光检测区和参比光区；(14)为计算机的软件界面输出；(15)为检测信号反馈给计算机来运算；(16)为计算机输出的谱图。其中(1)～(8)均固定在光学显微平台上。
其工作原理光路由光源(1)发出的光经(2)校准固定后，通过滤光片照射到半透半反镜(4)，一部分光反射并通过显微镜的物镜(5)，聚焦后照射到毛细管或芯片(6)的样品区，样品受激发产生的荧光又通过该物镜(5)收集，并沿竖直方向到达半透半反镜(4)，一部分光线透过后再沿竖直方向到达CCD(或ICCD)(8)，CCD(或ICCD)产生的电信号传输到视频捕捉卡，信号被转换成数字信号，由软件处理，作出实时谱图。
自校正视频荧光检测计算机程序的原理和使用所编制的自校正视频荧光检测计算机程序首先获取视频数字信号并显示在计算机屏幕上，然后选取视频信号的样品区和非样品区，并设定程序参数(如对比度、亮度等)。在开始荧光信号采集时，实时显示视频图象并实时累加某一时间点视频信号中非样品区的光强作为参比光信号值，同时累加该时间点视频信号中样品区的光强作为样品光信号值，将样品光信号值按选取面积的比例扣除掉参比光信号值作为该时间点实际检测的荧光信号值，记录该时间点的时间值和该荧光信号值，将荧光信号值显示在谱图中该时间点的相应位置，然后继续采集下一个时间点的视频信号和荧光信号值，直至到设定的采集时间结束或被中断，从而实时地显示视频图象并记录和显示由各时间点检测到的荧光信号值绘制的谱图。该程序还可以通过点击谱图选项(如谱图显示参数和谱图处理参数)区域对谱图进行翻转、平滑、求导、积分等操作来获取其中组分峰的参数。
使用时，先将荧光收集镜头调在适当位置，对准荧光检测区，在程序界面上选择荧光的检测区域，并在非样品光区域选择参比光区域，调整程序的其他各项参数，即可开始采集。程序界面示意如图2。上部分图中的灰白色小矩形代表选定的荧光区域和参比光区域，两条直线代表通道。下部分图中显示的是荧光谱图，其中横坐标是时间(分钟)，纵坐标是荧光强度。
实施例一毛细管电泳-激光诱导荧光分离检测亚甲蓝和耐尔蓝的混合溶液取一定长度的毛细管，烧制合适大小的检测窗口，将毛细管固定在显微平台上，调节显微平台，将检测窗口至于光路中恰当的位置。在软件界面上选择荧光的检测区域，并在非样品光区选择参比光区域，调整程序的其他各项参数。将毛细管的两端浸入缓冲液中，并通过铂丝电极与高压电源的两端分别相连。先用缓冲溶液冲洗毛细管，然后将进样端的缓冲溶液换成样品溶液，进样后，将进样端又换成缓冲溶液，施加一定的电压进行电泳分离，同时让自校正视频荧光检测计算机程序开始采集。
分离条件激光器630nm半导体激光器；荧光收集物镜×10/0.25，滤光片720nm截止型滤光片样品亚甲蓝2.0×10-5M，耐尔蓝2.0×10-5M，20mM磷酸盐缓冲液配制，pH2.7进样电动进样15.0KV，10.0s毛细管总长35.0cm，有效分离长度27.5cm分离电压15.0KV，电流～41.0μA亚甲蓝和耐尔蓝的毛细管电泳-激光诱导荧光谱图如图3所示。
实施例二微芯片电泳-激光诱导荧光分离亚甲蓝和耐尔蓝的混合溶液将微芯片固定在显微平台上，调节显微平台，将检测窗口至于光路中的样品检测位置。在软件界面上选择荧光的检测区域，并在非样品区选择参比光区域，调整程序的其他各项参数。事先将缓冲液手工滴入通道中，并通过铂丝电极与高压电源的两端分别相连。先用缓冲溶液冲洗分离通道，然后将样品溶液滴入进样槽，电进样一段时间后，将进样槽的样品液快速用缓冲溶液冲洗干净，然后在进样槽内滴入缓冲溶液，施加一定的电压进行电泳分离，同时让自校正视频荧光检测计算机程序开始采集。
激光器630nm半导体激光器；荧光收集物镜×10/0.25，滤光片720nm截止型滤光片样品亚甲蓝2.0*10-5M，耐尔蓝2.0*10-5M，20mM磷酸盐缓冲液配制，pH2.7进样电动进样0.5KV，15.0s通道总长50mm，有效分离长度40mm电压0.50KV，电流～17.0μA亚甲蓝和耐尔蓝的微芯片电泳-激光诱导荧光谱图如图4所示。
实施例三微芯片电泳-半导体激光诱导荧光间接检测小檗碱操作同实施例二。
激光器630nm半导体激光器；荧光收集物镜×10/0.25，滤光片720nm截止型滤光片背景缓冲液2.0*10-5M亚甲蓝(pH3.00，5mM磷酸盐缓冲液配制)样品2.0*10-5M，纯蒸馏水配制进样0.50KV，5.0s运行0.50KV，～0.9μA通道总长50mm，有效分离长度40mm
在此条件下，小檗碱的最低检测浓度是2.0*10-7M亚甲蓝间接检测小檗碱的微芯片电泳-激光诱导荧光图如图5所示。
实施例四微芯片电泳-半导体激光诱导荧光间接检测L-苯丙氨酸操作同实施例二。
激光器630nm半导体激光器；荧光收集物镜×10/0.25，滤光片720nm截止型滤光片背景缓冲液2.0*10-5M亚甲蓝(pH3.00，5mM磷酸盐缓冲液配制)样品0.01M(pH3.00，5mM磷酸盐缓冲液配制)进样0.50KV，5.0s运行0.50KV通道总长50mm，有效分离长度40mm亚甲蓝间接检测L-苯丙氨酸的微芯片电泳-激光诱导荧光谱图如图6所示。
实施例五微芯片电泳-半导体激光诱导荧光间接检测分离小牛胸腺DNA操作同实施例二。
激光器630nm半导体激光器；荧光收集物镜×10/0.25，滤光片720nm截止型滤光片背景缓冲液2.0×10-5M亚甲蓝(pH7.0，20mM磷酸盐缓冲液配制)样品3.5mg/ml(pH7.0，20mM磷酸盐缓冲液配制)进样0.50KV，15.0s运行电压-0.50KV通道总长50mm，有效分离长度40mm亚甲蓝间接检测小牛胸腺DNA的微芯片电泳-激光诱导荧光谱图如图7所示。
权利要求
1.一种基于电荷耦合装置的在线自校正激光诱导荧光检测方法，其特征在于光电转换器件产生的电信号经由计算机采集后，用视频信号中的非样品区光强作为参比光信号，采用参比光校正的方法，扣除样品光强中的背景光干扰信号。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于由激光光源发出的激光通过滤光片照射到半透半反镜，反射后的光通过显微镜的物镜聚焦后照射到样品区，样品受激发产生的荧光又通过该物镜收集，并透过半透半反镜后到达光电转换器件，光电转换器件产生的电信号经过信号转换装置转换成数字信号，再由计算机软件采用参比光校正的方法来扣除背景光的干扰信号，并作出谱图。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述的参比光校正的方法是首先获取视频数字信号并显示，然后选取视频信号的样品区和非样品区；在开始荧光信号采集时，由实时显示视频图象并实时累加某一时间点视频信号中非样品区的光强作为参比光信号值，同时累加该时间点视频信号中样品区的光强作为样品光信号值，将样品光信号值按选取面积的比例扣除掉参比光信号值作为该时间点实际检测的荧光信号值，记录该时间点的时间值和该荧光信号值，将荧光信号值显示在谱图中该时间点的相应位置，然后继续采集下一个时间点的视频信号和荧光信号值，直至到设定的采集时间结束或被中断，从而实时地显示视频图象并记录和显示由各时间点检测到的荧光信号值绘制的谱图。
4.一种激光诱导荧光检测系统，其特征在于该检测系统由激光源、显微光学系统、光电转换器件、信号转换装置以及处理记录系统组成。
5.如权利要求4所述的检测系统，其主要特征在于，所述的激光源是激光器；所述的显微光学调节系统是普通光学显微镜、倒置光学显微镜或者精密的三维光学调节平台；所述的光电转换器件为电荷耦合器件(CCD或ICCD)；所述的信号转换装置是视频捕捉卡或其它模/数转换电路卡；所述的处理记录系统是计算机及其软件。
6.如权利要求4所述的检测系统，其主要特征在于，用自校正视频荧光检测计算机程序对视频数字信号处理时，选取视频信号中的非样品区光强作为参比光信号，对样品光信号进行校正，并可以实时地给出样品在通道内的荧光和样品的分离谱图。
7.一种液相色谱分析仪器，将液相色谱流通池固定在权利要求4、5或6的检测系统上，流通池的两端分别接色谱柱或者流动相出口，色谱柱的另一端与高压泵相连接。
8.一种液相色谱检测方法，其特征是使用基于电荷耦合装置的激光诱导荧光检测，并且在电荷耦合装置采集到的视频信号中选取非样品区光强作为参比光信号，采用参比光校正的方法，扣除样品光强中的背景光干扰信号。
9.一种毛细管电泳仪器，其特征是将毛细管的检测窗口固定在权利要求4、5或6的检测系统上，毛细管的两端可以分别接样品或者缓冲溶液，并分别用铂丝与高压电源的两极相连。
10.一种毛细管电泳检测方法，其特征是使用基于电荷耦合装置的激光诱导荧光检测，并且在电荷耦合装置采集到的视频信号中选取非样品区光强作为参比光信号，采用参比光校正的方法，扣除样品光强中的背景光干扰信号。
11.一种微流控芯片分析仪器，其特征是将加工有微通道的微流控芯片的检测窗口固定在权利要求4、5或6的检测系统上，微通道的两端可以分别接样品或者缓冲溶液，并分别用铂丝与高压电源的两极相连。
12.一种微流控芯片检测方法，其特征是使用基于电荷耦合装置的激光诱导荧光检测，并且在电荷耦合装置采集到的视频信号中选取非样品区光强作为参比光信号，采用参比光校正的方法，扣除样品光强中的背景光干扰信号。
全文摘要
一种基于电荷耦合装置(CCD)的在线自校正激光诱导荧光检测方法及其在色谱、毛细管电泳和芯片电泳分析中的应用。本发明提供的激光诱导荧光检测方法利用激光诱导样品产生荧光的特性，直接采用CCD(或ICCD)作为检测元件，将CCD(或ICCD)采集到的视频模拟信号转变为数字信号，用自校正视频荧光检测计算机程序对视频数字信号处理时，利用视频信号中的非样品区光强作为参比光信号，采用参比光校正的方法，扣除样品光强中的背景光干扰信号，使记录的荧光信号数据对周围光线的干扰不敏感，从而可以在不增加硬件的前提下降低背景噪音干扰信号，实现对样品浓度稳定可靠的检测。该装置具有经济实用的特点。可用于高效色谱、毛细管电泳、微流控芯片分离方法的在线联用检测分析。
文档编号G01N21/64GK1595117SQ20041002527
公开日2005年3月16日 申请日期2004年6月18日 优先权日2004年6月18日
发明者许旭, 高红军, 乔善磊, 王前, 柴逸峰 申请人:中国科学院上海有机化学研究所, 中国人民解放军第二军医大学