专利名称：家蚕成品卵中微粒子病病卵及病卵率的检测方法
技术领域：
本发明涉及一种生物病害的检测方法，具体涉及一种家蚕的微粒子病的检测方法，尤其是家蚕的成品卵中微粒子病病卵率的分子生物学检测方法。
背景技术：
家蚕微粒子病是由微孢子虫感染所引起的一种传染性蚕病，该病具有胚种传染性，是蚕种生产中威胁最严重的传染性蚕病。
为了制造无毒蚕种，减少胚种传染的危险，现有技术中，通常对母蛾进行检测。1870年，巴斯德首次提出了母蛾显微镜检验法，分别对每一母蛾进行检验，通过淘汰有毒母蛾所产蚕卵的方法杜绝胚种传染，该方法在蚕种生产实践中已应用了100多年，对家蚕微粒子病的控制起了不可估量的作用。然而，单蛾检验工作量大，时间紧，满足不了蚕种生产发展的要求。1968年，日本人提出了集团母蛾检验法(30蛾/集团)，根据概率学原理计算母蛾的带毒率，大大提高了检测效率，减轻了劳动强度，缩短了检测时间。1979年日本农林水产省编的《微粒子病检查指南》中规定病蛾率0.5％为危险率。80年代初，我国开始采用集团母蛾检验方法，1997年，农业部发布桑蚕一代杂交种检验规程(NY/T327-1997)，规定了母蛾检验操作规程和判别标准。
然而，母蛾检验只是蚕种生产过程中的中间检验或者可称为过程检验，并不能正确反映蚕种的带毒率。一方面，蚕种的带毒率不仅与母蛾的带毒率有关，而且与母蛾的微粒子病的感染时期、发病时期、发病的严重程度、蚕品种有关，用母蛾带毒率表达蚕种的带毒率不够科学；另一方面，由于经济利益的驱动，采用过程检验方法，蚕种生产企业送检母蛾难以保证其代表性。因此，用种单位、蚕种检验部门要求进行成品卵检验的呼声越来越高。
农业部在桑蚕一代杂交种检验规程(NY/T327-1997)中也颁布了家蚕成品卵检验的规定和判别标准，该规程规定1个检验集团为100粒左右蚕卵，采用显微镜镜检法，根据有无微孢子虫判别该集团是否带毒。然而，在实践中，该方法操作比较困难。在蚕卵中，微孢子虫的数量远低于母蛾中的数量，采用显微镜镜检法，其检出率远低于母蛾中微孢子虫的检出率，错判率高，并且，对检测人员的技术水平要求高。为解决这一问题，现有技术中，将蚕卵催青孵化，对蚁蚕进行检验，由此可以判定成品卵的带毒率。但这一过程通常需要10天左右，检验周期长，有时难以满足实际成产需要；同时，对蚁蚕进行显微镜镜检，通常只能检出孢子状态的微孢子虫，必须用特殊的染色方法，才能检出裂殖子状态的微孢子虫，因而实际操作中得出的成品卵带毒率并不准确。
发明内容
本发明的第一发明目的是提供一种检测灵敏度高、检测周期短的家蚕成品卵中微粒子病病卵的检测方法；本发明的第二发明目的是提供一种检测灵敏度高、检测周期短的家蚕成品卵中微粒子病病卵率的检测方法。
为实现本发明的第一发明目的，采用的技术方案是一种家蚕成品卵中微粒子病病卵的检测方法，首先提取待检家蚕成品卵内的总DNA；根据家蚕微孢子虫的基因的特异性序列，设计并合成一对特异性引物，二引物之间的间隔为0.5-2.0kb，以提取的待检家蚕成品卵内的总DNA为模板，进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测，当检出家蚕微孢子虫的特异性基因片段时，判定待检家蚕成品卵为微粒子病病卵。
上述技术方案中，与现有的显微镜镜检法主要依靠人工观测不同，采用的是分子生物学的检测方法，由于目前家蚕微孢子虫的许多基因序列片段均已明了，本领域的普通技术人员根据引物设计规律，即可设计、制备针对某一基因序列片段的特异性引物；当然，为保证检测结果的正确性，选定的微孢子虫的特异性引物，应当与蚕的DNA序列无特异性；同时，扩增片段的长度即特异引物间的间隔会影响到检测，选取特异引物间的间隔过短，难以用普通琼脂糖电泳法进行鉴别，必须采用复杂的电泳检测方法，例如聚丙烯凝胶电泳法，造成检测成本过大，选取特异引物间的距离过长，又会导致PCR扩增时所需时间过长，因此确定引物之间的间隔在0.5-2.0kb之间。
上述技术方案中，对待检家蚕成品卵先进行预处理，所述预处理包括，用碱液处理15-30分钟，用水清洗，再用酸液中和，再用水清洗；所述总DNA的提取过程包括，在蚕卵中加入微孢子虫发芽诱导液，匀浆后常温下诱导0.5小时至2小时，再用发芽缓冲液处理至少20分钟，用蛋白酶K在37℃至50℃下消化蛋白质，抽提分离，再用RNA酶降解RNA，抽提去除RNA酶后，用无水乙醇沉淀DNA，并溶于水中；所述特异性引物长度在15-30bp，所述对扩增产物的检测方法采用琼脂糖凝胶电泳法。预处理的目的，一方面是使蚕卵的卵壳软化，以便于DNA的提取，另一方面可以使蚕自身的DNA发生降解，减少蚕自身DNA对PCR的干扰；由于微孢子虫在蚕卵中可处于孢子状态，其DNA的提取不便，易导致检测灵敏度降低，为解决这一问题，由微孢子虫发芽诱导液先进行诱导，再用发芽缓冲液处理，可促使微孢子虫发芽形成芽体，从而便于对其DNA的提取。对于蛋白酶K处理过后的抽提分离可用饱和酚、酚/氯仿的混合物、氯仿抽提；对RNA降解后的抽提通常采用酚/氯仿的混合物。
为实现本发明的第二发明目的，采用的技术方案是一种家蚕成品卵中微粒子病病卵率的检测方法，包括下列步骤(1)蚕卵的预处理取80-120粒家蚕成品卵为一个集团，用碱液处理15-30分钟，用水清洗，再用酸液中和，再用水清洗；(2)DNA的提取在上述处理过的蚕卵中加入微孢子虫发芽诱导液，匀浆后常温下诱导0.5小时至2小时，再用发芽缓冲液处理至少20分钟，用蛋白酶K在37℃至50℃下消化蛋白质，抽提分离，再用RNA酶降解RNA，抽提去除RNA酶后，用无水乙醇沉淀DNA，并溶于水中；(3)PCR扩增根据家蚕微孢子虫的基因序列片段，选择制备对应的一对特异性引物，引物长度在15-30bp，2个引物间的间隔在0.5-2.0kb，用步骤2获取的DNA为模板，按常规方法进行PCR扩增；(4)进行琼脂糖凝胶电泳取上述PCR扩增后的产物，在含有溴化乙锭的1％琼脂糖凝胶中进行电泳；(5)电泳结果判定电泳完成后，在紫外灯下观察琼脂糖胶，当观察到家蚕微孢子虫特异性的DNA条带时，认定该被检集团为阳性；(6)获取家蚕成品卵中微粒子病的病卵率对每一被检集团按上述步骤l至5进行检测，病卵率由下式确定，
式中，N为1个集团中蚕卵的粒数。
上述技术方案中，所述预处理中的碱液为25-35％的氢氧化钾溶液；酸液为l摩尔/升的盐酸；在碱液和酸液处理后分别用水清洗。
上述技术方案中，所述微孢子虫的发芽诱导液选自，0.1摩尔/升的碳酸钾与0.1摩尔/升的碳酸氢钾的混合物，0.2摩尔/升的氢氧化钟，或者是0.01摩尔/升的氢氧化钾与0.16摩尔/升的氯化钾的混合物；所述发芽缓冲液选自，0.01摩尔/升的磷酸盐缓冲液(pH值6.8-7.2)，或者pH值为8.0的TEK缓冲液(0.16摩尔/升的氯化钾，1毫摩尔/升的Tris-HCl，10毫摩尔/升的EDTA)。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点1.由于本发明采用分子生物学方法，通过检测微孢子虫的基因序列实现对微粒子病病卵率的测定，可以对家蚕成品卵直接进行检测，蚕卵无需催青至孵化，检测周期短，能够满足用种单位的需求；2.本发明的检测灵敏度高，经实验证实，样品中只要有4个微孢子即可检出，300粒蚕卵中带有一粒有毒蚕卵也可检出3.本发明的蚕卵经过预处理后，蚕卵易匀浆，同时，经碱液处理后，可较好地降解蚕的基因组，减少蚕基因组DNA对PCR扩增的干扰，并可提高所提取的DNA的质量；4.蚕卵用微孢子虫发芽诱导液、发芽缓冲液处理，可以促进蚕卵中的微孢子虫发芽，提高微孢子虫DNA的得率。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述实施例一家蚕成品卵中微粒子病病卵的检测。
(1)取50粒待检家蚕成品卵，在室温下用25％氢氧化钾(KOH)0.3毫升处理20分钟，用水清洗2次，再用0.3毫升1摩尔/升的盐酸(HCl)中和处理5分钟，再用水清洗2次；(2)DNA的提取，包括，在上述处理过的蚕卵中加入0.0l摩尔/升的氢氧化钾与0.16摩尔/升的氯化钾的混合物0.3毫升，作为微孢子虫发芽诱导液，匀浆后常温下诱导0.5小时，再用pH为8.0的TEK缓冲液作为发芽缓冲液，处理40分钟，弃上清，沉淀用0.3毫升的蛋白酶K(终浓度为50微克/毫升)在50℃下消化蛋白质30分钟，用饱和酚抽提分离，再用RNA酶(终浓度为0.01毫克/毫升)降解RNA，用酚/氯仿抽提去除RNA酶后，用预冷的无水乙醇沉淀DNA，抽干后，将DNA溶于水中；(3)根据GenBank上已公开的家蚕微孢子虫16S rRNA基因序列(登记号为U11047)，设计一对引物，分别为，Nb55’-CACCAGGTTGATTCTGCC-3’；和Nb35’-TTATGATCCTGCTAATGG-3’，2个引物之间的间隔为1.2kb；将步骤2提纯的DNA稀释20倍，取1微升为模板，Nb5和Nb3为引物，按常规方法进行PCR扩增；(4)琼脂糖凝胶电泳取PCR产物于含有溴化乙锭的1％琼脂糖凝胶中进行电泳。
(5)电泳完毕后，在紫外灯下观察，如能观察到1.2kb的特异性DNA条带，则认定被检物中含有微孢子虫。
实施例二家蚕成品卵中微粒子病病卵率的检测。
(1)蚕卵的预处理以100粒待检家蚕成品卵为一个检验集团，在25℃下用30％氢氧化钾(KOH)0.5毫升处理30分钟，用双蒸水清洗2次，每次1.2毫升，弃水后，再用0.5毫升1摩尔/升的盐酸(HCl)中和处理5分钟，再用双蒸水清洗2次，每次1.2毫升；(2)DNA的提取，包括，在上述处理过的蚕卵中加入0.1摩尔/升的碳酸钾(K2CO3)与0.1摩尔/升的碳酸氢钾(KHCO3)的混合物构成的微孢子虫发芽诱导液0.5毫升，用灭菌牙签将蚕卵捣碎，常温下诱导1小时，在3000转/分下离心5分钟，去上清，加入0.5毫升0.01摩尔/升的磷酸盐缓冲液(pH为7.0)，于25℃下放置60分钟，再在5000转/分下离心10分钟，弃上清，沉淀用0.5毫升的蛋白酶K(50微克/毫升)在37℃下消化60分钟，然后用饱和酚、酚/氯仿、氯仿抽提，再用RNA酶(0.01毫克/毫升)于37℃消化60分钟，酚/氯仿抽提去除RNA酶后，加1/10体积3摩尔/升的醋酸钠(pH＝5.4)及2倍体积预冷的无水乙醇，沉淀DNA，抽干后，将DNA溶于双蒸水(40微升)中，4℃保存；(3)根据GenBank上已公开的家蚕微孢子虫16S rRNA基因序列(登记号为U11047)，设计一对引物，分别为，Nb55’-CACCAGGTTGATTCTGCC-3’；和Nb35’-TTATGATCCTGCTAATGG-3’，2个引物之间的间隔为1.2kb；
将步骤2提纯的DNA稀释20倍，取1微升为模板，Nb5和Nb3为引物，反应总体积为25微升，反应体系其它各组份的终浓度如下
各组份混合后，按常规方法进行PCR扩增，PCR扩增条件为94℃预变性3.5分钟后，94℃ 1分钟，55℃ 1分钟，72℃ 1分钟，扩增35个循环；(4)琼脂糖凝胶电泳取PCR产物10微升，于含有溴化乙锭(终浓度为50微克/100毫升)的1％琼脂糖凝胶中进行电泳。电泳条件为电泳缓冲液0.5×TBE(0.045mol/L Tris-硼酸，0.001mol/L EDTA)电流50毫安；电压100伏；电泳时间30分钟(5)电泳完毕后，在紫外灯下观察琼脂糖胶，如能观察到1.2kb的特异性DNA条带，则认定该检验集团为阳性，即含有微孢子虫。
(6)按照上述方法，对某一批次蚕种如共抽样检验100个集团，其中3个集团呈阳性，则该批蚕种微粒子病病卵率按以下公式计算
因此，该批蚕种微粒子病病卵率为0.03％。
实施例三家蚕成品卵中微粒子病病卵率的检测(1)蚕卵的预处理同实施例二。
(2)DNA的提取同实施例二。
(3)根据GenBank上已公开的家蚕微孢子虫16S rRNA基因序列(登记号为AY616662)，设计一对引物，分别为，Nb1655’-CGAGTGCCAGCAGCCGCGG -3’；和Nb1635’-GCAACCATGTTACGACTTATATCAGA-3’，2个引物之间的间隔为0.8kb；将步骤2提纯的DNA稀释20倍，取1微升为模板，Nb165和Nb163为引物，反应总体积为25微升，反应体系其它各组份的终浓度如下
各组份混合后，按常规方法进行PCR扩增，PCR扩增条件为94℃预变性3.5分钟后，94℃1分钟，55℃1分钟，72℃50秒，扩增35个循环；(4)琼脂糖凝胶电泳取PCR产物10微升，于含有溴化乙锭(终浓度为50微克/100毫升)的1％琼脂糖凝胶中进行电泳。电泳条件为电泳缓冲液0.5×TBE(0.045mol/L Tris-硼酸，0.001mol/L EDTA)电流50毫安；电压100伏；电泳时间30分钟(5)电泳完毕后，在紫外灯下观察琼脂糖胶，如能观察到0.8kb的特异性DNA条带，则认定该检验集团为阳性，即含有微孢子虫。
(6)按照上述方法，对某一批次蚕种如共抽样检验100个集团，其中4个集团呈阳性，则该批蚕种微粒子病病卵率按以下公式计算
因此，该批蚕种微粒子病病卵率为0.04％。
权利要求
1.一种家蚕成品卵中微粒子病病卵的检测方法，其特征在于首先提取待检家蚕成品卵内的总DNA；根据家蚕微孢子虫基因的特异性序列，设计并合成一对特异性引物，二引物之间的间隔为0.5-2.0kb，以提取的待检家蚕成品卵内的总DNA为模板，进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测，当检出家蚕微孢子虫的特异性基因片段时，判定该被检家蚕成品卵为微粒子病病卵。
2.根据权利要求1所述的家蚕成品卵中微粒子病病卵的检测方法，其特征在于对待检家蚕成品卵先进行预处理，所述预处理包括，用碱液处理15-30分钟，用水清洗，再用酸液中和，再用水清洗；所述总DNA的提取过程包括，在蚕卵中加入微孢子虫发芽诱导液，匀浆后常温下诱导0.5小时至2小时，再用发芽缓冲液处理至少20分钟，用蛋白酶K在37℃至50℃下消化蛋白质，抽提分离，再用RNA酶降解RNA，抽提去除RNA酶后，用无水乙醇沉淀DNA，并溶于水中；所述特异性引物长度在15-30bp，所述对扩增产物的检测方法采用琼脂糖凝胶电泳法。
3.一种家蚕成品卵中微粒子病病卵率的检测方法，其特征在于，包括下列步骤(1)蚕卵的预处理取80-120粒家蚕成品卵为一个集团，用碱液处理15-30分钟，用水清洗，再用酸液中和，再用水清洗；(2)DNA的提取在上述处理过的蚕卵中加入微孢子虫发芽诱导液，匀浆后常温下诱导0.5小时至2小时，再用发芽缓冲液处理至少20分钟，用蛋白酶K在37℃至50℃下消化蛋白质，抽提分离，再用RNA酶降解RNA，抽提去除RNA酶后，用无水乙醇沉淀DNA，并溶于水中；(3)PCR扩增根据家蚕微孢子虫的基因序列片段，选择制备对应的一对特异性引物，引物长度在15-30bp，2个引物间的间隔在0.5-2.0kb，用步骤2获取的DNA为模板，按常规方法进行PCR扩增；(4)进行琼脂糖凝胶电泳取上述PCR扩增后的产物，在含有溴化乙锭的1％琼脂糖凝胶中进行电泳；(5)电泳结果判定电泳完成后，在紫外灯下观察琼脂糖胶，当观察到家蚕微孢子虫特异性的DNA条带时，认定该被检集团为阳性；(6)获取家蚕成品卵中微粒子病的病卵率对每一被检集团按上述步骤1至5进行检测，病卵率由下式确定， 式中，N为1个集团中蚕卵的粒数。
4.根据权利要求3所述的家蚕成品卵中微粒子病病卵率的检测方法，其特征在于所述预处理中的碱液为25-35％的氢氧化钾溶液；酸液为1摩尔/升的盐酸；在碱液和酸液处理后分别用水清洗。
5.根据权利要求3所述的家蚕成品卵中微粒子病病卵率的检测方法，其特征在于所述微孢子虫的发芽诱导液选自，0.1摩尔/升的碳酸钾与0.1摩尔/升的碳酸氢钾的混合物，0.2摩尔/升的氢氧化钾，或者是0.01摩尔/升的氢氧化钾与0.16摩尔/升的氯化钾的混合物；所述发芽缓冲液选自，0.01摩尔/升的磷酸盐缓冲液，或者pH值为8.0的TEK缓冲液。
全文摘要
本发明公开了一种家蚕成品卵中微粒子病病卵的检测方法，其特征在于首先提取待检家蚕成品卵内的总DNA；根据家蚕微孢子虫基因的特异性序列，设计并合成一对特异性引物，二引物之间的间隔为0.5－2.0kb，以提取的待检家蚕成品卵内的总DNA为模板，进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测，当检出家蚕微孢子虫的特异性基因片段时，判定该被检家蚕成品卵为微粒子病病卵。对家蚕成品卵进行集团检测，可以确定微粒子病的病卵率。本发明可以对家蚕成品卵直接进行检测，蚕卵无需催青至孵化，检测周期短，检测灵敏度高，能够满足用种单位的需求。
文档编号G01N27/447GK1687767SQ200510040059
公开日2005年10月26日 申请日期2005年5月11日 优先权日2005年5月11日
发明者贡成良, 潘中华, 郑小坚, 沈卫德, 曹广力, 薛仁宇, 陶维华, 李掌林, 陶鸣, 潘丽芬 申请人:苏州大学, 江苏省蚕种管理所