专利名称：一种制药废水的生殖毒性检测与评价方法
技术领域：
本发明涉及一种制药废水的毒性检测与评价方法，更具体的说是一种制药废水的生殖毒性检测与评价方法。
背景技术：
评价毒物毒性的方法有很多，国内、国际上都已经有通过检测受试动物精子形态的方法来评价毒物毒性的方法，北京医科大学用氯乙烯对小鼠进行吸入染毒，观察精子形态，计算畸形率，评价其毒性。Quinto I等用美福铁和亚胺硫磷等毒物对小鼠通过腹腔注射的方法染毒，然后观察精子形态、计算畸形率。没有通过测试小鼠精子形态以及生精细胞百分率检测合成制药废水毒性的相关文献，对于应用小鼠精子形态以及生精细胞百分率来评价合成制药废水毒性的方法目前仍是空白。一些制药厂的生产废水，含有众多的有机物，尤其是合成生产神经调节类药物的制药厂，废水中含有机氯及其它苯环与杂环化等有机污染物，其中持久性有机污染物POPs(persistent organic pollutants)及环境激素EH(environmental hormone)类污染物多达十几种以上，而目前对于这种废水的生物毒性及其对人类健康和生态安全所产生的危害还不清楚。由于常规的检测方法与排放标准不足以准确检测与评估POPs和EH的生物分子毒性，所以评估POPs和EH的环境健康危险性与生态安全风险性，至今还是一项国际性的重大难题。
发明内容
1、要解决的技术问题本发明的目的是提供一种制药废水的生殖毒性检测与评价方法，特别是对其中含有持久性有机污染物POPs和环境激素EH类污染物制药厂废水，可以简便、准确的检测生殖毒性进而评价其生物毒性。
2、技术方案采用的技术方案如下
一种制药废水的生殖毒性检测与评价方法，包括以下步骤(1)以制药厂生产废水为测试废水，以小鼠为受试生物，通过经口灌胃对小鼠进行染毒；(2)测试期(1～3个月)满后观察小鼠精子形态、计算精子畸形率；(3)测定各类生精细胞百分率，将染毒组数据与对照组进行差异显著性检验；(4)用检验结果来评价制药废水对小鼠精子毒性。
步骤(1)中所述的制药厂废水中含有持久性有机污染物POPs和环境激素EH类污染物。步骤(3)中的各类生精细胞百分率是指单倍体、二倍体和四倍体细胞分别占总生精细胞的百分率。步骤(2)中按照小鼠精子畸变形图计数各组小鼠畸形精子数和精子总数，计算精子畸形率。
流式细胞仪DNA定量分析具体方法流式细胞仪检测后，用配套软件分析后可以得到单倍体、二倍体和四倍体细胞分别占总生精细胞的百分率，以x±s表示，应用excel统计软件进行t检验。判断样品组和对照组小鼠各种生精细胞所占比例的差异显著性。单倍体细胞由精子细胞和精子组成，二倍体细胞由精原细胞、次级精母细胞组成，四倍体细胞由初级精母细胞和处于G2M期精原细胞组成。单倍体细胞百分数可以用于评估睾丸生精功能，因次级精母细胞存在的时间短，二倍体细胞百分数可以指示精原细胞的数量。若染毒组小鼠的单倍体或二倍体生精细胞百分率与对照组存在显著性差异，则说明该制药废水对小鼠的生精功能产生损伤，具有一定的生殖毒性。
精子畸形率检测具体方法在显微镜下观察染毒组与对照组小鼠精子形态，按照小鼠精子畸变形图(来自张希桥、杨志华.关于精子畸变分型的参考意见.卫生毒理学杂志，1995，9(1)46)计数各组小鼠畸形精子数和精子总数，计算精子畸形率。用excel软件进行差异显著性的x2检验。判断染毒组和对照组小鼠精子畸形率的差异显著性。若具有差异显著性，则说明该制药废水可对小鼠精子产生损伤，使其精子畸形率上升，具有一定的生殖毒性。
3、有益效果本发明提供了一种制药废水的生殖毒性检测与评价方法，可以简便、准确的检测生殖毒性进而评价其生殖毒性。本发明可以准确的检测与评估合成制药废水中POPs和EH对小鼠精子的毒性，研究合成制药废水安全浓度与剂量，为制定相应的废水排放标准提供可靠的基础数据。本发明不仅适用于合成制药废水的生物分子毒性检测，也适用于其它有毒有机废水毒性的检测与评估。
四、说明书附1为染毒组小鼠精子形态图2为对照组小鼠精子形态五具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明1、材料与方法1.1、受试动物与染毒处理昆明种(Mus musculus，KM)雄性小鼠，体重18～22g，由南京青龙山动物饲养中心提供。随机分为对照组和染毒样品组各12只。染毒组经灌胃0.2mL/d合成制药废水(徐州恩华制药厂，简称XZEH)染毒处理35d，对照组灌胃0.2mL/d生理盐水35d。
1.2、测试废水的水质参数表1 XZEH合成制药废水的水质分析结果/mg·L-1
1.3、流式细胞仪DNA定量分析取出受试小鼠睾丸，置于冷PBS液中洗两次，小心除去被膜和血管，用眼科剪将组织剪碎，转移至50mL离心管中，漩涡振荡器振摇1分钟，使生精细胞震离出组织，再通过100目钢筛过滤，收集细胞悬液，1200r/min，离心10min后加PBS液调整细胞浓度为106～107个/mL，用70％冷酒精固定过夜。PBS液洗涤两次，加入含有1％Triton-X-100，RNase-A(20μg/mL)的PI(50μg/mL)溶液1mL，染色30分钟，PBS液洗涤1次，用美国BD公司的FACScan流式细胞仪检测。数据均由配套软件自动分析后获取，以x±s表示，应用excel统计软件进行t检验。判断样品组和对照组小鼠生精细胞指标的差异显著性。
1.4、精子畸形的细胞毒性检测取受试小鼠双测附睾，置于载玻片，加入1～2滴PBS液，剪碎组织，用在光镜下观察。然后用移液器吸取50μl液体进行涂片，瑞士染液染色，用NikonTE2000-5荧光显微镜观察拍照。按小鼠精子畸变形图，计算精子的畸形率，用excel软件进行差异显著性的x2检验。判断样品组和对照组小鼠精子畸形率的差异显著性。
2、结果2.1、废水对小鼠生精细胞的毒性分析用流式细胞仪及配套软件，自动检测与分析各种生精细胞所占百分率，经统计学计算，XZEH合成制药废水对小鼠生精细胞的毒性检测结果见表2。染毒小鼠生精细胞中的二倍体细胞数量低于对照组20.45％，差异极显著(P＜0.01)。二倍体生精细胞是有效的生殖细胞，包括精原细胞和次级精母细胞2种。因为次级精母细胞存在的时间短，所以二倍体的生精细胞数量，实际是指正常的精原细胞数量。结果表明，XZEH(徐州恩华)制药废水具有降低小鼠正常精原细胞(二倍体生精细胞)数量的遗传毒性。
表2 XZEH合成制药废水对小鼠生精细胞的毒性检测结果
2.2、废水致小鼠精子畸形的细胞毒性分析废水对小鼠精子形态的毒性检测结果见表2、
图1和图2。从表2可以看出，染毒样品组小鼠畸形精子率为23.53％，高于对照组的15.12％，差异极为显著。表明XZEH合成制药废水提高了小鼠精子的畸形发生率，影响到小鼠后代的繁殖和胚胎发育的质量。
染毒样品组小鼠精子与对照组小鼠精子的细胞形态比较见图1、图2。从图1可以明显的看出，染毒小鼠的精子细胞尺寸小、尾部弯曲多、头部比例小。图2对照组小鼠的精子细胞尺寸大、尾部顺直多、头部清晰正常。表明XZEH合成制药废水存在生殖毒性，影响到精子细胞的生成质量。
2.3毒性评价下表中给出了该制药废水中存在的6种主要污染物的一些参数，以及现有的标准中给出的安全剂量
表3 XZEH废水中6种有机污染物COD/MW的计算及安全剂量的报道值Table 3 COD/MW calculation of six kinds of organic pollutants in XZEH wastewater and safe dose reported
注表3中安全浓度与安全剂量的换算公式安全浓度＝安全剂量(mg/Kg/d)·小鼠体重(0.02Kg)÷灌胃量(0.2mL/d).
通过表3的换算，我们得到了一个关键的换算因子2.53，通过它可以将COD浓度换算为物质的量浓度。本例中，该废水的COD浓度为13220mg/L，用换算因子换算后得到其物质的量浓度为5225mg/L(13220÷2.53).。再将其换算为对小鼠的染毒剂量染毒剂量(mg/Kg/d)＝废水物质的量浓度(5225mg/L)·灌胃量(0.2mL/d)÷体重(0.02Kg)＝52.25mg/Kg/d。由此得到本实施例中对小鼠的染毒剂量为52.25mg/Kg/d。
下面采用应用系数(AF)来计算该制药废水的安全剂量，安全剂量＝染毒剂量·应用系数AF，此处应用系数采用0.001(经验值)，由此得出该制药废水的安全剂量为0.05mg/Kg/d，而文献中检索到的安全剂量为2.416mg/Kg/d，因此现有的标准不足以控制该制药废水的生殖毒性。
权利要求
1.一种制药废水的生殖毒性检测与评价方法，其特征在于包括以下步骤(1)以制药厂生产废水为测试废水，以小鼠为受试生物，通过经口灌胃对小鼠进行染毒；(2)测试期满后观察小鼠精子形态、计算精子畸形率；(3)测定各类生精细胞百分率，将染毒组数据与对照组进行差异显著性检验；(4)用检验结果来评价制药废水对小鼠精子毒性。
2.根据权利要求1所述的一种制药废水的生殖毒性检测与评价方法，其特征在于步骤(1)中所述的制药厂废水中含有持久性有机污染物POPs和环境激素EH类污染物。
3.根据权利要求2中所述的一种制药废水的生殖毒性检测与评价方法，其特征在于步骤(3)中的各类生精细胞百分率是指单倍体、二倍体和四倍体细胞分别占总生精细胞的百分率。
4.根据权利要求3中所述的一种制药废水的生殖毒性检测与评价方法，其特征在于步骤(2)中按照小鼠精子畸变形图计数各组小鼠畸形精子数和精子总数，计算精子畸形率。
5.根据权利要求1～4中所述的一种制药废水的生殖毒性检测与评价方法，其特征在于步骤(2)中采用流式细胞仪进行检测。
全文摘要
本发明公开了一种制药废水的生殖毒性检测与评价方法，主要进程如下以制药厂生产废水为测试废水，以小鼠为受试生物，通过经口灌胃对小鼠进行染毒；测试期满后观察小鼠精子形态、计算精子畸形率；测定各类生精细胞百分率，将染毒组数据与对照组进行差异显著性检验；用检验结果来评价制药废水对小鼠精子毒性。本发明可以简便、准确的检测生殖毒性进而评价其生物毒性。可以准确的检测与评估合成制药废水中POPs和EH对小鼠精子的毒性，研究合成制药废水安全浓度与剂量，为制定相应的废水排放标准提供可靠的基础数据。本发明不仅适用于合成制药废水的生物分子毒性检测，也适用于其它有毒有机废水毒性的检测与评估。
文档编号G01N15/00GK1793915SQ20051012277
公开日2006年6月28日 申请日期2005年12月2日 优先权日2005年12月2日
发明者程树培, 赵大勇, 潘文扬, 崔益斌, 朱程军, 孙石磊, 张徐祥, 蒋丽娟, 肖 琳, 于红霞, 于洪峰, 魏国哲, 孙成, 孔志明 申请人:南京大学