专利名称：表面强化的光谱学活性复合纳米颗粒的制作方法
技术领域：
本发明一般涉及与对定量、定位、鉴定或示踪目的有意义的本体共价或非共价固定的亚微米大小的颗粒或标记。更具体地说，本发明涉及表面强化的光谱学活性复合纳米颗粒、制备该颗粒的方法和该颗粒的应用。
背景技术：
荧光是示踪和定量生物分子的主要方式。荧光标记用于DNA测序、使用微阵列的基因表达分析、流式细胞计量术及其变化形式、RT-PCR和其它应用宿主。一种具体有意义并且重要性增加的应用是胞内成像。已经通过荧光共振能量转移(FRET)监测了生物分子结合/去结合活动，其中活动驱动的荧光团与猝灭剂之间的距离的改变导致荧光强度改变。荧光团与白细胞上表面抗体标记的共价结合为细胞计量术的基础，同样，荧光标记的共价结合已经用于使细胞内的每种细胞器和细胞实际进行的每一过程显现。尽管有机荧光团存在众多能力，但是它们仍然存在几种局限。(i)它们对光致漂白高度敏感，并且光分解在激发态时既为优于基态的氧化剂，又为优于基态的还原剂；(ii)荧光发射范围广泛，从而限制了光谱正交标记的数量；(iii)荧光一般在可见区中激发，在该区中生物样品表现出内在背景荧光；(iv)荧光团的不同颜色通常具有显著不同的结构和化学特性，从而迫使要求不同的结合和操作方案。
荧光纳米颗粒半导体(量子点)的研发扩展了基于荧光的光学检测标记的应用(Chan等，Science 1998，281.2016-18；Bruchez等，Science 1998，281，2013-16)。将Chan等披露的内容和所有其它本文涉及的专利、专利申请和公开文献完整地引入本文作为参考。量子点表现出远低于有机荧光团的光致漂白性，并且在可见区中具有较窄的发射带宽。尽管较窄的发射范围的后果是在可见区中的较窄激发范围，但是作为结果，需要紫外光激发多个标记，这对生物系统而言低于最佳。此外，当颗粒在红外且尤其是在近IR区中发射时，量子点的带宽显著增加，且由此许多较少的颜色可利用。然而，量子点广泛用于胞内成像应用，具有富有前途的结果。近期的报导已经使用量子点示踪表皮生长因子的结合和胞吞以及胞吞或结合活细胞生物素化表面蛋白的量子点的长期成像。不过，大量文献中描述了用于细胞递送的非标记手段。肽转运结构域用于将不同比例的5种颜色的量子点导入细胞亚群以便产生10种独特的密码。不同的报导中描述了在包括使用脂转染试剂和转导肽类的量子点编码后注入小鼠的细胞示踪物。还可以在注射胶束包囊的量子点后示踪非洲蟾蜍属胚胎的发育。令人遗憾的是，胞吞的量子点分离并且不能参与进一步的胞内标记，并且经证实通过转染和电穿孔递送的量子点发生聚集。显微注射能够递送不聚集的量子点，但是需要众多技能的连续过程。另外，使用UV光长期成像可能导致量子点降解，从而产生谱移和细胞毒性。同样，已经描述了将金属纳米颗粒导入细胞。在1990年就证实可以成功地将导入活细胞内部金属纳米颗粒，此时将电镜法用于检验显微注入细胞质的胶体金的核摄取(Feldherr等J Cell Biol 1990.111，1-8；Feldherr等，J Cell Biol 1991.115.933-39)。通过使用用于示踪肽修饰的胶体金的核靶向能力的图像强化的颜色显微术发展了本领域。几种报导中已经利用了来自Ag和Au纳米颗粒的强等离子共振，该过程通过使用生物分子修饰Ag和Au纳米颗粒以便实时示踪活细胞上膜转运蛋白的动力学特性来进行。在这两种技术中不存在光致漂白作用能够在不发生任何颗粒降解的情况下进行长期成像。在理论上，可以控制颗粒的大小、形状和组成以便进行多路等离子共振成像实验，而在实际上，与制备所有既定大小的颗粒中存在的困难相关联的特征宽度将颜色的数量减至2-3。
易于使用单色远红外或近IR光激发拉曼散射，光子能量过低难以激发生物样品中的内在背景荧光。由于拉曼光谱一般覆盖200-3500cm-1的振动能并且由于各震动一般具有极窄的带宽，即＜50cm-1，所以可以预计均使用单光源同时测定一打(或更多)报道分子，不过，正常的拉曼极弱，从而限制了它在生物分析化学中的应用。在SERS中，与贵金属表面(金、银、铜)上纳米级糙度特征极为相近的分子在散射效率方面以数以万计倍增加的方式产生[称作增强因子(EF)]。SERS还可以用于检测与吸附于金属纳米颗粒的分子并且已经用于证实单一分子的检测。
发明概述本发明提供了一种方法，包括使金属沉积入模板孔，其孔径小于300nm；使第二金属沉积入所述模板的所述孔，其中所述第一材料和所述第二材料中的至少一种的沉积包括法拉第电化学过程以便生成分节段的孔结合的纳米颗粒；重复金属沉积；并且从所述分节段的孔结合的纳米颗粒中释放所述的第二材料和所述的模板以便生成至少两种自由的金属纳米颗粒。本发明还提供了一种方法，包括使金属沉积入模板孔，其孔径小于300nm；使第二金属沉积入所述模板的所述孔；使第三种材料沉积入所述模板的所述孔，其中所述第一材料和所述第二材料中的至少一种的沉积包括法拉第电化学过程以便生成分节段的孔结合的纳米颗粒；重复步骤使第一金属和第二金属沉积的步骤；并且从所述分节段的孔结合的纳米颗粒中释放所述的第三种材料和所述的模板以便生成至少两种自由的金属纳米颗粒，它们各自包括所述的第一金属和所述的第二金属。
本发明还提供了一种方法，包括制备最优化SACN，其中提供一种方法制备所述的最优化SACN，该制备方法包括在制备SACN的过程中以不可逆的方式长期与颗粒表面结合的材料，其中所述光谱的本底信号与未最优化的相应SACN产生的光谱相比被降低。
本发明还提供了一种方法，包括降低在使用SACN颗粒的试验中的本底信号，其中所述的降低包括从选自所分析样品、SACN颗粒和试验容器的部分中除去杂质。
本发明还提供了一种方法，包括制备多个SACN颗粒，它们各自包括不同的拉曼标记；测定拉曼标记的强度比例；并且制备第二组多个SACN颗粒，它们具有对具有最弱强度的标记校准的标记强度，由此制备了在拉曼光谱中具有基本上等同峰强度的多个SACN。在某些实施方案中，通过使用减少量的标记制备SACN校准标记，其中将减少的量定义为该标记与最弱标记的强度比的倒数。在其它实施方案中，通过使用增加量的硅烷制备SACN校准标记，其中将增加的量定义为该标记与最弱标记的强度比的倒数。
本发明还提供了SACN，含有纳米颗粒芯、拉曼活性报道分子、SiO2包囊用材料和选自-SH、-NH2和-COO-的基团。
本发明还提供一种方法，包括提供纳米颗粒，所述的纳米颗粒与拉曼活性报道分子结合，用SiO2包囊纳米颗粒，修饰SiO2使之带有选自-SH、-NH2和-COO-基团，由此制备活化的SACN。
本发明还提供了生物缀合的SACN，含有纳米颗粒、与所述纳米颗粒结合的拉曼活性报道分子、SiO2包囊用材料和选自蛋白质和核酸的生物分子。
本发明还提供了用于检测分析物的一种方法，包括获得生物样品；并且使该样品接触含有可与分析物结合的生物分子的生物缀合的SACN；并且检测与所述生物缀合的SACN相结合的分析物。
本发明还提供了一种方法，包括使怀疑含有分析物的样品接触至少一种对侧流试验表面上的该分析物的特异性结合配偶体(bindingpartner)，以便结合样品中的分析物；在上述步骤(a)之前、同时或之后，使至少一种分析物的结合配偶体与SACN结合；并且检测SERS信号，由此根据信号的强度或存在来确定样品中存在分析物，由此确定样品中存在至少一种分析物。
本发明还提供了一种方法，包括提供与CCD照相机连接的显微镜；提供细胞；使细胞接触至少一种能够特异性结合该细胞或细胞部分的SACN；在细胞与照相机之间配备波数过滤装置；获得多个数据组；并且汇编数据组；由此获得了SACN的空间特性。
本发明还提供了纳米颗粒、金属纳米颗粒、一种以上的与所述的纳米颗粒结合的拉曼活性报道分子和SiO2包囊用材料。
本发明还提供了一种方法，包括使HAuCl4接触羟基酰胺盐酸盐；进一步使从步骤a)中所得的溶液接触柠檬酸钠脱水物和NaBH4的混合物，由此产生了金纳米颗粒。本发明还提供了一种方法，包括提供通过上述方法制备的金纳米颗粒；使拉曼活性报道分子与所述纳米颗粒结合；并且用SiO2包囊所述的纳米颗粒；由此制备SACN。
本发明还提供了纳米颗粒，包括各向异性金属纳米颗粒；与所述的各向异性金属纳米颗粒结合的SERS活性报道分子；包囊各向异性金属纳米颗粒的SiO2。
本发明还提供了一种方法，包括将SACN纳米颗粒显像剂给予患者；使用可以进行光谱成像的系统扫描患者；并且生成患者体内区域的光谱或图像。本发明还提供了一种方法，包括将多个靶向至涉及异常病理情况的分子的SACN导入存在有异常病理情况的患者体内，其中SACN结合与异常病理情况相关的分子；并且获得结合的SACN的图像，由此可以诊断异常病理情况。
本发明还提供了一种用于使用SACN标记动物的一种方法，包括将SACN导入动物体内，其中所述的导入选自皮下植入、静脉内导入。本发明还提供了一种方法，包括使组织样品接触至少一种能够特异性结合该组织样品的生物分子缀合的SACN颗粒；和(b)获得组织/生物分子缀合的SACN颗粒混合物的拉曼图像。
本发明还提供了纳米颗粒，包括芯/壳纳米颗粒；与所述的芯/壳纳米颗粒结合的至少一种拉曼活性报道分子；和SiO2包囊用材料。
本发明提供了一种方法，包括使金属沉积入模板孔，其孔径小于300nm；使第二金属沉积入所述模板的所述孔，其中所述第一材料和所述第二材料中的至少一种的沉积包括法拉第电化学过程以便生成分节段的孔结合的纳米颗粒；重复金属沉积的步骤；并且通过酸处理从所述分节段的孔结合的纳米颗粒中释放所述的第二材料和所述的模板以便生成至少两种多孔性自由的金属纳米颗粒。
图1表示典型的拉曼光谱。
图2表示使用5种不同标记分子制备的SACN的比较。从上到下喹啉硫醇、孔雀绿异硫氰酸酯、巯基苯并咪唑(mercaptobenzamidazole)、双(4-吡啶基)乙烯基、Bodipy。
图3表示PVDF、硝化纤维和侧流膜的散射强度与拉曼位移的关系。
图4表示玻璃和石英表面的散射强度与拉曼位移的关系。
图5表示在基于溶液的方法中制备的纳米杆的TEM图像。
图6表示使用633nm激发(示踪A)和785nm激发(示踪B)获得的4-MP/BPE-SACN的SERS光谱。
图7表示BPE-SACN(虚线)和4MP SACN(实线)的拉曼光谱。
图8表示生物素分子结合于不同比例的NeutrAvidinTM和牛血清清蛋白(BSA)缀合的纳米颗粒的数量。
图9表示通过测定样品暴露于不同量的激发能后的信号的SACN线性。
图10表示来自样品的信号与暴露于发射的光的SACN的时间函数的关系。
图11表示SACN制备的批量再现性的证据。
图12A表示在QSH中释放的65×30nm和90×30nm Au颗粒在633nm处激发获得的拉曼光谱。图12B表示在QSH中释放的65×30nm和90×30nm Au颗粒在785nm处激发获得的拉曼光谱。
图13表示在MP中释放的65×30nm和90×30nm Au颗粒在633nm处激发获得的拉曼光谱。
图14A表示在ME中释放的具有35nm直径的Au纳米杆的TEM图像。图14B表示用QSH取代ME在633nm处激发获得的拉曼光谱。
图15A和B表示250nm×250nm的Au SACN的SEM图像。
图16A和B表示250nm×250nm的Au SACN的TEM图像。
图17A和B表示250nm×250 nm的Au SACN在785nm和633nm处激发的拉曼光谱。
图18表示滴定IL-7的蛋白质微阵列夹心式免疫测定实验结果。
图19表示Bot tox的侧流免疫测定结果。
图20表示不含和含有SACN的全血在758nm处激发的散射强度与拉曼位移的关系。
图21A表示SACN标记的细胞的明视野和SERS图像，且图21B表示来自组织病理学试验中未处理和处理的点的拉曼光谱。
图22表示将SACN注入小鼠尾部后45分钟在肝上获得的光谱。
图23表示皮下注射SACN后获得的光谱。
发明内容
描述了表面强化的光谱学活性复合纳米颗粒美国专利US6514767中，其标题为“表面强化的光谱学活性复合纳米颗粒”；2003年1月16日提交的美国专利申请US 10/345821，其标题为“表面强化的光谱学活性复合纳米颗粒”；和2004年3月29日提交的美国专利申请US 60/557729，其标题为“表面强化的光谱学活性复合纳米颗粒”，将这些文献各自通过引入并入本文。
本发明提供了制备表面强化的光谱学活性复合纳米颗粒(SACN)的新方法和制备改进的SACN的方法。这类纳米颗粒各自包括SES活性金属纳米颗粒、与金属表面紧密相邻的亚单层、单层或多层光谱学活性类物质和包括聚合物、玻璃(SiO2)或任意其它电解质材料的包囊壳。将这种光谱学活性分子(本文称作“报道分子”)置于金属纳米颗粒与包囊材料之间的界面上。在一个典型的实施方案中，SACN包括(i)金属纳米颗粒芯(例如Au或Ag)；(ii)产生独特振动信号的拉曼活性报道分子；和(iii)SiO2包囊材料，它将报道分子“锁定”就位，同时还为后续生物分子的固定化提供了高度相容性的表面。基本上为SERS-无活性的玻璃涂层还可以颗粒对聚集保持稳定并且防止不需要的物质的竞争性吸附。在某些实施方案中，将报道分子和包囊参考依次导入纳米颗粒。在某些实施方案中，包囊材料包括报道分子。在某些实施方案中，SACN进一步包括与纳米颗粒相邻的聚合物涂层。
纳米颗粒芯可以为本领域中公知的任意纳米颗粒。本文所用的术语“纳米颗粒”、“纳米结构”、“纳米晶体”、“纳米标记”和“纳米成分”可以互换使用以指颗粒，一般为具有约1nm-约1000nm的尺寸的金属粒子，包括1nm-1000nm之间的任意整数值。在某些实施方案中，金属纳米颗粒芯为直径为20-200nm的椭球形或近似椭球形颗粒。在某些实施方案中，该范围约为2nm-约50nm，在某些实施方案中，在约20nm-约50nm范围(例如约20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50nm)。各向异性纳米颗粒可以具有一定的长和宽。在某些实施方案中，各向异性纳米颗粒的长为与产生纳米颗粒的孔口平行的尺寸。就各向异性纳米颗粒而言，在某些实施方案中，纳米颗粒具有350nm或350nm以下的直径(宽)。在其它实施方案中，纳米颗粒具有250nm或250nm以下的直径，且在某些实施方案中，直径为100nm或100nm以下。在某些实施方案中，宽为15nm-300nm。在某些实施方案中，纳米颗粒具有约10-350nm的宽。
纳米颗粒可以为各向同性或各向异性的。纳米颗粒包括胶体金属空心或填充的纳米棒、磁性、顺磁性、传导性或绝缘性纳米颗粒、合成颗粒、水凝胶(胶体或棒)等。本领域技术人员可以理解纳米颗粒可以以各种形状存在，包括，但不限于椭球形、杆形、圆片形、棱锥形、立方体形、圆柱形、纳米螺旋形、纳米弹簧形、纳米环形、杆形纳米颗粒、箭头形纳米颗粒、泪珠形纳米颗粒、四脚动物形纳米颗粒、棱镜形颗粒和多种其它几何和非几何形状。已经描述的另一类纳米颗粒包括那些具有内表面积的纳米颗粒。它们包括空心颗粒和多孔或半多孔颗粒。此外，可以理解在文献中已经描述了制备这些形状的颗粒的方法，并且在某些情况中为制备这些形状的SERS活性颗粒的方法。尽管公认颗粒形状和长径比可以影响纳米颗粒的物理、光学和电子特性，但是具体形状、长径比或存在/不存在内表面积对作为纳米颗粒的颗粒的品质不会产生影响。
大量SERS文献(实验的和理论的)提示各向异性颗粒(杆形、三角形、棱镜形)可以比球形产生增加的强化作用。例如，所谓的“天线效应”预测了可以预计拉曼强化可以在较高曲率面积上较大。近来已经描述了各向异性颗粒的许多报道，包括Ag棱镜和“分枝的”Au颗粒。用作形成SACN构建模块的这类各向异性颗粒属于本发明的范围。
可以按照与生产Nanobarcodes颗粒类似的方式，通过电淀积入预先形成的氧化铝模板产生各向异性Au和Ag纳米杆。例如，参见Nicewarner-Pena，S.R.；Freeman.R.G.；Reiss，B.D.；He，L.Pena，D.J.；Walton.I.D.Cromer，R.；Keating，C.D.Natan，M.J.“亚微米金属条形码”Science 2001，294，137-141.；Walton，I.D.；Norton.S.M.；Balasingham，A.；He，L.；Oviso，D.F.J.；Gupta，D.Raju.P.A.Natan.M.J.；Freeman，R.G.“用于在溶液中的多路分析的颗粒使用光学显微镜检查法检测和鉴定具条纹的金属颗粒”Anal.Chem.2002.74，2240-2247。通过将交替层材料，一般为Au和Ag沉积入预先形成的氧化铝模板制备这些纳米条形码颗粒。在典型的实施方案中纳米条形码颗粒具有约250nm直径和6微米长。
为了制备用于SACN的金属纳米颗粒，例如，可以如实施例10中所述进行电沉积。在某些实施方案中，孔径小于100nm，并且在某些实施方案中，在10-50nm之间。几个研究组已经报导了具有这些尺寸的均匀氧化铝模板。这类模板目前是商购的。因此，在一个实施方案中，本发明提供了一种方法，包括使金属沉积入模板孔，其孔径小于300nm；使第二金属沉积入所述模板的所述孔，其中所述第一材料和所述第二材料中的至少一种的沉积包括法拉第电化学过程以便生成分节段的孔结合的纳米颗粒；再次使金属沉积入孔；并且从所述分节段的孔结合的纳米颗粒中释放所述的第二材料和所述的模板以便生成至少两种自由的金属纳米颗粒。在该实施方案中，孔结合的分节段的纳米颗粒具有ABA组成，并且在释放B和模板时，产生A的两种颗粒。可以重复这种沉积以便产生具有(AB)n或A(BA)n组成的节段，其中n为1-1000之间的任意整数，并且在从模板中释放时，产生了A的n或n+1颗粒。
在一个实施方案中，通过这种方法制备的SACN具有约250nm直径和250nm长。该方法的一个实例描述在实施例10B中。图15A和B表示通过这种方法制备的SACN的图。尽管这些颗粒看起来为杆形，但是图16A和B中所示的封闭图揭示出它们具有非几何形状。认为非几何形状是因在制备颗粒的过程中金属(例如Au)与释放的材料(例如Ag)之间缺乏平滑界面所致。缺乏平滑界面可能是因形成合金的两种金属相互扩散且随后在释放步骤中合金蜕化(dealloying)所致。这些非几何形颗粒用于SERS，正如图17A和B中所示。同时小心地沉积Au和Ag(例如80:20 Au:Ag)会导致显著的合金化，且随后酸驱动的Ag溶出可以产生展示出很大内表面积的高度凹痕表面。直到报道分子可以进入这些内部位点，由此经历SERS活性纳米特征之间增强的电磁界，这类表面可以表现出改善的SERS性能。
在某些实施方案中，本发明提供了一种方法，包括使第一金属沉积入模板孔，其孔径小于300nm；使第二金属沉积入所述模板的所述孔，使第三材料沉积入所述模板的所述孔，其中所述第一材料和所述第二材料中的至少一种的沉积包括法拉第电化学过程以便生成分节段的孔结合的纳米颗粒；重复是第一种和第二金属沉积的步骤；并且从所述分节段的孔结合的纳米颗粒中释放所述的第三种材料和所述的模板以便生成至少两种自由的金属纳米颗粒，它们各自包括所述的第一金属和所述的第二金属。在该实施方案中，孔结合的分节段的纳米颗粒具有ACBAC组成，并且在释放B和模板时，产生AC的两种颗粒。可以重复这种沉积以便产生具有(ACB)n组成的节段，其中n为1-1000之间的任意整数，并且在从模板中释放时，产生了AC的颗粒。在某些实施方案中，金属之一为有磁性的。
按照某些实施方案，所述的金属包括至少一种选自元素周期表中作为金属而公知的元素。金属主要可以包括单一元素。或者，金属可以为至少两种元素的组合，诸如合金，例如二元合金。金属包括II族金属(Cu、Ag和Au)或本领域技术人员公知支持SERS的任意其它金属。
在其它实施方案中，所述的金属包括额外的成分，诸如在Au2S/Au芯-壳颗粒中。据报导Au2S/Au芯-壳颗粒具有广泛可调的近IR光学共振(Averitt等，1999年10月，JOSA B，Volume16，Issue 10 1824-1832)。或者，可以使用Ag芯/Au壳颗粒，如J.Am.Chem.Soc.2001，123，7961中所述的那些，或Au芯/Ag壳颗粒；或包括SERS活性金属的任意芯-壳组合。适用于芯壳颗粒的其它组合包括在本发明中，诸如Au或Ag纳米颗粒官能化的二氧化硅/氧化铝胶体；Au或Ag官能化的TiO2胶体；Au纳米颗粒封端的Au纳米颗粒(例如，参见Mucic等，J.Am.Chem.Soc.1998，120，12674)；Au纳米颗粒封端的TiO2胶体、具有Si芯与金属壳的颗粒(“纳米壳”)，诸如银封端的SiO2-胶体或金封端的SiO2胶体(例如，参见Jackson等，2004 Proc Natl Acad SciUSA.101(52)17930-5)。空心纳米颗粒，诸如空心纳米球和空心纳米晶体也可以用于SACN。因此，本发明还提供了用于SACN的纳米颗粒，包括用于SERS的芯壳颗粒活性成分或用于SERS的空心纳米颗粒活性成分。可以通过按照文献操作步骤制备批量的这些颗粒并且将SERS信号与本文所述的金属颗粒进行比较来证实这些颗粒的改善的SERS信号。
制备SACN的方法披露在美国专利US 6,514,767中。额外的方法披露在本文，包括实施例部分中。如实施例8中解释的，本文涉及的SACN为光稳定的(不会表现出信号漂白)，热稳定的，表现出线性信号并且展示了批量与批量之间的可再现性的SACN。
适用于本发明的拉曼活性报道分子的实例包括4-巯基吡啶(4-MP)；反式-4，4′双(吡啶基)乙烯(BPE)；喹啉硫醇；4，4′-二吡啶基，1，4-苯基二异氰；巯基苯并咪唑(mercaptobenzamidazole)；4-氰基吡啶；1′，3，3，3′，3′-六甲基吲哚三羰花青碘化物；3，3′-diethyltiatricarbocyanine；孔雀绿异硫氰酸酯；双-(吡啶基)乙炔类；和Bodipy。用于5种不同报道分子的数据如图2中所示。显然光谱不同，并且就每一种类而言，存在至少一种唯一的带。合适的拉曼活性报道分子的额外特征如下所述。
在一个实施方案中，本发明提供了包括一种以上报道分子的SACN。一种这类SACN的制备描述在实施例3中。在一个实施方案中，SACN包括金属纳米颗粒芯、反式-1，2-双(4-吡啶基)乙烯报道分子和4-巯基吡啶报道分子。
存在有一般在正常拉曼中不存在的与SERS底物相关的本底信号。本发明还提供了从SACN中降低本底信号的方法以及表现出降低的本底信号的改善的SACN。例如，在图1中，1600cm-1处的本底信号为～7000计数，而信号S为高于本底～11,000计数。如果测定值为散射噪声(shot-noise)(N)受限的[N＝本底1/2]，那么S/N＝130∶1，而光谱中剩余的峰明显较低。降低本底在系数为2.25时可以对S/N产生50％的改善，由此可以有助于分辨弱信号和一般性地改善不同光谱的清晰度。本发明由此提供了包括使用SACN颗粒降低试验中的本底信号的方法，其中所述的降低包括从试验中涉及的所分析的样品、SACN颗粒和其它缓冲液或相关材料的成分中有效除去SERS活性杂质。已知痕量杂质(甚至那些存在于用于制备胶体Au的试剂中的杂质)可以以不可逆方式被吸附在颗粒表面上。因此，使用超滤、HPLC、蒸馏、升华和/或重结晶对所有材料，并且尤其是报道分子进行严格纯化可以降低本底信号。
例如，就侧流免疫测定而言，常用的底物为PVDF(聚偏氟乙烯)和硝化纤维。已经发现因两个原因而导致就拉曼本底而言需要硝化纤维。首先，PVDF表现出某些自发荧光，正如图3中连续暴露于激发光源2分钟后本底下降所示的(在样品处785nm激光，约200mW功率)。尽管在本底中几乎没有拉曼特征，但是强度的变异性比小峰更难以处理。甚至在这种下降之后，总本底仍然大于获自两个单独的硝化纤维源的本底，它们两者在延长光照中均未表现出光诱导的拉曼发射的改变。类似的现象可以在图4中观察到，该图表示当使用785nm的光激发时，玻璃具有弱的和可测定到的本底拉曼。拉曼光谱可以从获自两个单独的销售商的玻片中获得。将1秒的积分时间用于每次采集，而将5秒的积分时间用于获得来自石英载玻片的拉曼本底。石英载玻片在基线以上几乎不可分辨，而每一玻片具有可测定的本底水平。尽管可以从光谱中扣除本底，但是存在可测定的本底限制了积分时间并且可能阻碍拉曼报道分子的痕量检测。
在这种作用的另一种解释中，可以将来自使用高度纯化的试剂制备的颗粒的本底与那些使用“作为获得的”试剂制备的相同组合物的本底进行比较。因此，本发明提供了降低SACN产生的拉曼光谱中的本底信号的一种方法，包括制备最优化的SACN，其中所述的最优化SACN包括报道分子，并且其中在掺入最优化SACN之前纯化所述的报道分子，并且使用所述的最优化SACN产生拉曼光谱，其中所述光谱的本底信号与由非最优化的相应SACN产生的光谱相比得到降低。
在某些实施方案中，本发明改善的SACN在与公知SACN相比时提供了增加的SERS信号。就某些颗粒的大小和形状而言并且在某些激发波长处，Ag颗粒通常提供了大于Au颗粒的SERS信号。可以预计改善Au胶体合成的再现性产生了更好的SACN候选物。因此，本发明提供了用于改善的Au胶体合成的方法。这类方法的一个实例描述在实施例2中。该方法使用了用于金属还原的NaBH4、Na3柠檬酸盐和NH2OH的组合。这种改善的方法与其它方法(诸如也使用柠檬酸盐作为还原剂的胶体Au的传统合成)相比更为灵活并且产生更具单分散性的颗粒。
在另一个实施方案中，通过一种方法制备用于SACN的纳米颗粒，该方法包括如Freeman等在Journal of Physical Chemistry(1996).100(2).718-24中所述使Ag亚单层涂层沉积在Au纳米颗粒表面上。预计包括这类包被的纳米颗粒的SACN可使来自球形纳米颗粒的SERS信号增加约2倍。
在某些实施方案中，本发明提供了用于优化报道分子负荷以及在SACN上涂布SiO2的方法。为了将报道分子各自成功地掺入SACN，需要测定条件，在该条件下，可以在完成SiO2壳前使最大量的报道分子存在于金属表面上。
在某些实施方案中，使用还可以提供拉曼标记部分的SiO2前体分子制备SACN。该方法应有助于增加来自SACN的SERS信号。例如，4-丙基吡啶三甲氧基硅烷可以提供拉曼报道分子(吡啶基)并且作为SiO2前体通过三甲氧基硅烷起作用。因为SiO2前体和标记不必竞争Au颗粒上的空间，所以能够实现较高程度的标记表面覆盖。例如，商购的硅烷类为可以作为单分子的报道分子/前体应用的硅烷类备用来源。硅烷类的实例包括3-(2，4-二硝基苯氨基)丙基三乙氧基硅烷、2-氰基乙基三甲氧基硅烷和对-氨基苯基三甲氧基硅烷、正-(3-三乙氧基甲硅烷基丙基)-4，5-二氢咪唑。
在另一个实施方案中，给纳米颗粒包被拉曼活性聚合物，诸如合适的聚苯乙烯共聚物、多炔或聚噻吩。这类聚合物可以便利地含有反应基，诸如胺类或硫醇类，以便有利于生物共轭(参见下文)或结合SiO2前体。
为了产生最小直径的SACN，可以减小SiO2的厚度。在典型的实施方案中，SiO2壳的厚度在1-40nm范围。在某些实施方案中，SiO2包囊材料的厚度为5-15nm。尽管在理论上能够制备任意厚度的SiO2壳，但是它可能损害对涂层完整性的维持。在某些实施方案中，对SiO2壳而言重要的是(i)防止金属芯和拉曼标记分子受到损害；(ii)防止可能的光谱干扰物吸附在金属表面上；(iii)为生物官能化提供SiO2表面；和/或(iv)防止金属芯之间的范德华力诱导的聚集。
可以使用单晶Au或Ag纳米杆制备与基于球形纳米颗粒的SACN相比具有改善的信号强度的SACN。电沉积条件(超电势、温度、添加剂等)决定纳米杆的结构，由此决定纳米杆的物理和机械特性。纳米杆的SERS信号可能显著增加，条件是它们为单晶。一般已知外延二维(2D)成核/生长机制需要以极低超电势进行电沉积。近来，使用降低的金属离子浓度、低超电势、升温和向电镀溶液中添加表面活性剂实现了单晶Cu、Ag和Au纳米金属线的电沉积。Wang等，J.Phys.Chem.B2004，108，841-845；Tian等.Nano Lett.2003，3，919-923。
具有18nm和35nm孔径的商购模板可以用于合成具有50-100nm长的单晶金属纳米杆，包括Au纳米杆。具有(111)-生长取向和200nm厚度蒸发的Ag可以用作底物。可以通过使用参比电极在恒电势模式下进行电沉积以便精确控制沉积过程中的超电势。可以评价诸如溶液组成和温度这类重要条件以便实现Au纳米杆的缓慢外延2D-成核和生长。高分辨率TEM揭示出该纳米杆的结构，并且X射线衍射可以用于确定晶体取向。为了更好地利用模板，可以通过依次电镀由具有相同(111)-取向的薄(10-20nm)Ag节段分隔的Au纳米杆制备每孔中的多颗粒。在理论上，能够使用这种方法完全填充孔。当模板一般为50-60μm厚时，能够制备超过每孔400 100-nm长的颗粒。相同(恒电势)电沉积技术可以应用于通过使用(111)Cu底物作为选择性可蚀刻电镀基质合成Ag纳米杆。
作为备选(和可能的较低廉)方法，可以使用或采用基于溶液的方法制备Au纳米杆，所述的方法报道在Nikoobakht和EI-SayedNikoobakht，B和El Sayed M.A.的“使用种晶介导的生长方法的金纳米杆(NRs)的制备和生长机制”-Chem.Mater.2003，15，1957-1962中。在基于溶液的方法中制备的纳米杆的TEM图像如附图5中所示。在该样品中，纳米杆的平均大小约为10nm×50nm，但在颗粒大小和形状方面仍然存在相当的变化，正如根据形成的纳米立方体所观察到的。基于溶液的方法易于按比例放大至较大体积。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于降低SACN产生的拉曼光谱中的本底信号的一种方法，包括制备最优化SACN，其中通过一种方法制备所述的最优化SACN，该方法包括在制备SACN过程中除去以不可逆方式结合在颗粒表面上的材料，其中所述的光谱的本底信号与未最优化的相应SACN产生的光谱相比得到降低。在一个实施方案中，通过剧烈氧化SACN中间体，随后适度还原进行除去步骤。除去步骤可以包括用氧化剂，诸如UV-产生的臭氧/氧自由基的组合处理金属纳米颗粒，随后用还原剂，诸如乙醇处理，以便除去外源性有机物。清洁SERS活性金属表面的实例描述在Ron等，Langmuir1998，14，1116-1121中。在一个实施方案中，金属为Au。在该方法的过程中，Au表面被转化成不稳定的氧化金且随后被乙醇还原。在另一个实施方案中，该方法包括用UV-产生的臭氧/氧自由基的组合(氧化剂)处理金属，随后用报道分子在乙醇中的溶液处理，以便在还原时报道分子的吸附即刻发生。在其它实施方案中，通过离心除去乙醇并且在额外的步骤中加入报道分子。
在某些情况中，可以在试验中引入提供本底噪声的种类。例如，已经发现用于过滤和制备样品的某些膜可以将本底引入包括SACN颗粒的试验的拉曼光谱。因此，在一个实施方案中，本发明提供了用于降低SACN颗粒的拉曼光谱的本底信号的一种方法，包括制备用于分析的样品，所述的制备包括从样品或试验系统中除去提供本底信号的物质。在另一个实施方案中，本发明提供了用于降低SACN颗粒的拉曼光谱中的本底信号的一种方法，包括从提供试验成分中除去本底信号的物质。
SACN的应用使用高通量多路系统(high-throughput multiplex system)发现的新药物为活跃的研究领域。自动化和组合化学可以产生数以百万计的新结构。分析这些药物需要高通量和高灵敏度。SACN技术的应用提供了高度多样的手段。拉曼光谱法因拉曼峰的尖锐度而对提供标记-多路能力是理想的，并且SERS提供了许多独特的标记机会。在某些实施方案中，使用大量包括拉曼活性分子和一种或多种部分的SACN进行多路试验。所述的部分能够选择性结合于样品流体中的一种或多种可检测物质上，而报道分子可以用于鉴定流体中的SACN(和由此结合的部分)。当各SACN相对较小并且当可以独立地鉴定的靶物数量可能十分巨大时，可以通过包括大量不同的SACN在单一流体样品中进行大量的各个试验。
典型的拉曼光谱横跨3000cm-1。参见图1。在一个实施方案中，通过生成多个不同的包括结构相关的报道分子的SACN集中光谱中相对窄的区。例如，一组结构相关的报道分子可以包括吡啶、吡啶-d5(氘化吡啶)和吡啶-15N，4-(甲氨基)吡啶、4-氨基吡啶、4-巯基吡啶、4-吡啶甲醇、4-羟基吡啶和2，3，5-三甲基吡啶。因为拉曼光谱基于振动模式，所以活性结构上小的改变可以提供唯一的拉曼带。因此，用多个结构相关的报道分子修饰单个SERS活性结构，例如纳米颗粒，以便产生多个SACN，它们各自具有唯一的SERS光谱和相似的活性反应性。这种手段可能需要极高的光谱分辨率和由此可能较大和/或昂贵的单色器。
在另一个实施方案中，使用完整的光谱(而非其小区)。在该实施方案中，制备多个共同带有广泛分隔的振动带的SCANs。在某些实施方案中，计算机程序可以便利地用于从指定的一组各自具有某些光谱特征的SACN或报道分子中做出选择。在一个实施方案中，将计算机程序设计成基于使用者指定的光谱分类标准选择多个SACN或报道分子。或者，将计算机程序设计成按照光谱分类等级产生可能的SACN或报道分子组。可以预计没有单一类型的报道分子在整个谱窗宽内表现出谱窗宽，且由此在该实施方案中，将各种分子用作报道分子。可以根据下列4种标准的指导对所述的分子进行选择1.报道分子具有拉曼活性振动模式，即在振动过程中产生偏振性改变的模式。
2.报道分子吸附在任意SERS活性表面上，即ΔGads＜＜0。
3.报道分子具有尽可能少的带，以便使自由的“光谱空间”最大化。带有N原子的非线性分子表现出3N-6允许的振动(IR+拉曼)。显然较小的分子是有用的，不过，必需使NΔGads保持平衡，一般对大分子而言更具负性。
4.报道分子与颗粒合成和封端方案以及玻璃成型化学本中的含水环境相容。
对各种分子的拉曼光谱可获得制成表的信息资源。例如，参见Nakamoto，K.Infrared and Raman Spectra of Inorganic andCoordination Compounds；4th Ed.，John Wiley&Sons.IncNewYork；1986；Lin-View.D.Colthup，N.B.；Fcld.M.S.；Grasselli.J.G.The Handbook of Infrared and Raman CharacteristicFrequencies of Organic Molecules；Academic PressSan Diego，CA；1991；Socrates.G.Infrared and Raman Characteristic GroupFrequencies，Table and Charts，3rd Ed.，John Wiley&Sons，LtdChichester，2001. Workman，J.，Jr.Handbook of OrganicCompounds；NIR，IR，Raman，and UV-Vis Spectra Featuring polymersand Surfactants.Academic Press San Diego，CA.2001.Vol 3，Schrader.B.Raman/Infrared Atlas of Organic Compounds，2nd Ed.，VCH PublishersNew York，NY，1989；Hendra.P.J.和Agbenyega J.K.The Raman Spectra of Polymers；John Wiley&Sons Ltd.Chichester 1993，将所有这些文献引入本文作为参考。使用上述标准，将下列类型的候选报道分子鉴定为用于SACN的报道分子。
有机分子小尺寸、不饱和、杂原子和负电性取代基均可以产生独特的特征。具有已知拉曼特征的实例吡啶类；三嗪类；嘧啶类；吡咯类、唑类、咪唑类、呋喃类、氰化物、氨基氰类及其衍生物(即2-，3-，4-官能化的)。乙炔类、硝基/亚硝基、-CCl2和-CCl3均可以产生独特的指纹带。异硫氰酸酯类(R-N＝C＝S)和异腈类(R-N≡C)特别具有吸引力，因为它们为强拉曼散射体，与Au吸附，在任意常用官能基不共有的能量下具有振动，并且振动光谱强烈依赖于R-基团的负电性。
有机/无机阴离子极其简单的光谱(通常为单峰)为大的+。产生简单光谱的报道分子的实例包括氰化物、SCN-、ClO3-、HCO2-等。在金属颗粒合成时可以包括它们中的某些。例如，胶体Au带有来源于HAuCl4的紧密结合的Cl-残基。能够从其它金属盐开始，尤其是如果使用强还原剂，如NaBH4更是如此。
配位络合物和其它含有过渡金属的化合物金属配位键是在较低拉曼位移，即200-800cm-1处产生振动特征的极佳机会。同样，基于配体的振动自身相对于未配位态移动，并且如果可能，改变金属的氧化还原态可以使两种带的能量移动。两可态(Ambidentate)配体，如SCN-特别有吸引力，因为它们可以使金属离子与金属表面桥连。在另一个实施方案中，可以使用含有一种或多种强SERS活性配体的配合物(例如在Fe(CN)63-或Fe(CN)64-中的氰化物)或在[Ru(bipy)32+]中的2，2′-联吡啶(bipy))。或者，例如那些含有一种或多种金属-碳键的有机金属种类(例如二茂铁)可以表现出强拉曼光谱。
混合化合价的种类普鲁士蓝和WO3为振动光谱作为金属离子氧化还原态的功能改变的材料的实例。后者特别有意义，因为H+(即制成HxWO3)、D+或Li+嵌入允许连续调谐(tuning)。
同位素改变减少量的振动模式是转移其能量的极佳手段并且易于通过同位素取代获得。例如，氘化BPE、氘化4，4′-联吡啶和氘化双-(吡啶基)乙炔类；和吡啶、吡啶-d5(氘化吡啶)和吡啶-15N。
可以使用光谱重叠软件与诸如直接的传统最小二乘法这类方法便利地评价光谱的独立性，它合并了本底扣除和峰点鉴别。这类软件的应用允许对比其它候选报道分子评价候选报道分子。这类软件允许输入纯的报道分子光谱并且产生对混合物中的各成分定量的输出信息。
一旦选择了报道分子，就可以校准SACN的信号强度，由此得到具有每个编号颗粒具有等同信号的SACN。使用分子荧光团不可能的这种能力确保了对指定测定值的最大可能的动态范围。在一个实施方案中，校准过程包括两个步骤。在第一个步骤中，测定了用于报道分子的鉴定特征的强度比。在第二个步骤中，制备了包括减少量报道分子的SACN，所述报道分子的减少量由其强度比与最弱报道分子的强度比的单数定义，但不包括含有最低强度信号的SACN。该方法推定了通常对一定范围报道分子观察到的以低报道分子浓度的线性吸收(另外参见实施例8)。在另一个实施方案中，可以通过在SACN合成过程中增加纳米颗粒表面上SiO2前体(硅烷)的量，由此减少报道分子吸附来对报道分子的吸附进行校准。这些方法产生了多个具有基本上等同峰强度的SACN。在某些实施方案中，本文所用的基本上等同指的是峰强度彼此在10％的范围内。在其它实施方案中，基本上等同指的是峰强度彼此在5％的范围内，且在其它实施方案中，基本上等同指的是峰强度彼此在1％的范围内。
本发明包括在颗粒溶剂可进入部分上含有反应基的SACN，诸如-SH、-NH2或-COO-。在某些实施方案中，反应基与包囊材料结合。本发明提供了用于制备生物缀合的SACN的一种方法，包括制备含有诸如硫醇活性这类反应基的SACN的用于生物缀合的活性SACN。在使用SiO2包囊SACN的实施方案中，可以衍生表面硅烷醇基团。可以使SACN的二氧化硅壳官能化以便在制备SiO2壳的过程中(“直接修饰”)或在完全形成壳后(“修饰后”)携带游离巯基。修饰硅烷醇基团的许多反应为本领域技术人员公知。例如，可以修饰SiO2表面以便提供胺类(通过与氨基丙基三甲氧基硅烷(APTMS))或乙醇盐(3-缩水甘油基氧基丙基-三甲氧基硅烷(GPTMS)反应)。还存在掺入了巯基、羧基和其它用于缀合的潜在位点的试剂。实施例4中描述了硫醇活性SACN的制备。
硫醇-活性SACN用于制备与生物分子，例如肽类、蛋白质和核酸缀合的SACN。为了结合抗体，可以用APTMS来获得氨基且随后进行碳二亚胺化学反应以便结合抗体。或者，GPTMS可以用于产生乙醇盐表面，抗体上的胺类与之直接反应。在其它实施方案中，使用烷基卤、卤代乙酰基和苄基卤基团终止的硅烷类可以用于与蛋白质中的半胱氨酸基团反应。实施例5中描述了生物缀合的SACN的制备。玻璃表面的清洁和存在离子可以对成功衍生具有影响。
在某些实施方案中，可以如本文所述使用作为直接产生的SACN。然而，在其它实施方案中，在SiO2表面“清洁”或修饰，包括与酸或碱反应后获得了更好的效果。
就每种研发的方法而言，可以滴定衍生试剂(例如硅烷类)和生物分子的量以便控制衍生水平。荧光标记的抗体，包括多种商购的可以用于对表面上存在的材料的量进行定量的抗体。当变量最优化时，可以监测这一情况。为了测定生物分子是否保持反应性，可以将生物分子的荧光染料标记的结合配偶体与颗粒混合，使用未包被的颗粒作为对照。例如，可以将链霉抗生物素包被的SACN与荧光染料标记的生物素混合。可以离心所得颗粒，除去上清液并且测定颗粒的荧光。
在某些实施方案中，使用异双官能交联剂4-[N-马来酰亚氨基甲基]环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(磺基-SMCC)使生物分子与硫醇活化的报道分子结合。这种分子含有与巯基反应的马来酰亚胺基和优选与伯胺类反应的磺基-NHS酯。在这种情况中，单一的单罐反应可以用于结合链霉抗生物素并且易适合于结合大部分蛋白质、氨终止的寡核苷酸或其它携带伯胺类的分子。
可以使用与伯胺类反应生成游离羧酸酯的琥珀酸酐处理表面上带有氨官能基的SACN。碳二亚胺可以用于连接生物分子，诸如链霉抗生物素上的胺类。还可以使用同双官能连接基，诸如戊二醛使胺-包被的颗粒与生物分子上的胺类连接。备选方案在于首先使用2-亚氨基硫茂烷(Traut试剂)将蛋白质的胺部分转化成巯基且随后使用磺基-SMCC与颗粒连接。
可以纯化生物缀合的SACN，一部分目的在于降低非特异性结合。就抗体-缀合的SACN的而言，游离抗体可以与SACN竞争抗原，从而降低了敏感性。在一个实施方案中，通过离心，包括一次以上的离心纯化SACN。可以通过在荧光标记蛋白中掺杂以分光光度方式测定纯化效率。因为已知除荧光染料可以与玻璃表面相互作用外，所以必需证实使用放射性标记的蛋白质的结果。可以将正切流动过滤装置用于纯化二氧化硅包被的颗粒和纯化缀合的SACN。
需要消除或降低SACN的非特异性结合(NSB)。可以在载玻片、微孔板和固定细胞上测试SACN。可以鉴定不同缀合方案各自影响NSB的水平和表面覆盖度。例如，可以测定包括不同pH和缓冲剂在内的标准封闭剂和洗涤缓冲剂，诸如Tween和酪蛋白的作用。在一个实施方案中，可以通过使用封闭剂，包括本文所述的试剂封闭颗粒减少NSB。在一个实施方案中，如实施例6中所述，封闭剂为BSA。或者，可以通过SiO2壳的基于聚合物的衍生，诸如使用聚丙烯酰胺、聚乙二醇和葡聚糖、聚乙烯亚胺和树枝状大分子降低或消除NSB，已知它们均具有低NSB。此外，还可以使用商购微阵列玻璃包被试剂。
在一个实施方案中，缀合的SACN在SACN与共轭生物分子之间包括间隔分子。不受理论约束，认为某些间隔分子，诸如聚乙二醇或葡聚糖可以减少NSB。可以通过本文所述和本领域公知的其它方法将间隔分子引入生物缀合的SACN。例如，可以使用将分散的PEG亚单位引入磺基-SMCC的商购交联剂。生物分子可以与这种基于PEG的连接基连接。类似地，功能PEG分子可以与抗体一起与SACN共缀合。在这方面，PEG作为间隔基起作用以便在试验中暴露的二氧化硅表面与不需要种类的接触减少到最低限度。或者，能够首先使双官能PEG分子与SACN缀合。然后PEG的可利用官能基可以进一步用于与抗体或其它生物分子共轭。
在一个实施方案中，本发明提供了用于检测靶分析物的试验和试剂盒。所述的分析物可以为任意一种检测和/或测定所需的具体物质或成分。所关注的分析物包括例如抗原(诸如对细菌、病毒或原生动物生物体具有特异性的抗原)；抗体，包括那些对感染、过敏反应应答的抗体或疫苗、激素、蛋白质和其它生理物质(例如人体绒毛膜促性腺激素、雌激素、黄体酮、睾酮、皮质类固醇、人生长因子、血红蛋白和胆固醇)、核酸；各种酶、治疗化合物和违禁药品、污染物和环境污染物或任意数量的天然或合成物质。
在一个实施方案中，本发明提供了使用可以用于取代ELISA类型测定法的夹心式免疫测定法。酶联免疫吸附测定(ELISA)的分析技术和相关技术为目前最广泛各种的免疫测定法。常规的ELISA操作步骤一般包括最初使俘获抗体吸附在固体支持物上。在与样品一起保温时，形成抗体-靶蛋白复合物。最终的夹心式免疫测定复合物一般包括能够允许对抗原浓度进行光学测定的指示酶。然而，在使用SACN而非指示酶的夹心式免疫测定中，SACN用于进行光学检测。在该实施方案中，可以使用精确已知浓度的与表面连接的特异性活性抗体种类制备生物缀合的SACN，并且可以使用结合试验与蛋白质定量测定法，诸如BCA测定法进行定量。如实施例11中所述，这类试验可以是多路的。
本发明的方法用于检测生物来源的样品中的分析物。这类样品包括，但不限于血液或血清、唾液、痰、泪、汗或其它分泌流体、尿或粪便物以及生物来源的流体，诸如脑脊液、间质液、细胞提取物等。全血为用于来自SACN的SERS测定的合适的介质。参见图20。
最少体积的样品用于本试验，包括范围在约1μl-约500μl的样品体积，在某些实施方案，约为1μl-约100μl，在其它实施方案中，约为5μl-约50μl，在其它实施方案中，约为10μl-约30μl。如果情况允许，诸如在监测样品体积可以在毫升数量级的血库的批量血液的情况中，可以使用较大的样品体积。如果情况允许，也可以使用较小体积，例如在细胞试验的情况中，可以使用这种体积的细胞。在靶向胞内成分的试验中，可以使用该体积的胞内成分。在这类细胞或亚细胞试验中，体积可以低至1pL。
本发明的试验基于结合试验，诸如，但不限于免疫测定法。在这类结合试验中涉及的结合配偶体包括，但不限于下列结合配对抗体与抗原或半抗原；激素与受体；生物素与抗生物素蛋白；碳水化合物与凝集素；效应分子与受体分子；酶与辅因子、底物或抑制剂；适体及其靶物；和互补核苷酸序列。因此，下文包括的描述和实施例用于示范目的且不应看作对所寻找的特定应用的限定。
在一个实施方案中，本发明包括用于监测至少一种分析物存在的方法，该方法包括下列步骤a)使怀疑含有分析物的样品接触至少一种对侧流试验表面上的该分析物特异性结合的配偶体，以便结合样品中的分析物；b)在上述步骤(a)之前、同时或之后，使至少一种分析物的结合配偶体与SACN结合，以便形成缀合的SACN；和c)检测SERS信号，由此根据信号的强度或存在确定样品中存在分析物。
在一个实施方案中，将样品置于样品区上。样品向下过滤通过样品区，然后通过含有标记例如缀合的SACN的标记区。SACN结合样品分析物而形成复合物且然后该复合物沿着膜或检测带移动。如果存在，那么SACN-分析物的复合物结合至少一种固定在膜上的检测区中的特异性结合配偶体。与特异性结合配偶体形成这种SACN-标记的复合物产生可检测的SERS信号，显示了分析物存在于样品中的阳性结果。例如，在分析物为IL-5的情况中，SACN可以与IL-5抗体缀合并且IL-5的相应俘获抗体可以存在于检测区中。侧流试验描述在实施例12中。
在一个实施方案中，生物样品为细胞。该细胞可以为活细胞或死亡细胞。可以通过许多方法获得含有拉曼光谱信息的细胞的图像。可以使显微镜与CCD照相机连接，以便可以获得物体的完整图像。然后在样品与照相机之间插入波数过滤装置，诸如单色器或液晶可调滤波器。过滤装置仅允许散射线的窄带宽在任意时间达到照相机。采集多个图像，它们各自覆盖散射线的小光谱范围。在软件中组装来自图像中各点的光谱。在另一极端情况下，可以使来自图像单点的光通过单色器分散并且可以在阵列检测器上获得该点的完整光谱。然后扫描该物体，以便分别获得图像中的每个点。然后在软件中组装拉曼图像。在另一种手段中，可以构建使用放射线激发样品的线扫描仪。沿CCD照相机的一条轴对线进行空间成像，而线同时延正交轴发生光谱分散。照相机的每个读数器均获得了线上每个空间像素的完整光谱。为了完成图像，通过样品扫描线。
因此，按照本发明，可以通过使用应用结合细胞表面抗原受体的的抗体制备的抗体-缀合的SACN鉴定细胞或细胞群，所述的细胞表面抗原受体在细胞亚群上表达。还可以通过夹心式手段鉴定细胞和细胞群。例如，实施例13中描述了一种试验，其中将NeutrAvidin缀合的SACN施加在为Her2受体和生物素化抗-小鼠抗体染色的SK-BR-3细胞上。需要新的基于高流通量细胞的筛选技术以便与生长的化合物库和几乎每日发现的新治疗靶保持相同步调。例如，Vitra BiosciencesCell PlexTM卡考虑到了细胞试验的多路技术。可以考虑到试验方式中的通用性的另一种手段在于使用独特的标识符给细胞编码。这可以允许同时研究细胞群，由此增加处理量。例如，可以用1型SACN编码A型细胞，用2型SACN编码B型细胞等。可以在进行细胞试验前将这些细胞彼此混合。使用传统的荧光法，诸如GFP进行细胞试验。可以通过使用拉曼显微镜或使用拉曼检测分选的细胞读取荧光测定实验结果和解码细胞类型的SERS完成最终分析。这种策略允许研究混合细胞群中的表型。
SACN还可以用于检测胞内靶物。可以通过下列方式将SACN导入细胞显微注射；电穿孔；胞吞介导的手段，包括利用两亲肽类，诸如PEP-1，利用基于阳离子脂质的试剂，诸如Lipofectamine(Invitrogen)以及利用胶束和转染试剂，诸如转铁蛋白、甘露糖、半乳糖和Arg-Gly-Asp(RGD)，和其它试剂，诸如基于树枝状大分子的试剂SuperFect(Qiagen)。胞内间接法可以用于证实颗粒与所需靶物结合。证实探针特异性的最简单的方法在于使用免疫荧光验证SACN的位置。存在大量用于标记活细胞内细胞结构(诸如线粒体、高尔基体和内质网)的荧光探针。通过共轭靶向相同结构的抗体，可以测定颗粒主动标记其靶物的颗粒的部分和有多少百分比为非特异性结合的。另一种验证SACN位置的手段在于使用荧光融合蛋白，诸如GFP及其类似物。
本发明涉及在医学诊断中展现出重要特性的显像剂。更具体的说，本发明涉及包括SACN的显像剂。本发明的显像剂一般用于给患者成像和/或特异性诊断患者体内存在的患病组织。通过选择的组合物，可以调节SACN的激发和发射以便在组织吸收和散射的最小区域中在633nm-1000nm之间发生。可以通过下列步骤实施成像过程对患者给予本发明的显像剂且然后使用可以进行光谱成像的任意系统，诸如空位扫描共聚焦显微镜、线扫描系统和光学结合性体层摄影系统扫描患者。还可以用仅在单波长带内检测的成像系统、上述以及具有激发光源和滤过图像检测的任意荧光成像系统观察本发明的SACN。其它合适的成像系统和方法描述在HANDBOOK OF OPTICAL和BIOMEDICALDIAGNOSTICS，Valery Tuchin editor(2004)Springer中。还包括时域法，诸如动态光散射光谱法和体层摄影术、飞行时间成像、准弹性光散射光谱法、光子-关联光谱法、多普勒光谱法和扩散波光谱法。所有这些技术均允许光子与它们所基于的时间标记之间存在差异。由于SACN具有非荧光物质的不同时间标记等，所以可以使用这些方法将它们与组织和其它标记区分开来。有用的仪器参数为可调节的光源和时间灵敏性检测器。可以脉冲或连续进行调节。
扫描可以产生患者体内区和/或该区内的患病组织的光谱或图像。所谓患者区指的是患者整体或患者的特定区域或部分。显像剂可以用于提供脉管系统、心脏、肝和脾的图像并且用于在胃肠区或其它体腔中成像或用于对本领域技术人员而言显而易见的其它方式中，诸如组织表征、血池显像等。
本发明还提供了体内诊断异常病理情况的一种方法，包括将多个靶向至涉及异常病理情况的分子的SACN导入接触异常病理情况的体液中，其中SACN与至涉及异常病理情况的分子结合，并且使在体内结合的SACN成像。该方法一般应用于探针可接近的任意器官胃肠道、心脏、肺、宫颈、乳腺等。在某些实施方案中，就结肠镜检查而言，可以通过内窥镜导入SACN，或使用针导入SACN或将SACN与一次性吸管或套管一起使用。在其它实施方案中，可以通过成像探针自身直接导入SACN。例如，可以将光导纤维或光导纤维束各自导入活生物体用于成像并且已经证实对神经、脑、微血管、细胞进行了成像并且对生物分布进行了表征。凝胶包被的光导纤维在传感器文献中众所周知。SACN可以与凝胶非共价结合，从而在导入时扩散入相关组织。可以预计到各种用于将SACN固定在纤维外表面上以使其扩散入它们所接触的液相的其它方法。
在一个实施方案中，本发明提供了用SACN标记动物的一种方法，包括将SACN导入动物。可以通过任意合适的方式，诸如通过皮下植入或静脉内将SACN导入动物并且使用合适的设备进行检测(参见15)。本发明还提供了用于动物，诸如家畜或家庭宠物的鉴定系统和相关方法，通过使用在兽皮或皮肤下植入的SACN鉴定动物来进行。
应注意上述描述仅是对本发明的解释。本领域技术人员可以在不脱离本发明的情况下设计各种备选和修改方案。因此，本发明用于包括所有这类备选、修改和变形方案，它们均属于本发明披露的范围。
就完整性而言，在下面编号的条款中列出了本发明的各个方面1.一种方法，包括a)使金属沉积入模板孔，其孔径小于300nm；b)使第二金属沉积入所述模板的所述孔，其中所述第一材料和所述第二材料中的至少一种的沉积包括法拉第电化学过程以便生成分节段的孔结合的纳米颗粒；c)重复步骤a)；和d)从所述分节段的孔结合的纳米颗粒中释放所述的第二材料和所述的模板以便生成至少两种自由的金属纳米颗粒。
2.条款1所述的方法，其中所述的自由的金属纳米颗粒具有10-300nm长和15-300宽。
3.条款1所述的方法，进一步包括重复步骤b)和c)的步骤。
4.条款1所述的方法，其中所述的模板为氧化铝。
5.条款1所述的方法，其中所述的第二材料为金属。
6.条款5所述的方法，其中所述的第二材料为Ag。
7.条款1所述的方法，其中所述的金属为Au。
8.条款4所述的方法，其中所述的第二材料为Ag。
9.条款8所述的方法，其中所述的模板为氧化铝。
10.条款1所述的方法，其中所述的释放包括用强酸处理，随后用强碱处理。
11.条款10所述的方法，其中所述的强酸为硝酸并且所述的强碱为NaOH。
12.条款1所述的方法，其中所述的电沉积选自脉冲电镀、脉冲电流电镀、反向脉冲电流电镀和双脉冲电镀组成的组。
13.条款1所述的方法，进一步包括在步骤c)的过程中提供短SAM-分子的步骤。
14.条款1所述的方法，其中所述的释放包括使用提供SERS活性分子的溶液。
15.一种方法，包括a)使金属沉积入模板孔，其孔径小于300nm；b)使第二金属沉积入所述模板的所述孔，其中所述第一材料和所述第二材料中的至少一种的沉积包括法拉第电化学过程以便生成分节段的孔结合的纳米颗粒；c)重复步骤a)；和d)从所述分节段的孔结合的纳米颗粒中释放所述的第二材料和所述的模板以便生成至少两种自由的多孔金属纳米颗粒。
16.一种方法，包括a)使第一金属沉积入模板孔，其孔径小于300nm；b)使第二金属沉积入所述模板的所述孔；c)使第三种材料沉积入所述模板的所述孔，其中所述第一材料和所述第二材料中的至少一种的沉积包括法拉第电化学过程以便生成分节段的孔结合的纳米颗粒；d)重复步骤a)和b)；和e)从所述分节段的孔结合的纳米颗粒中释放所述的第三种材料和所述的模板以便生成至少两种自由的多孔金属纳米颗粒，它们各自包括所述的第一金属和所述的第二金属。
17.条款16所述的方法。
18.条款16所述的方法，其中所述的第二金属为有磁性的。
19.一种方法，包括制备最优化SACN，其中通过一种方法制备所述的最优化SACN，该方法包括除去在制备SACN的过程中以不可逆方式与颗粒表面结合的材料，其中所述光谱的本底信号与未最优化的相应SACN产生的光谱相比得到降低。
20.条款19所述的方法，其中所述的除去包括下列步骤a)氧化；和b)还原。
21.条款20所述的方法，其中所述的氧化包括使SACN接触UV-产生的臭氧/氧自由基。
22.条款20所述的方法，其中所述的还原包括使SACN接触乙醇。
23.条款22所述的方法，其中将所述的报道分子在乙醇中溶解，以便报道分子的吸附可以在还原时即刻发生。在其它实施方案中，通过离心除去乙醇，并且在一个额外的步骤中加入报道分子。
24.一种方法，包括在使用SACN颗粒的试验中降低本底信号，其中所述的降低包括从选自所分析的样品、SACN颗粒和试验容器的成分中除去杂质。
25.一种方法，包括a)制备多个SACN颗粒，它们各自包括不同的拉曼报道分子；b)测定拉曼报道分子的强度比；和c)制备第二批多个SACN颗粒，它们具有对具有最弱强度的报道分子校准的报道分子强度，由此制备了在拉曼光谱上具有基本上等同的峰强度的多个SACN。
26.条款25所述的方法，其中通过制备具有减少量的报道分子的SACN校准报道分子强度，其中将减少的量定义为该报道分子与最弱报道分子的强度比的倒数。
27.条款25所述的方法，其中通过制备具有增加量的硅烷的SACN校准报道分子强度，其中将增加量定义为该报道分子与最弱报道分子的强度比的倒数。
28.SACN，包括纳米颗粒芯、拉曼活性报道分子、SiO2包囊用材料和选自-SH、-NH2和-COO-的反应基。
29.一种方法，包括a)提供纳米颗粒；b)使拉曼活性报道分子与所述的纳米颗粒结合；c)用SiO2包囊纳米颗粒；和d)修饰SiO2以便带有选自-SH、-NH2和-COO-的反应基，由此制备活化的SACN。
30.条款29所述的方法，其中所述的修饰包括在包囊步骤过程中修饰。
31.条款29所述的方法，其中所述的修饰包括在包囊步骤后修饰。
32.条款29所述的方法，其中所述的修饰包括提供胺类。
33.条款32所述的方法，其中通过与氨基丙基三甲氧基硅烷(APTMS))或乙醇盐(3-缩水甘油基氧基丙基-三甲氧基硅烷(GPTMS))反应进行所述的修饰。
34.条款29所述的方法，进一步包括使生物分子与所述的活化SACN结合，由此制备生物缀合的SACN。
35.条款34所述的方法，所述的生物分子选自蛋白质和核酸组成的组。
36.条款34所述的方法，其中所述的结合包括使所述的活化SACN与所述的生物分子通过选自下列化合物的化合物反应异双官能交联剂4-(N-马来酰亚氨基甲基环己烷-1-羧酸磺基琥珀酰亚胺酯、琥珀酸酐、碳二亚胺；同双官能连接剂戊二醛、2-亚氨基硫茂烷；和任意上述化合物的组合。
37.条款34所述的方法，进一步包括纯化所述的生物缀合的SACN。
38.条款37所述的方法，其中所述的纯化选自离心和正切流动过滤组成的组。
39.条款34所述的方法，进一步包括使间隔分子与生物缀合的SACN结合，其中所述的间隔分子位于纳米颗粒与生物分子之间。
40.条款39所述的方法，其中所述的间隔分子选自聚乙二醇和葡聚糖组成的组。
41.生物缀合的SACN，包括a)纳米颗粒；b)与所述的纳米颗粒结合的拉曼活性报道分子；c)SiO2包囊材料；和
d)选自蛋白质和核酸的生物分子。
42.条款41所述的生物缀合的SACN，其中所述的步骤为抗体。
43.条款41所述的生物缀合的SACN，进一步包括纳米颗粒与生物分子之间的间隔分子。
44.条款43所述的生物缀合的SACN，其中所述的间隔分子选自聚乙二醇和葡聚糖组成的组。
45.用于检测分析物的一种方法，包括a)获得生物样品；和b)使该样品接触包括与分析物结合的生物分子的生物缀合的SACN；和c)检测与所述生物缀合的SACN结合的分析物。
46.条款45所述的方法，其中所述的生物分子为抗原，且所述的分析物为抗体。
47.条款45所述的方法，其中所述的生物分子和所述的分析物为肽类或蛋白质。
48.条款45所述的方法，其中所述的生物分子和所述的分析物独立地选自激素和受体。
49.条款45所述的方法，其中所述的生物分子和所述的分析物独立地选自生物素和抗生物素蛋白。
50.条款45所述的方法，其中所述的生物分子和所述的分析物独立地选自碳水化合物和凝集素。
51.条款45所述的方法，其中所述的生物分子和所述的分析物独立地选自效应分子和受体分子。
52.条款45所述的方法，其中所述的生物分子和所述的分析物独立地选自酶和选自辅因子、底物和抑制剂组成的组中的成员。
53.条款45所述的方法，其中所述的生物分子和所述的分析物为互补核苷酸序列。
54.权利要求45所述的方法，其中所述的样品选自血液、血清、唾液、痰、泪、汗、另一种分泌的流体、尿、粪便物、脑脊液、间质液、细胞提取物和细胞组成的组。
55.一种方法，包括a)使怀疑含有分析物的样品接触至少一种对侧流试验(Lateral-flow assay)表面上的该分析物特异性结合的配偶体，以便结合样品中的分析物；b)在上述步骤(a)之前、同时或之后，使至少一种分析物的结合配偶体与SACN结合；和c)检测SERS信号，由此根据信号的强度或存在确定样品中存在分析物，其中确定样品中存在至少一种分析物。
56.一种方法，包括a)提供与CCD照相机连接的显微镜；b)提供细胞；c)使细胞接触至少一种能够特异性结合该细胞或细胞部分的SACN；d)在细胞与照相机之间配备波数过滤装置；和e)获得多个数据组，和f)汇编数据组；由此获得了SACN的空间特性。
57.权利要求56所述的方法，其中所述的波数过滤装置选自单色器、陷波滤波器、滤光轮、声光可调滤波器、傅里叶变换干涉滤光器、液晶可调滤波器及上述装置的组合组成的组。
58.权利要求56所述的方法，其中所述的波数过滤装置包括液晶可调滤波器，并且所述的获得包括a)在第一个频率上获得数据；和b)可选地获得第二个和随后频率上的数据。
59.权利要求56所述的方法，其中所述的获得包括a)将光从单点位置通过单色器分散；b)获得阵列检测器上该点的完整拉曼光谱；和c)在多个位置上重复a)和b)。
60.权利要求56所述的方法，其中所述的获得包括a)用发射线激发样品；b)获得线中各空间像素的完整光谱；和c)扫描通过样品的线。
61.纳米颗粒，包括a)金属纳米颗粒；b)一种以上与所述的纳米颗粒结合的拉曼活性报道分子；和c)SiO2包囊用材料。
62.条款61所述的纳米颗粒，其中一种以上拉曼活性报道分子包括4-巯基吡啶和反式-4，4’双(吡啶基)乙烯。
63.纳米颗粒，包括a)芯/壳纳米颗粒；b)与所述的芯/壳纳米颗粒结合的至少一种拉曼活性报道分子；和c)SiO2包囊用材料。
64.权利要求63所述的纳米颗粒，其中所述的芯/壳纳米颗粒进一步选自Au2S芯/Au壳颗粒、Ag芯/Au壳颗粒、二氧化硅芯/Au壳颗粒、二氧化硅芯/Ag壳颗粒、氧化铝芯/Au壳颗粒、氧化铝芯/Ag壳颗粒、TiO2芯/Au壳颗粒和TiO2芯/Ag壳颗粒组成的组。
65.一种方法，包括a)使HauCl4接触羟基酰胺盐酸盐；b)使从步骤a)中获得的该溶液进一步接触柠檬酸钠脱水物和NaBH4的混合物；由此产生了金纳米颗粒。
66.一种方法，包括a)提供通过条款65所述的方法制备金纳米颗粒；b)使拉曼活性报道分子与所述的纳米颗粒结合；和c)用SiO2包囊该纳米颗粒，由此制备SACN。
67.纳米颗粒，包括a)各向异性金属纳米颗粒；b)与所述的各向异性金属纳米颗粒结合的SERS活性报道分子；c)包囊各向异性金属纳米颗粒的SiO2。
68.条款67所述的纳米颗粒，其中所述的各向异性金属纳米颗粒具有选自椭球形、棒形、圆片形、棱锥形、立方体形、圆柱形、纳米螺旋形、纳米弹簧形、纳米环形、杆形纳米颗粒、箭头形纳米颗粒、泪珠形纳米颗粒、四脚动物形纳米颗粒、棱镜形多孔和非几何形状的纳米颗粒的形状。
69.权利要求68所述的纳米颗粒，其中所述的纳米颗粒为非几何形状的并且近似纳米杆形。
70.权利要求69所述的纳米颗粒，其中所述的纳米颗粒具有约250nm直径和约250nm长度。
71.一种方法，包括a)将SACN纳米颗粒显像剂给予患者；b)使用可以进行光谱成像的系统扫描患者；和c)生成患者体内区域的光谱或图像。
72.条款71所述的方法，其中所述的系统选自空位扫描共聚焦显微镜、线扫描系统、光学结合性体层摄影系统、仅检测单波长带的系统、包括激发光源的荧光显像系统和滤过的图像检测组成的组。
73.条款71所述的方法，其中所述的患者区域选自患者整体、脉管系统、心脏、肝和脾、胃肠区组成的组。
74.条款71所述的方法，其中所述的可以进行光谱成像的系统为便携式系统。
75.一种方法，包括a)将多个靶向至涉及异常病理情况的分子的SACN导入存在异常病理情况的患者体内，其中SACN结合与异常病理情况相关的分子；和b)获得结合SACN的图像，由此可以诊断异常病理情况。
76.条款75所述的方法，其中所述的异常病理情况的位置包括胃肠道、心脏、肺、肝、子宫颈、乳腺和结肠。
77.条款71所述的方法，其中所述的SACN与成像探针非共价结合，其中所述的给药包括导入成像探针，且所述的SACN解离入组织或体液。
78.用于标记具有SACN的动物的一种方法，包括将SACN导入动物，其中所述的导入选自皮下植入、静脉内导入组成的组。
79.条款78所述的方法，进一步包括检测SACN或标记的动物。
80.一种方法，包括(a)使组织样品接触至少一种能够特异性结合该组织样品的生物缀合的SACN颗粒；和(b)获得组织/生物分子缀合的SACN颗粒混合物的拉曼图像。
81.条款80所述的方法，其中使所述的组织接触一种或多种额外的非SACN试剂。
82.条款81所述的方法，其中所述额外的试剂选自伊红、苏木精以及苏木精与伊红的组合组成的组。
83.权利要求80所述的方法，进一步包括(a)在条款80的步骤(a)前获得组织样品的本底拉曼图像；和(b)从条款80的步骤(b)中获得的组织/生物分子缀合的SACN颗粒混合物的拉曼图像中扣除本底谱线图。
84.条款83所述的方法，其中使所述的组织接触一种或多种额外的非SACN试剂。
85.条款83所述的方法，其中所述的额外的试剂选自伊红、苏木精以及苏木精与伊红的组合组成的组。
86.条款80所述的方法，进一步包括将拉曼图像与已经用强染色有机染料染色的组织样品图像进行比较以便显示细胞的大小和形状。
实施例实施例1描述了使用硼氢化钠、柠檬酸钠和羟基酰胺盐酸盐的组合进行的～45nm直径Au胶体的典型合成。用王水洗涤所有的玻璃器皿并且用18MΩ的水充分冲洗。反应在冷室中进行。制备0.01％(w/w)HAuCl4·3H2O的水溶液、8％(w/w)的柠檬酸钠二水合物在0.01N NaOH中的溶液、10-4％的硼氢化钠在0.01N NaOH中的溶液和400mM在水中的羟基酰胺盐酸盐的溶液。然后通过将1mL柠檬酸钠溶液与100μl硼氢化钠溶液和500μl 0.01N NaOH合并制备柠檬酸与硼氢化物溶液的混合物。在制备该混合物后，将200μl羟基酰胺溶液注入在250mL锥形瓶中的100mL HAuCl4溶液并且简单搅拌。20分钟后，将硼氢化物/柠檬酸盐混合物诸如快速搅拌的HAuCl4和羟基酰胺的溶液中。当在搅拌涡流中心与锥形瓶壁之间的中间范围内注射时，获得了最佳效果。
实施例2金纳米颗粒的制备。制备在H2O中1％或2％浓度(w/v)的HauCl4·3H2O的储备溶液。将这些溶液通过0.2μm膜过滤，此后将其置于冷室中。另外，一般用铝箔覆盖含有这些储备溶液的瓶以便减少与光的接触。一般制备下列溶液1.在H2O中1.0L 0.02％HauCl4。
2.5mL 32％(w/v)在0.01N NaOH中的柠檬酸钠脱水物。
3.10mL 1.6M在H2O中的羟基酰胺盐酸盐。
4.通过稀释储备溶液制备的10mL 4％(w/v)在1.0N NaOH中的NaBH4。
在使溶液达到室内温度后，所有反应均在冷室中进行。将HauCl4溶液置于2L圆底烧瓶中并且将带有特氟隆桨的玻璃搅棒插入烧瓶以便提供搅拌。向烧瓶中加入1.0mL羟基酰胺溶液并且搅拌。在添加羟基酰胺后，通过顺序稀释4％的储备溶液制备4×10-4％NaBH4的溶液。在0.01N NaOH中制备这些稀释液。然后将1mL 32％的柠檬酸钠与525μl的0.01N NaOH和75μl的4×10-4％NaBH4混合。在添加羟基酰胺后20分钟，向反应烧瓶中加入1.0mL柠檬酸盐/硼氢化物，同时快速搅拌。
实施例3使用4-巯基吡啶(4-MP)和反式-4，4′-双(吡啶基)乙烯(BPE)标记的SACN的SERS光谱。
材料用于所有制备的水为18.2MΩ，并且通过Barnstead纳米纯度系统蒸馏。3-氨基丙基三甲氧基硅烷(APTMS)、HAuCl4·3H2O、柠檬酸三钠二水合物、氢氧化钠、硼氢化钠、羟基酰胺盐酸盐、反式-1，2-双(4-吡啶基)乙烯(BPE)、4-巯基吡啶、硅酸钠、正硅酸四乙酯(TEOS)、乙醇和2.0M在乙醇中的氨获自Sigma-Aldrich。在使用前使BPE重结晶。
胶体制备由HAuCl4·3H2O制备35nm的胶体Au。正如硼氢化钠在0.001N NaOH中的10-2％溶液一样，在合成前即刻制备4％柠檬酸钠和400mM羟基酰胺盐酸盐的水溶液。将300μl这种硼氢化物溶液的等分与500μl柠檬酸盐和350μl的羟基酰胺并且在剧烈搅拌下即刻注入200mL 0.01％HAuCl4。通过使用ImageJ软件的透射电子显微术测定所得颗粒的大小。
SACN制备所有反应均在塑料烧瓶中进行。典型实验使用30ml35nm胶体。通过添加40μl 1.0mM APTMS赋予胶体玻璃性(vitreophilic)并且将其搅拌15分钟。向该溶液中加入拉曼标记混合物(600μl 10-5M 4-巯基吡啶和50μl 10-5M BPE)，然后将该体系再搅拌15分钟。最后加入1.2mL 0.54％硅酸钠并且使其反应42小时。此后，向该溶液中加入120ml EtOH，随后加入1mL 2M氨(在乙醇中)和20μl四乙基正硅酸酯(TEOS)。使该反应进行1天，此后通过离心纯化。如果需要较薄或较厚的壳，那么改变TEOS的这种量。
所得SACN具有两种不同种类的拉曼活性分子4-MP和BPE的12∶1之比的混合物。将这些使用633nm激发(示踪A)和785nm激发(示踪B)获得的4-MP/BPE-SACN的SERS光谱绘制在图6中。为了进行比较，将BPE-SACN(虚线)和4MP-SACN(实线)的拉曼光谱特征绘制在图7中。可以观察到4-MP拉曼信号特征在使用785nm激发获得的4-MP/BPE-SACN光谱中占主要部分，而BPE和4-MP拉曼信号的特征在使用633nm激发获得的光谱中明显。因此，通过谨慎选择两种或多种不同种类的拉曼活性分子及其相对比例，能够制备可根据激发波长的不同提供不同拉曼散射光谱的SACN。这考虑到了多路技术能力的附加水平。
实施例4硫醇-活性SACN的制备A.二氧化硅修饰可以使SACN的二氧化硅壳官能化以便在制备SiO2壳的过程中(“直接修饰”)或在壳晚期形成后(“后修饰”)带有游离巯基。
B.后修饰按照标准方案制备50mL批量的SACN。通过二氧化硅生长的所有阶段进行，但仅应在最终离心后将SACN重新悬浮于10mL水中。由于推定损耗可以忽略不及，所以该步骤从原始胶体产生了5x浓度的SACN。向SACN中加入40mL乙醇。在中度磁性搅拌下加入1mL浓NH4OH(30％，J.T.Bake r#9733-01)。在这种搅拌的同时，制备为900μl乙醇、95μl四乙基正硅酸酯(TEOS，Sigma#333859)和5μl(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷(MPTMS，Fluka#63800)的溶液。向搅拌的SACN中加入100μl该混合物(实际上为9.5μl TEOS和0.5μlMPTMS)并且使反应进行过夜。通过反复离心纯化。旋转并且将沉淀重新悬浮于水中最少3次以确保完全除去乙醇和过量试剂。在最终旋转后持续悬浮至5mL(10x)。
C.直接修饰此外，开始使用典型条件制备50mL批量的SACN。惟一的改变在Stber生长步骤中。如上所述加入1mL浓NH4OH并且搅拌5分钟。然后将47.5μl TEOS与2.5μl MPTMS混合并且将它们加入到标记中。搅拌过夜并且通过离心纯化，将纯化的标记重新悬浮至5mL(10x)。
实施例5SACN的生物共轭使用异双官能交联剂4-[N-马来酰亚氨基甲基]环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(磺基-SMCC，Pierce Biotechnology.Inc))使生物分子与硫醇活化的SACN结合。该分子含有与巯基反应的马来酰亚胺和优选与伯胺类反应的磺基NHS酯。在这种情况中，可以将样品的单罐反应用于结合链霉抗生物素并且易适用于结合大部分蛋白质或带有伯胺类的其它分子。
可以在共轭前浓缩标记。为了如上所述与硫醇活化的标记共轭，首先向5mL 2mM PBS缓冲液(0.54mM KCl，27.6mM NaCl，pH＝7.4)中加入0.25mg链霉抗生物素。加入硫醇活化的标记(5mL，10x浓度)并且充分混合。接下来称量1mg磺基-SMCC并且将其加入到标记和SAv中。即刻通过涡旋混合并且反应1小时，同时在室温下旋转。在1小时后，通过离心纯化标记并且重新悬浮于2mM PBS缓冲液中。可以加入少量0.1％终浓度)的BSA以便将颗粒与离心机壁的粘附减少到最低限度。尽管该反应使用了链霉抗生物素，但是已经使用类似方法共轭了其它蛋白质(包括抗体)。如果在反应中进行更多控制是必不可少的，那么可以将蛋白质“预活化”后添加到标记中。因为磺基-SMCC的马来酰亚胺基十分适合于在水溶液中(～60小时)，所以可以通过与磺基-SMCC反应30-120分钟使生物分子活化，随后通过用脱盐柱纯化。该步骤主要生成可以直接加入到带有巯基的SACBs中的马来酰亚胺活化的生物分子。
就抗生物素蛋白而言，可以使用类似物(包括链霉抗生物素和NeutrAvidinTM)和荧光生物胞素Alexa Fluor594(分子探针#A12922；“生物胞素-594”)以便对与SACN结合的生物分子的数量进行定量。SACN的强可见吸收提示了这种高度灵敏性荧光检测而非使用常规比色法(包括生物素化辣根过氧化物酶)在链霉抗生物素定量中的应用。这种红色激发的染料用于胶体颗粒几乎没有可能干扰测定的吸收的区。使用来自Jobin Yvon-Spex的Fluorolog-3进行所有的荧光测定。
为了缓解对高度吸收的SACN可能影响荧光测定的忧虑，按照两种不同方式进行了本实验。第一种为最直接的方式；将双官能化颗粒与生物胞素-594一起保温指定数量的时间(标称2小时，避光以避免光漂白)。然后通过反复离心纯化标记(如果谨慎控制染料量，那么2次足够)，并且测定其荧光。
取来自标记的直接荧光测定值的倒数在于确定不与标记结合的荧光分子的量。此外，将标记在选择量的染料中谨慎保温并且恰好离心1次。谨慎收集上清液并且测定荧光。然后通过从已知的染料原始浓度中扣除该值确定已经与颗粒结合的染料的量。需要注意的一个重要问题在于如果生物胞素Alexa Fluor594快速吸附在有规则的管壁上，那么使用不粘性微量离心管(Corning Costar)。如果颗粒与抗体而非抗生物素蛋白类似物缀合，那么类似的方案可以与荧光标记的二次抗体联用。
已经使用这些定量方法证实可以通过添加另一种反应分子来控制与标记缀合的指定生物分子的量。在图8中，显示了与纳米颗粒结合的生物素分子的数量，所述的纳米颗粒与不同比例的NeutrAvidinTM和牛血清清蛋白(BSA)缀合。对所以反应而言，缀合条件均等同，仅生物分子的比例可变。
正如预计的，较高量的BSA导致结合生物素的水平较低。由于推定NeutrAvidinTM(NAv)各自能够结合2个生物素(与颗粒共轭能够阻断4个结合位点中的某些)，所以存在达300-400个NeutrAvidinTM分子。而对纯BSA缀合的颗粒的测定，即计算显示小于10个生物胞素-594分子结合在每个纳米颗粒上。这一结果与可以通过BSA(常用的封闭试剂)与颗粒共轭预计的极低水平的非特异性结合一致。
实施例6非特异性结合特征作为第一个表征步骤，设计了简单的实验以便测定链霉抗生物素包被的SACN是否可以特异性结合生物素化BSA。通过与在PBS中的0.5％溶液一起保温30分钟用生物素化BSA或BSA包被聚苯乙烯微孔平板中的8个孔。然后用PBS将所有孔洗涤4次持续1分钟且然后使用含有1mM EDTA、0.1％BSA和0.01％Zwittergent3-08的PBS缓冲液封闭30分钟。在从各孔中抽吸封闭溶液后，加入20μl样品和20μl PBS并且保温2小时。样品包括neutravidin(NAv)包被的SACN、链霉抗生物素(SAv)包被的SACN、已经进行硫醇修饰的(未缀合的)SACN和不含有二氧化硅涂层官能化的对照标记。用封闭缓冲液将孔洗涤15分钟，随后用PBS(3×5分钟)和水(3×1分钟)洗涤。使它们干燥并且通过使用微孔平板读出器在490nm处测定吸收度来对结合的标记的量进行定量(数据未显示)。基于未处理的孔的平均吸收度对数值进行本底扣除。NAv和SAv标记以高度特异性与生物素包被的孔结合并且表现出与BSA包被的孔几乎没有表现出非特异性结合。然而，硫醇包被的标记和标准二氧化硅包被的标记表现出与所有孔的低水平结合。随后的实验证实可以通过经向颗粒中添加少量BSA封闭颗粒、离心和重新悬浮于PBS中来避免这种现象。在测定SAv和NAv缀合的标记对生物素具有特异性后，通过两种方法测定每种标记上存在的生物素结合位点。使荧光生物素类似物生物胞素Alexa Fluor594与SACN反应。在适当的洗涤步骤后，通过直接测定并且根据荧光缺失确定结合的荧光团的数量。通过两种方法获得的数值一致(图12)，不过直接荧光测定始终产生较低的数。在最佳反应条件下每个纳米颗粒结合的生物素的平均数约为700。
实施例7寡核苷酸缀合上述相同的磺基-SMCC化学反应用于使氨基终止的寡核苷酸与硫醇修饰的SACN结合。在结合和纯化后，将染料标记的互补链与修饰的颗粒一起保温。对荧光探针的定量(在离心以除去未结合的探针后)显示约15个寡核苷酸与每个纳米颗粒结合。寡核苷酸与NAv-tags直接结合，其中寡核苷酸在连接标记的一端带有生物素基团，而在另一端上带有荧光团，从而能够直接测定缀合效率。这还产生了每个纳米颗粒缀合的约15个寡核苷酸。使用与上述相同的磺基-SMCC化学反应使氨修饰的SACN与硫醇终止的荧光寡核苷酸，仍然具有相似的结果。
实施例8需要定量光学标记的两个特征为它们对激发源的反应成线性且它们相对不受长期暴露于激发的影响。使用通过SACN使样品暴露于不同量的激发能量并且测定所得信号证实了第一种质量。这些结果如图9中所示。
为了证实耐光性，使SACN样品沉积在石英玻片上并且将其置于拉曼光谱仪的试样架。就该实验而言，该光谱仪在647.1nm处递送了60mW功率。通过50×0.8NA显微镜物镜采集发射光，使其通过陷波滤波器以便拒绝雷赖散射，聚焦入0.5m单色器并且使用液氮冷却的CCD检测。约每小时采集1次光谱，持续6小时，在此过程中，连续照射样品。将来自样品的信号作为时间的函数绘制在图10中。该数据表示这些颗粒十分稳定，在6小时内在信号上仅损失了20％。
SACN的热稳定性也是理想的。为了证实这一点，将两个批量的1.5X BPE SACN(在35mL中)煮沸1小时(将标记从50mL浓缩至35mL，至约1.5X浓度。在煮沸前后记录UV-Vis和SERS。在煮沸前后吸收度和SERS的小差异主要归因于浓度的轻度差异。SACN基本上不受煮沸影响。
实施例9批量与批量再现性的验证为了测定从该非方法开始到完成制备标记的再现性，总计制备6个胶体并且标记为B-G。这些胶体用于制备总计13个不同批量的标记，其中每个批量使用相同的方案。这些胶体(校准的)吸收光谱图11中所示，并且显然在所有步骤完成后它们十分相似。
在通过将每种溶液的光密度平衡至1.0校准浓度后，使用785nm激发测定SERS响应。在高峰处(～1200cm-1)监测SERS信号(未显示)。使用所有样品，组的RSD均为12.5％。如果除去一个明显的逸出值，剩余的12个样品均表现出7.5％的RSD。
实施例10A.具有18-90nm直径的各向异性纳米杆的制备将具有不同孔径(18nm-90nm)的商购模板用于各向异性Au纳米杆的电沉积。将约1μm厚蒸发的Ag用作电镀基质。在电沉积前即刻将模板装配入电化学室并且在室内真空条件下浸入Ag电镀溶液1小时，以确保孔的适当湿润，随后电沉积入1μm厚的新制的Ag。此后进行由交替Au和Ag条组成的纳米金属线的电沉积。使用商购电镀Cyless Silver(Technic，Inc.)和Microfab Au100(来自Enthone-OMI，Inc.的基于亚硫酸盐的Au溶液)。根据Au纳米杆的所需长径比确定Au节段的长Ag节段的长可以在10-200nm范围，可以根据Au纳米杆/ml溶液的所需终(从模板中释放厚)浓度确定每个孔中的总条数。
根据模板孔径的不同使用不同的电镀技术。就65nm和90nm的孔径而言，在恒定电流模式下使用用于Nanobarcodes颗粒的半自动合成仪。在已经证实Ag除去至3×1011Au纳米杆/模板后，将电镀的具有59条(每条30nm长)的AuAg纳米金属线依次电镀入一个模板前沿。
从在硝酸中溶解Ag(基质和Ag条)开始，随后进行在NaOH中的模板溶出进行释放方案。为了防止释放的Au纳米杆聚集，在模板溶出过程中将短SAM分子(自装配单层)加入到NaOH中。含短硫醇的分子的实例为巯基乙醇(ME)、巯基丙酸(MPA)和巯基乙磺酸(MESA)。随后使用拉曼报道分子取代这些短分子。产生较好效果的备选方法在于在模板溶出过程中将拉曼报道分子直接引入NaOH。成功地使用了4-巯基苯酚(MP)和2-喹啉硫醇(QSH)并且使用Au纳米杆证实了拉曼信号。图12表示在QSH中释放的Au颗粒的65×30nm和90×30nm拉曼光谱。图13解释了在MP中释放的65×30nm和90×30nm Au颗粒的拉曼光谱。
恒定电流的电沉积描述对具有35nm和35nm以下孔径的模板而言无效。可以使用不同的脉冲电镀技术(脉冲电流、反向脉冲电流和双脉冲)。使用具有亚微米范围的孔径的聚碳酸酯模板，已经成功地将在超声搅拌下的反向电流电沉积应用于从氰化物溶液中生长Au单晶。然而，使用各种反向脉冲条件从亚硫酸Au溶液中沉积出多晶AuDobrev，DVetter，J.Angert.N.；Neumann.R.；Electrochimica Acta2000.45，3117-3125。在先已经证实从亚硫酸Au溶液中脉冲恒电势沉积改善了金属在光致抗蚀组成图案的结构上的分布，但不会显著影响Au薄膜的影响(应力、纯度、电阻)，这可以解释为Au/Au(I)偶联在亚硫酸盐溶液中的不可逆性Horkans.J.Romankiw，L.T.；J.Electrochem.Soc.1977，124，1499-1505。
按照平均电镀电流稍低(0.25-1mA/sqcm)这类方式改变脉冲参数(脉冲电流、频率和工作期)以确保Au和Ag条的缓慢生长。在下列脉冲电镀条件下进行成功电镀脉冲电流2mA/sqcm；频率范围0.025-2.5Hz且工作期为0.1-0.3。将相同的脉冲条件用于一个实施方案中的Au和Ag条。使用多通道恒电势器/恒流器(Princeton AppliedResearch)；在各条电镀后，改变溶液，随后手工用下一种溶液冲洗和再注满。已经显示了在Ag除去后，产生3xE11 Au纳米杆/模板(35nm孔径)和1xE12 Au纳米杆/模板(18nm孔径)的19个交替Au/Ag条的电镀。脉冲电镀的自动化可以进一步将颗粒的数量再增加一个数量级，因为模板厚度为50μm。图14表示在ME中释放的具有35nm直径的Au纳米杆的TEM图像和用QSH取代ME后纳米杆的拉曼光谱。
B.250nm×250nm各向异性Au颗粒的制备制备与A部分中的颗粒类似的250nm×250nm Au颗粒。将具有250nm孔径的氧化铝模板用于Au纳米颗粒的电沉积。约1μm厚的蒸发的Ag用作电镀基质。将新制的5μm厚的Ag电沉积入孔以便进一步密封模板，随后依次进行由各自250nm长的交替Au和Ag条组成的纳米金属线的电沉积。使用商购电镀溶液Cyless Silver(Technic，Inc.)和Microfab Au 100(来自Enthone-OMI，Inc的基于亚硫酸盐的Au溶液)。用于Nanobarcodes颗粒的半自动化合成仪用于各自以1 mA的恒定电流电镀9个Au和Ag条。从在硝酸中溶解Ag(基质和Ag条)开始，随后进行在氢氧化钠中的模板溶出进行释放方案。为了防止释放的Au纳米颗粒聚集，在释放过程中将预先溶于乙醇(EtOH)的硫醇-拉曼报道分子4-巯基苯酚(MP)导入氢氧化钠中。释放步骤如下1.12ml 40％HNO3，60分钟2.2ml 28mM MP/EtOH+8ml 3M NaOH/20％EtOH/80％H2O，30分钟3.200μl 28mM MP/EtOH+800μl 3M NaOH/20％EtOH/80％H2O，30分钟4.离心4200rpm，2分钟5.3x冲洗200μl MP/EtOH+800μl EtOH/H2O(1∶4)6.离心4200rpm，每次间隔1分钟，SEM/TEM样品，各自10μl7.0.1ml样品用H2O稀释至1ml，用于UV-vis8.2x冲洗H2O，以6200rpm离心，各自10分钟9.获得拉曼释放后Au颗粒的浓度为5×109/ml。将金颗粒重新悬浮于乙醇中并且取300μl等分用于玻璃包被。将490μl乙醇、160μl 18M水、10μl 30％氢氧化铵和40μl纯四乙基正硅酸酯(TEOS)加入到金颗粒的等分部分中。对样品进行超声处理并且置于处于最低设置环境下的涡旋器上混合45分钟。然后用18M水将样品冲洗3次。图15A和B表示用于产生各向异性颗粒的SEM图像。图16A和B表示单颗粒的近距离观测图。颗粒的拉曼光谱如图17A和B中所示。
实施例11IL7夹心式免疫测定通过将俘获IL-7的抗体打印在微阵列玻片上模拟蛋白质微阵列实验。每个点在玻片上约为500μm，并且在每个玻璃底板上重复6次(由Telechem，Inc.，Sunnyvale，CA打印)。将疏水笔用于提供载玻片上的液体屏障，由此可以独立地处理6个点。在笔干燥后，用在10mM磷酸缓冲盐水(PBS)中的5％牛血清清蛋白(BSA)将玻片封闭至少60分钟。所有的保温和洗涤步骤均在轨道振荡器或摇动器上进行，并且在添加新溶液前用移液管抽吸溶液。在封闭后，用0.5％BSA/PBS将玻片洗涤3次，每次5分钟(3×5)。在0.5％BSA/PBS溶液中制备抗原并且在阵列上保温45分钟-2小时，此后再次用0.5％BSA/PBS洗涤阵列(3×5)。然后将IL7修饰的SACN(使用在neutravidin包被的SACN上的生物素化抗体)在阵列上保温90分钟。该步骤后用0.5％BSA/PBS洗涤(3×5)并且用PBS和水快速冲洗。在水冲洗后，即刻通过喷射氮气将玻片吹干。使用二极管激光器(785nm，200mW)和Ocean OpticsUSB-2000光谱仪和软件获得来自它们的拉曼光谱。在玻璃阵列上获得的光谱的典型积分时间为2秒。将本底扣除用于从所有光谱中除去玻璃本底。由于为最优化，所以获得的检测限为10-100pg/ml(图1 8)，与许多商购酶免疫测定结果相差无几。然后通过探测蛋白质芯片相邻点上的三种不同的分析物(卵清蛋白、枯草芽孢杆菌和C-反应性蛋白)证实多路测定的可能性。使针对每种抗原的抗体与含有不同报道分子的SACN共轭，得到BPE抗Bg、QSH抗Ova和Bodipy抗CRP颗粒。使含有针对抗原的俘获抗体的点阵列接触所有三种抗原的混合物。在适当冲洗后，使点接触所有三种检测。然后从各点中采集SACN拉曼光谱。数据显示在每个点上的清晰信号，例如，为俘获CRP设计的点，产生强Bodipy标记信号。
实施例12使用Tetracore，Inc′s(Gaithersburg，MD)侧流柱对Bot tox进行侧流免疫测定。在本实验中，打开装置，取出含有其比色检测试剂(包括与检测Ab缀合的胶体Au)的印色盒并且用包括与相同Ab缀合的SACN的共轭物(由Tetracore提供)取代它。使用上述仪器采集拉曼光谱。数据显示了最小非特异性结合和在有抗原存在下共轭物的成功俘获，其中未优化的检测限与其商购产品相似。结果如图19中所示。
实施例13用SACN染色SK-BR3在室玻片上培养细胞。用PBS将细胞洗涤3次，每次1分钟。在室温下用3.7％甲醛/PBS将细胞固定10分钟并且如上所述洗涤。在室温下用1％BSA/PBS将细胞分别20分钟。将细胞与1μg/ml小鼠抗-her2抗体(用封闭缓冲液稀释的)一起在室温下保温30分钟，然后如上述进行测定。随后将细胞与1μg/ml生物素化抗小鼠IgG一起保温30分钟并且如上述进行洗涤。将细胞与50μl 2X的链霉抗生物素缀合的SACN一起在室温下保温1小时并且如上述进行洗涤。加入Hoechest染料(按1500稀释)并且将细胞保温5分钟。如上述洗涤细胞。使用在PBS中90％的甘油，用盖玻片固定细胞，并且用指甲油密封边缘。图21A表示所得样品的明视野和SERS图像，并且显示出了SACN与细胞表面和细胞和内部的具体结合位置。
实施例14组织样品中SACN的检测还可以在有用强染色有机染料染色的组织样品存在下检测SACN颗粒。例如，苏木精和伊红(H&E)为用于使细胞大小和形状显影的标准染料。两种分子均在可见区内显示出荧光，从而可以利用对相同样品困难或不可能的常规免疫组织化学法。然而，使用785nm激发获得了最低的本底，从而使SACN易于显影。因此，按照标准组织病理学方案，使用H&E处理来自Zymed的小鼠组织阵列，产生高度染色的点。用聚赖氨酸且然后用BPE SACN处理几个点。图21B表示来自未处理和处理的点的拉曼光谱，表明可以很方便地在H&E染色本底上观察到SACN。因此，本发明提供了1.一种方法，包括使组织样品接触至少一种能够特异性结合组织样品的生物分子缀合的SACN颗粒；并且获得组织/生物分子缀合的SACN颗粒混合物的拉曼图像。使组织接触一种或多种额外的非SACN试剂，诸如伊红、苏木精和苏木精与伊红的组合。可以获得本底拉曼图像并且从组织/生物分子缀合的SACN颗粒混合物的拉曼图像在于扣除。另外，可以进一步可拉曼图像与具有已经用使细胞大小和形状显影的强染色有机染料，诸如染料H&E染色的组织样品图像的拉曼图像进行比较。
实施例15用SACN对动物的体内标记按照2种方式将SACN注入裸鼠a)通过尾部注射以便进入血流循环；和b)通过皮下注射以便在皮下定位。在两种情况中，将光学探针保持在皮上并且检测发射自皮下的拉曼信号。可以在本底上观察到峰。由Ahura Corp生产的便携式检测系统具有785nm激发激光。通过由InPhotonics公司生产的光导纤维和光度头将106mW光递送至样本。通过相同的光度头检测拉曼散射光。选色镜将采集的光发送至与具有50微米狭缝和在750nm处1200个凹槽/mm定向光栅的光谱仪Ocean Optics USB2000连接的第二个光导纤维。通过笔记本电脑采集光谱仪数据。
就a)的情况而言，在约45分钟时检测信号。此时，如果将探针保持在小鼠肝上，那么检测信号参见图22。SERS标记光谱出现在组织荧光与Rayleigh反向散射混合物的本底上。测定的实际本底取决于皮肤上探针的位置。如果探针与皮肤接触，那么光谱可以含更多组织荧光。如果探针脱离皮肤，那么光谱可以含有Rayleigh反散射。例如，就在肝上获得的光谱和在小鼠侧腹上获得的光谱而言，本底不同。因为本底可以改变。SACN具有优点，因为可以根据本底上的峰高对标记进行定量。
就b)的情况而言，可以如图23中所示，在注射后即刻检测。图23还包含了取自不使用SACN的小鼠的光谱。当标记扩散入小鼠体内时，信号可以随时间的推移减少。皮下光谱还可以含有一定的本底荧光Rayleigh散射，不过，SACN信号仍然远强于本底。
实施例16多路细胞成像实验使用细胞系LNCaP，即来源于人前列腺癌的雄激素敏感性粘附细胞系。LNCaP细胞获自ATCC(Rockville，MD)。LNCaP细胞为前列腺癌的较好的模型。已有大量商购的针对已知为前列腺癌中重要的生物标记，诸如α-甲基酰基CoA消旋酶(AMACR)和前列腺特异性抗原(PSA)的抗体。其它用作标记或对照品的抗体包括针对CDH1、CTNNB1、CCND1、HPN、TP53、CDKN1B和BCL2的抗体。
针对这些标记的抗体与SACN共轭。进行细胞标记和成像实验，其中用各种化合物和条件处理LNCaP细胞。检测对细胞存活的作用和抗体缀合的SACN的空间定位。
如Kuefer等在Am J Pathol 2002，161，841-48中详述的，与AMACR抗体和PSA抗体缀合的SACN用于比较细胞系LNCaP、DU-145和PC-3中AMACR和PSA的蛋白质表达。用一种来自用于前列腺癌的抗雄激素类处方药物治疗的口服药比卡鲁胺处理细胞。通过蛋白质印迹分析发现，激素敏感性肿瘤细胞系LNCaP显示出强于细胞系DU-145和PC-3的AMACR表达。在用比卡鲁胺处理LNCaP细胞时，细胞中的AMACR蛋白质表达保持不变，而已知为雄激素调节的前列腺特异性抗原表现出蛋白质表达减少。进行SACN的空间定位。在胞内成像中，不同于表面标记实验，不能洗涤掉未结合的标记。这些实验由此使我们明确未结合于细胞中特异性靶的过量SACN发生了什么情况(例如，靶物是否为下调的，诸如在本试验中的PSA)。
Arnold等近来在Am J Physiol.Endocrinol Metab 2004，288E573-E584中公布了非处方药物食品添加剂脱氢表雄酮(DHEA)对LNCaP细胞的基因和蛋白质表达的作用的研究。他们发现DHEA影响细胞增殖并且增加PSA的蛋白质表达以及IGF受体数量。使用与PSA抗体缀合的SACN和在癌细胞中指示细胞生长的抗体，诸如CCND1(细胞周期调节蛋白D1)研究了这种生物系统。用DHEA、睾酮、维A酸和17β-雌二醇(E2)处理细胞并且将细胞成像结果与Arnold等报导的那些结果进行比较。
权利要求
1.一种方法，包括a)使金属沉积入模板孔，其孔径小于300nm；b)使第二金属沉积入所述模板的所述孔，其中所述第一材料和所述第二材料中的至少一种的沉积包括法拉第电化学过程以便生成分节段的孔结合的纳米颗粒；c)重复步骤a)；和d)从所述分节段的孔结合的纳米颗粒中释放所述的第二材料和所述的模板以便生成至少两种自由的金属纳米颗粒。
2.权利要求1所述的方法，其中所述的自由的金属纳米颗粒长10-300nm和宽15-300。
3.权利要求1所述的方法，进一步包括重复步骤b)和c)的步骤。
4.权利要求1所述的方法，其中所述的模板为氧化铝。
5.权利要求1所述的方法，其中所述的第二材料为金属。
6.权利要求5所述的方法，其中所述的第二材料为Ag。
7.权利要求1所述的方法，其中所述的金属为Au。
8.权利要求4所述的方法，其中所述的第二材料为Ag。
9.权利要求8所述的方法，其中所述的模板为氧化铝。
10.权利要求1所述的方法，其中所述的释放包括用强酸处理，随后用强碱处理。
11.权利要求10所述的方法，其中所述的强酸为硝酸并且所述的强碱为NaOH。
12.权利要求1所述的方法，其中所述的电沉积选自脉冲电镀、脉冲电流电镀、反向脉冲电流电镀和双脉冲电镀组成的组。
13.权利要求1所述的方法，进一步包括在步骤c)的过程中提供短SAM-分子的步骤。
14.权利要求1所述的方法，其中所述的释放包括使用提供SERS活性分子的溶液。
15.一种方法，包括a)使金属沉积入模板孔，其孔径小于300nm；b)使第二金属沉积入所述模板的所述孔，其中所述第一材料和所述第二材料中的至少一种的沉积包括法拉第电化学过程以便生成分节段的孔结合的纳米颗粒；c)重复步骤a)；和d)以酸进行处理，从所述分节段的孔结合的纳米颗粒中释放所述的第二材料和所述的模板以便生成至少两种多孔性自由金属纳米颗粒。
16.一种SACN，包括纳米颗粒芯、拉曼活性报道分子、SiO2包囊用材料和选自-SH、-NH2和-COO-的反应基。
17.一种方法，包括a)提供纳米颗粒；b)使拉曼活性报道分子与所述的纳米颗粒结合；c)用SiO2包囊纳米颗粒；和d)修饰SiO2以便带有选自-SH、-NH2和-COO-的反应基，由此制备活化的SACN。
18.一种用于检测分析物的方法，包括a)获得生物样品；和b)使该样品和含有能结合于分析物的生物分子的生物缀合的SACN接触；和c)检测结合于所述生物缀合的SACN的分析物。
19.权利要求18所述的方法，其中所述的生物分子和所述的分析物为互补核苷酸序列。
20.权利要求18所述的方法，其中所述的样品选自血液、血清、唾液、痰、泪、汗、其它的分泌的流体、尿、粪便物、脑脊液、间质液、细胞提取物和细胞组成的组。
21.一种方法，包括a)使怀疑含有分析物的样品接触至少一种对侧流试验表面上的该分析物的特异性结合配偶体，以便结合样品中的分析物；b)在上述步骤(a)之前、同时或之后，使至少一种分析物的结合配偶体与SACN结合；和c)检测SERS信号，由此根据信号的强度或存在来确定样品中分析物的存在，由此确定样品中至少一种分析物的存在。
22.一种方法，包括a)提供与CCD照相机连接的显微镜；b)提供细胞；c)使细胞接触至少一种能够特异性结合该细胞或细胞部分的SACN；d)在细胞与照相机之间配备波数过滤装置；e)获得多个数据组，和f)汇编数据组；由此获得了SACN的空间特性。
23.权利要求22所述的方法，其中所述的波数过滤装置选自单色器、陷波滤波器、滤光轮、声光可调滤波器、傅里叶变换干涉滤光器、液晶可调滤波器及上述装置的组合组成的组。
24.权利要求22所述的方法，其中所述的波数过滤装置包括液晶可调滤波器，并且所述的获得包括a)在第一频率上获得数据；和b)可选地获得第二频率和随后频率上的数据。
25.权利要求22所述的方法，其中所述的获得包括a)将光从单点位置通过单色器分散；b)获得阵列检测器上该点的完整拉曼光谱；和c)在多个位置上重复a)和b)。
26.权利要求22所述的方法，其中所述的获得包括a)用发射线激发样品；b)获得线中各空间像素的完整光谱；和c)扫描通过样品的线。
27.纳米颗粒，包括a)芯/壳纳米颗粒；b)与所述的芯/壳纳米颗粒结合的至少一种拉曼活性报道分子；和c)SiO2包囊用材料。
28.权利要求27所述的纳米颗粒，其中所述的芯/壳纳米颗粒选自Au2S芯/Au壳颗粒、Ag芯/Au壳颗粒、二氧化硅芯/Au壳颗粒、二氧化硅芯/Ag壳颗粒、氧化铝芯/Au壳颗粒、氧化铝芯/Ag壳颗粒、TiO2芯/Au壳颗粒和TiO2芯/Ag壳颗粒组成的组。
29.一种纳米颗粒，包括a)各向异性金属纳米颗粒；b)与所述的各向异性金属纳米颗粒结合的SERS活性报道分子；c)包囊各向异性金属纳米颗粒的SiO2。
30.权利要求29所述的纳米颗粒，其中所述的各向异性金属纳米颗粒具有选自椭球形、棒形、圆片形、棱锥形、立方体形、圆柱形、纳米螺旋形、纳米弹簧形、纳米环形、杆形纳米颗粒、箭头形纳米颗粒、泪珠形纳米颗粒、四脚动物形纳米颗粒、棱镜形的、多孔的和非几何形状的纳米颗粒的形状。
31.权利要求30所述的纳米颗粒，其中所述的纳米颗粒为非几何形状的并且近似纳米杆形。
32.权利要求31所述的纳米颗粒，其中所述的纳米颗粒具有约250nm直径和约250nm长度。
33.一种方法，包括a)将SACN纳米颗粒显像剂给予患者；b)使用可以进行光谱成像的系统扫描患者；和c)生成患者体内区域的光谱或图像。
34.权利要求33所述的方法，其中所述的系统选自定位扫描共聚焦显微镜、线扫描系统、光学结合性体层摄影系统、仅检测单波长带的系统、包括激发光源和滤过的图像检测的荧光显像系统。
35.权利要求33所述的方法，其中所述的患者区域选自患者整体、脉管系统、心脏、肝和脾、胃肠区组成的组。
36.权利要求33所述的方法，其中所述的可以进行光谱成像的系统为便携式系统。
37.一种方法，包括a)将多个靶向至涉及异常病理情况的分子的SACN导入存在异常病理情况的患者体内，其中SACN结合于异常病理情况相关的分子；和b)获得结合SACNs的图像，由此可以诊断异常病理情况。
38.权利要求37所述的方法，其中所述的异常病理情况的位置包括胃肠道、心脏、肺、肝、子宫颈、乳腺和结肠。
39.权利要求33所述的方法，其中所述SACN与显像探针非共价结合，所述给予包括导入显像探针，所述SACN解离进入组织或体液。
40.一种用SACN标记动物的方法，包括将SACN导入动物，其中所述导入选自皮下植入、静脉内导入。
41.权利要求40所述的方法，还包括检测SACN或标记的动物。
42.一种方法，包括a)使组织样品和能特异性地结合于组织样品的至少一种生物分子缀合的SACN粒子接触，和b)获得组织/生物分子缀合的SACN粒子混合物的拉曼图像。
43.权利要求42所述的方法，其中组织与一种或多种额外的非SACM试剂接触。
44.权利要求43所述的方法，其中额外的试剂选自伊红、苏木精以及苏木精与伊红的组合。
45.权利要求42所述的方法，进一步包括(a)在权利要求42的步骤(a)前获得组织样品的本底拉曼图像；和(b)从权利要求42的步骤(b)中获得的组织/生物分子缀合的SACN颗粒混合物的拉曼图像中扣除本底谱线图。
46.权利要求45所述的方法，其中使所述的组织与一种或多种额外的非SACN试剂接触。
47.权利要求45所述的方法，其中所述的额外的试剂选自伊红、苏木精以及苏木精与伊红的组合。
48.权利要求42所述的方法，进一步包括将拉曼图像与已经用强染色有机染料染色的组织样品图像进行比较以便显示细胞的大小和形状。
全文摘要
描述了可以与对定量、定位、鉴定、示踪和诊断目的有意义的本体共价或非共价固定的亚微米大小的颗粒或标记。
文档编号G01N33/20GK101019019SQ200580015982
公开日2007年8月15日 申请日期2005年4月25日 优先权日2004年4月23日
发明者M·J·纳坦, S·佩恩, G·R·弗里曼, G·查卡罗瓦, W·E·多林, I·沃尔顿 申请人:奥克尼卡公司