专利名称：氨浓度的测定方法及氨诊断试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药、食品、环境等领域内对氨浓度的检测，尤其涉及利用酶循环扩增法、酶比色法及酶联法测定氨浓度的方法，以及由此制得的氨诊断试剂盒，属于氨浓度分析检测技术领域。
背景技术：
氨测定的方法有微量扩散法、离子交换法、酶法和氨电极法等。目前应用最多的方法是酶法和基于离子选择电极的血氨测定仪分析法。
扩散法是标本碱化后，释放出NH3，用酸滴定释放出的氨，或用Nessler反应形成棕黄色碘化双汞胺进行比色。这些方法需要碱化，内源性的氨形成造成影响，使其准确性和精密度受到影响，目前已很少应用；离子交换法比扩散法更准确，CV为8％～13％；离子选择电极法是利用NH3扩散到电极表面，引起电极的PH发生变化进行测定，该方法的CV为3.5％～4.8％，回收率高。结合具体实际，应以酶法测定为实用。
检索中国专利，仅查出87105593.7专利申请公开了一种血氨测定速冻杯，却未发现比较理想的血氨测定方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种测定氨浓度的方法，以及应用该方法配制而成的氨诊断试剂盒。
本发明的原理是利用酶循环扩增法(Enzymatic Recycling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶联法(Couple Reaction)来测定氨的浓度，其主要技术路线是采用谷氨酸脱氢酶(glutamatedehydrogenase EC 1.4.1.2、EC 1.4.1.3或EC 1.4.1.4)作为作用酶，产生谷氨酸，谷氨酸氧化酶(Glutamate oxidase EC 1.4.3.7、EC 1.4.3.11)作为循环酶，功能为将谷氨酸再次变回氨及α-酮戊二酸，使氨不断地被重复循环利用，并同时不断地扩增产生过氧化氢，过氧化物酶的作用是显色酶，它将过氧化氢与还原型色原体组合作用，最终将无色的还原型色原体组合氧化成有色的染料，从而可以通过可见光分析仪器，在400～700nm(根据还原型色原体组合的不同而定)波长处，测定染料吲嗒胺色原(Indaminedye)或醌亚胺色原(Quioneimine dye)含量高低的光吸收大小，通过测量400～700nm(根据还原型色原体组合的不同而定)处吸光度上升的程度，得出氨浓度大小测定结果。
为实现本发明的目的，一种测定氨浓度的方法，采用以下步骤进行首先，将待测样品与含有α-酮戊二酸、谷氨酸脱氢酶、谷氨酸氧化酶、还原型辅酶、还原型色原体组合和过氧化物酶的试剂混匀，使之发生以下反应
然后，将反应混合物置于紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪下，检测400～700nm处直接反映吲嗒胺色原或醌亚胺色原含量高低的光吸收程度，测算得出样品中氨浓度大小。
上述酶循环扩增法测定氨浓度的方法中，所述还原型辅酶是NADH、NADPH、thio-NADH或thio-NADPH中的一种。
上述还原型色原体组合(Chromogen)可以是下列28个组合中的任一个组合
实现本发明氨诊断试剂盒可以是单剂，由以下成分组成缓冲液20～500mmol/L，稳定剂/试剂总体积 1～50％，还原型辅酶0.1～0.35mmol/L，谷氨酸脱氢酶 2000～500000U/L，谷氨酸氧化酶 2000～500000U/L，α-酮戊二酸 2～20mmol/L，过氧化物酶500～500000U/L，还原型色原体组合 0.1～20mmol/L。
试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
也可以将以上单剂中的各种成分进行组合配制成双剂，比如 双剂的配方不仅仅限于上述表中所列，其中试剂I的成分α-酮戊二酸、还原型辅酶、谷氨酸脱氢酶、还原型色原体组合成分之一、过氧化物酶等，可以放在试剂II；试剂II中的谷氨酸氧化酶、还原型色原体组合成分之二也可以放到试剂I，如此可以形成多种配方，不再一一列举。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
还可以将试剂配成如下三试剂
与双剂类似，三剂的配方也不仅仅限于上述配方，其中试剂I中的α-酮戊二酸、还原型辅酶、还原型色原体组合成分之一、谷氨酸脱氢酶可以放在试剂II或试剂III中，试剂II中的过氧化物酶、还原型色原体组合成分之二可以放在试剂I或试剂III中，试剂III中的谷氨酸氧化酶也可以放到试剂I或者试剂II中，如此可以形成多种配方，不再一一列举。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
此外，为减少各试剂成分之间的交叉影响、保持试剂的稳定性，以便长期储存，以上单剂、双剂的试剂I/试剂II、三剂的试剂I/试剂II/试剂III当中通常加入稳定剂，浓度在1％～50％(V/W)范围之内。
用作稳定剂的物质可以是硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)中的至少一种。
研究表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下配方成分关系的诊断试剂盒较为理想，也是本发明的优选方案
缓冲液 100mmol/L，稳定剂/试剂总体积 50％，还原型辅酶 0.25mmol/L，谷氨酸脱氢酶 100000U/L，谷氨酸氧化酶 8000U/L，α-酮戊二酸16mmol/L，过氧化物酶 30000U/L，还原型色原体组合 6mmol/L。
利用酶循环扩增法(Enzymatic Recycling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶联法(Couple Reaction)技术，计量通过酶联反应生成吲嗒胺色原(Indamine dye)或醌亚胺色原(Quioneimine dye)，所导致在400～700nm波长处吸光度的上升，得以测定氨浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的氨诊断/检测试剂盒，采用该试剂盒不仅可以在可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行氨浓度测定，而且测定速度快、灵敏度大、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。
本发明技术方案的突出的实质性特点和显著的进步主要表现在(1)本发明完全利用酶循环扩增法、酶比色法及酶联法测定氨浓度，测试结果准确；(2)参与反应的成分都是外加的，不受内、外源物质的污染，测试过程精确度高；(3)该方法简便、易操作，可快速得到检测结果，而且反应是在缓冲液条件下进行，不会污染环境；(4)该方法在普通紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪上便可快速检测，不需要特殊或额外仪器，测试成本低廉，便于行业内推广应用；
(5)应用本发明提供的测定方法可以制成液态试剂、干粉试剂等多种形式的试剂，用于测定各种样品中氨浓度的大小；(6)本发明提供的液态氨诊断/检测试剂盒，稳定性好，很好地保证了应用测试效果。配成双剂或者三剂以后，能够进一步降低各种成分之间的交叉影响，检测结果更加可信，试剂更为稳定，可以长时间储存。
具体实施例方式
本发明一种氨浓度的测定方法及氨诊断试剂盒，利用谷氨酸脱氢酶与α-酮戊二酸、还原型辅酶生成谷氨酸，由谷氨酸氧化酶将谷氨酸变回氨及α-酮戊二酸，使氨不断地被循环利用，并不断地扩增产生过氧化氢，再由过氧化物酶与过氧化氢及还原型色原体组合作用，将无色的还原型色原体组合氧化成有色的染料，从而通过可见光分析仪器，在400～700nm波长处测定染料吲嗒胺色原或醌亚胺色原含量高低的光吸收大小，通过测量400～700nm处吸光度上升的程度，得出氨浓度的大小。
下面结合具体实施例对本发明技术方案作进一步说明。这些例子仅是一些应用范例，不能理解为对本发明权利要求保护范围的一种限制。
实施例一(单剂)按以下成分和用量配制氨诊断试剂盒三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液100mmol/L，硫酸铵 50％(占试剂总体积)，NADH 0.25mmol/L，谷氨酸脱氢酶 150000U/L，谷氨酸氧化酶 8000U/L，α-酮戊二酸 16mmol/L，过氧化物酶 30000U/L，4-氨基抗砒 2mmol/L，石碳酸 10mmol/L；
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37℃，反应时间10分钟，测试主波长505nm，测试副波长600nm，被测样品与试剂的体积比例为1∶25，反应方向为正反应(上升反应)，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长505nm吸光度上升的程度，从而测算出氨的浓度大小。
实施例二(双剂)按以下成分和用量配制氨诊断试剂盒试剂I——三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液100mmol/L，甘油 50％(占试剂I总体积)，NADPH0.25mmol/L，谷氨酸脱氢酶 120000U/L，α-酮戊二酸 16mmol/L，过氧化物酶 30000U/L，2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸 0.2mmol/L；试剂II——三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液100mmol/L，甘油 50％(占试剂II总体积)，谷氨酸氧化酶 8000U/L，4-氨基抗砒 0.6mmol/L；试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37℃，反应时间10分钟，测试主波长546nm，测试副波长600nm，被测样品与试剂的体积比例为1∶20，反应方向为正反应(上升反应)，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长546nm吸光度上升的程度，从而测算出氨的浓度大小。
实施例三(三剂)按以下成分和用量配制氨诊断试剂盒试剂I——三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液100mmol/L，丙二醇 50％(占试剂I总体积)，thio-NADH0.25mmol/L，谷氨酸脱氢酶 100000U/L，α-酮戊二酸 16mmol/L，3-甲基-2-苯噻唑酮腙 0.6mmol/L；试剂II——三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液100mmol/L，丙二醇 50％(占试剂II总体积)，过氧化物酶 40000U/L，双甲基苯胺 2mmol/L；试剂III——三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液100mmol/L，丙二醇 50％(占试剂III总体积)，谷氨酸氧化酶 8000U/L；试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37℃，反应时间10分钟，测试主波长578nm，测试副波长660nm，被测样品与试剂的体积比例为1∶30，反应方向为正反应(上升反应)，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长578nm吸光度上升的程度，从而测算出氨的浓度大小。
经过验证，采用以上发明内容中记载的其他各种还原型色原体组合均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不一一列举。
总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过可见光分析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，不受内外源物质量污染。
权利要求
1.氨浓度的测定方法，包括以下步骤①将待测样品与含有α-酮戊二酸、谷氨酸脱氢酶、谷氨酸氧化酶、还原型辅酶、还原型色原体组合和过氧化物酶的试剂混匀，使之发生以下反应， ②将反应混合物置于紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪下，检测400～700nm处直接反映吲嗒胺色原或醌亚胺色原含量高低的光吸收程度，测算得出样品中氨浓度大小。
2.一种氨诊断试剂盒，盒中试剂由以下成分组成缓冲液 20～500mmol/L，稳定剂/试剂总体积 1～50％，还原型辅酶 0.1～0.35mmol/L，谷氨酸脱氢酶 2000～500000U/L，谷氨酸氧化酶 2000～500000U/L，α-酮戊二酸2～20mmol/L，过氧化物酶 500～500000U/L，还原型色原体组合 0.1～20mmol/L，抗干扰剂 1～50mmol/L。
3.根据权利要求2所述的氨诊断试剂盒，其特征在于所述稳定剂为硫酸铵、甘油、丙二醇、乙二醇中的至少一种。
4.根据权利要求2所述的氨诊断试剂盒，其特征在于所述还原型辅酶是NADH、NADPH、thio-NADH或thio-NADPH中的一种。
5.根据权利要求2所述的氨诊断试剂盒，其特征在于所述还原型色原体组合为下列28个组合中的任一个组合
6.权利要求2～5中任意一种氨诊断试剂盒，其特征在于所述试剂配成单剂、双剂或者三剂。
7.权利要求2～5中任意一种氨诊断试剂盒，其特征在于所述试剂盒为干粉试剂盒或液体试剂盒。
全文摘要
本发明涉及一种氨浓度的测定方法及氨诊断试剂盒，利用谷氨酸脱氢酶与α－酮戊二酸、还原型辅酶生成谷氨酸，由谷氨酸氧化酶将谷氨酸变回氨及α－酮戊二酸，使氨不断地被循环利用，并不断地扩增产生过氧化氢，再由过氧化物酶与过氧化氢及还原型色原体组合作用，将无色的还原型色原体组合氧化成有色的染料，利用可见光分析仪器，在400～700nm波长处测定染料吲嗒胺色原或醌亚胺色原含量高低的光吸收大小，通过测量400～700nm处吸光度上升的程度，得出氨浓度的大小。将诊断试剂盒制成双剂或三剂可减少各成分的交叉影响。本发明可以通过紫外/可见光分析仪器得出所需的测定结果，精确度好，不受内外源物质的污染，便于推广应用。
文档编号G01N21/25GK1912581SQ200610041358
公开日2007年2月14日 申请日期2006年8月17日 优先权日2006年8月17日
发明者王尔中 申请人:王尔中