专利名称：：一种单面针药材的鉴别方法
技术领域：
：本发明涉及医药领域，具体的说，涉及一种单面针药材的鉴别方法。
背景技术：
：中药现代化是当代中药发展中的一个最热门的研究方向，已成为国内外医药界的一大热点。其中中药材，中成药的质量标准现代化是中药现代化的一个重要组成部分。由于中药材品种繁多，地区用药习惯各异，古代本草记载简单，误传错用和用药演变等因素，导致中药材同物异名，同名异物以及正品，非正品都入药的混乱现象非常严重。更为普遍的是影响中药成分的因素复杂，即使是同一药材，其有效化学成分常因生态环境，釆集时间，储存和炮制方法等不同而有差异，这些问题严重影响了中药的质量和用药的安全与有效。如何根据中医药的特点提出一整套具有中医药特点又具有高科技特征的中药材、中成药现代化标准，是一重要课题。建立中药材单味药和复方全组成的指紋图谱是一种具有先进性的切实可行的方法，现在这方法已成为国际上通用的方法，而且指紋图谱已成为国际公认的控制中药或天然药物质量的最有效的手段"。中药指紋图谱是在中医药基础理论指导下针对中药的品种和质量，在现有认知水平基础上，以整体信息和药效指标为依据，釆用多种分析方法和技术，建立的客观、整体和多指标的综合评价体系。中药指紋图谱的建立，将对中药的规范化、标准化、产业化和国际化提供科学的技术平台，对中药现代化的战略行动具有科学的指导意义。单面针，Z朋仏o;t^Mmcfcw'加m//ems/,芸香科木质藤本，细时为灌木状；茎枝着生略下变的皮刺。单数羽状复叶；小叶3-9，对生坚纸质至革质，狭矩圆形到卵状矩圆形，长7-16厘米，宽3-6厘米，有时背面中脉上着生有下变的钩状刺，聚伞状圆锥花序，腋生，花4数；萼片宽卵形；花瓣卵状矩圆形；雄花的雄蕊开花时伸出花瓣外，顶端2-4驻裂；雌花无退化雄蕊。朞突果成熟时淡褐色，外形似蚬。分布于西南、广东、广西、湖南、湖北、陕西。生山地林中。根、茎皮及叶均供药用，能祛风活络、散瘀止痛、解毒消肿。单面针不是药典和部颁标准药材，现在的中药成药中以该药材入药的也不多见，更没有中成药以单面针的主要成分来进行质量控制，因此关于单面针药材的有效成分的研究极少。中药指紋图谱是指某种中药材或中成药中所共有的、具有特征性的某类或数类成分的色谱或光谱的图谱。在现阶段中药的有效成分绝大多数没有明确的情况下，有效控制中药材或中成药的质量具有重要的意义。日本汉方药主要生产企业在20世纪80年代就已经在企业中釆用高效液相指紋图谱控制质量。德国、法国在对银杏叶提取物联合开发的过程中，发现银杏叶提取物的医疗作用是提取物所得物质群的整体作用结果，而对这样一个整体的质量控制，亦釆用高效液相指紋图谱方法。美国FDA最近几年制定的植物草药指南中已经明确把指紋图谱作为混合物质群的质量控制方法。指紋图谱作为中草药及其提取物质量控制方法，目前已经成为国际共识。为有效控制单面针药材的质量，本申请人对不同产地单面针进行了考察比较，为建立单面针药材质量的综合控制方法，特以国家食品药品监督管理局2000年颁发的关于中药材指紋图谱技术要求，对湖南省张家界地区釆集的单面针30批药材进行了研究，建立起单面针指紋图谱测定方法。
发明内容本发明的目的是提供一种单面针药材的鉴别方法。为了实现本发明的目的，本发明提供了一种单面针药材的鉴别方法，包括如下步骤第一步，建立单面针药材的HPLC标准指紋图谱，包括1)供试品溶液的制备精密称取单面针药材粉末，经石油醚预处理后，挥干石油醚，残渣中加入甲醇加热回流，合并滤液，水浴蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至容量瓶中，定容至刻度，得到供试品溶液；2)高效液相色谱分析精密吸取供试品溶液进样，色谱条件色谱柱为KromasilRP隱C184.6mmx250mm，5fxm;HPG1313A自动进样系统；流动相为乙腈-0.2%辚酸三乙胺溶液；釆用梯度洗脱方式0min-10min-30min-70min,乙腈与0.2%磷酸三乙胺溶液的体积比为5:95-10:90-10:90-40:60;检测波长210~366nm;得到单面针药材HPLC标准指紋图谱；3)测定精密吸取30批单面针药材的供试品溶液各5-20nl，分别注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到30批单面针药材的HPLC指紋图谱并进行比较，得到由共有特征峰构成的单面针药材HPLC标准指紋图谱。所述单面针标准指紋图谱中，共有特征峰有8个，计算各个特征峰与总峰面积的积分相对比值(相对峰面积)，其中l号峰的平均Rt为3.364min,相对峰面积为4.2~7.8%;2号峰的平均Rt为4.620min，相对峰面积为0.8~1.6%;3号峰的平均Rt为10.772min，相对峰面积为1.5~3.3%;4号峰的平均Rt为12.799min,相对峰面积为3.7-9.9%;5号峰的平均Rt为13.828min，相对峰面积为4.5~16.3%;6号峰的平均Rt为34.015min，相对峰面积为46.9~73.1%;7号峰的平均Rt为58.820min,相对峰面积为5.3~10.7%;8号峰的平均Rt为62.179min，相对峰面积为2.7~7.5%;第二步，以上述相同的方法测定待测单面针药材样品的指紋图谱；第三步，将第二步所测定的待测单面针药材样品指紋图谱与第一步构建的单面针标准指紋图谱对比，筛选符合单面针药材标准指紋图谱的合格单面针药材。所述第一步l)中，单面针药材粉末细度优选为40目。所述第一步l)中，加入石油醚加热回流不少于10分钟，其中，lg单面针药材加入石油醚量不少于10ml，优选lg单面针药材加入石油醚30ml加热回流30分钟。所述第一步3)中，优选精密吸取单面针药材的供试品溶液10ptl。所述第一步l)中，加入甲醇加热回流l次以上，每次不少于IO分钟，其中lg单面针药材加入甲醇量不少于10ml，优选加入甲醇30ml加热回流2次，每次1小时。所述第一步l)中，残渣优选用甲醇定容至2ml。所述第一步l)中，供试品溶液高效液相分析前优选用0.45pm微孔滤膜滤过。所述第一步2)中，检测波长优选为280nm。所述8个共有特征峰的相对保留时间为，l号峰的平均相对保留时间Rt为3.364min，标准偏差SD为0.019;2号峰的平均相对保留时间Rt为4.620min，标准偏差SD为0.008;3号峰的平均相对保留时间Rt为4号峰的平均相对保留时间Rt为5号峰的平均相对保留时间Rt为6号峰的平均相对保留时间Rt为7号峰的平均相对保留时间Rt为8号峰的平均相对保留时间Rt为10.772min,标准偏差SD为0.102;12.799min,标准偏差SD为0.082;13.828min,标准偏差SD为0.101:34.015min,标准偏差SD为0.603;58.820min，标准偏差SD为0.074;62.179min，标准偏差SD为0.256;现阶段未发现有对单面针有效成分及其质量控制方法的深入研究，本发明人运用国际通用的对不能明确有效成分的天然药物以指紋图谱来综合控制质量的方法，特以国家食品药品监督管理局2000年颁发的关于中药材指紋图谱技术要求，对湖南省张家界地区釆集的单面针30批药材进行了研究，独创性地建立起单面针指紋图谱测定方法。该方法通过指紋图谱有效地对不同产地、不同时间、不同批次的单面针药材的有效成分物质群整体进行控制，从而从整体上有效地表征单面针药材质量，达到有效控制单面针药材质量的目的。图1四种检测波长下的HPLC图谱，其中，检测波长的选择(由上至下分别为210nm、254nm、280nm、366nm)。图2单面针液相色谱指紋图谱。图330批单面针药材指紋图谱相似性评价结果。图4样本9的原始液相色谱图谱。图5整体相似度在0.90以上的样本(17批)指紋共有模式(以平均值方法生成)。图6相似度大于0.90的样品中各特征峰峰面积与8个特征峰总峰面积的比例关系。图7相似度大于0.90的样品各特征峰与参照峰峰面积的比例关系。图8整体相似度在0.80以上的样本(21批)指紋共有模式(以平均值方法生成)。图9相似度大于0.80的样品中各特征峰峰面积与8个特征峰总峰面积的比例关系。图10相似度大于0.80的样品各特征峰与参照峰峰面积的比例关系。具体实施方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例l单面针药材供试样品单面针为芸香科植物单面针Z朋仏o;cy/Mmifc^wm//ems/.的干燥根和茎。药材由湖南省株洲千金药业股份有限公司提供，共30批，分别编号为l、2、3........28、29、30。见表1:表1单面针药初1共试样品<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>实施例2供试品的制备药材经粉碎后过40目筛，取各批药材粉末1.0g,精密称定，置于50ml圆底烧瓶中，加石油醚30ml加热回流30min,弃去石油醚液，残渣挥千溶剂，再加甲醇30ml加热回流提取2次，每次lh,趁热滤过，合并两次滤液，蒸干，残渣用甲醇定容至2ml，作为供试品溶液，高效液相分析前用0.45pm微孔滤膜滤过。实施例3参照物的选择单面针药材经上述方法提取后，经HPLC分析出现多个色谱峰，由于目前尚没有单面针专属成分的标准品，故经过详细比较多批次单面针药材的指紋图谱，确定一个稳定出现的色谱峰(6号峰，Rt34min)作为参照物(结构尚未鉴定)进行指紋图谱的分析和评价，经过系统比较分析，证明该方法可行。实施例4检测方法仪器HP1100Series高效液相色谱仪(AgilentTechnologies,USA),配置HPG1311A四元梯度泵，HPG1313A自动进样系统，HPG1315A二极管阵列检测器，HPG1313真空在线脱气机，HPG1316A柱温箱及HPChemStation4.0色谱工作站；KromasilRP-C18(4.6mmx250mm,5,)色谱分析柱。流动相的选择试验过程中共试用了3种流动相系统①<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>302080406040709010③T(min)ACN0.2%磷酸三乙胺095101090301090704060结果表明，上述梯度洗脱中以梯度③为最佳，谱图上各个色谱峰(280nm)的分离度较好，保留时间适中，因此选用该流动相系统作为单面针药材的HPLC指紋图谱检测的流动相。检测波长的确定试验过程中共选择了210nm、254nm、280nm、366nm四种波长，在这四种检测波长下的HPLC图谱中均有多个色谱峰(见图1，由上至下分别为210nm、254nm、280nm、366nm)，但是检测波长在280nm时色谱峰较多且峰形较好，基线也比较平稳，因此综合考虑，选定280nm为制定指紋图谱的检测波长。稳定性试验以编号为4的药材制备供试品，分别在1、2、4、8、12、24小时后进样，记录各共有色谱峰保留时间和积分面积。考察色谱峰保留时间的一致性，各主要色谱峰保留时间的RSD分别为0.06-0.15%,同时考察1~8#特征色谱峰的相似度，各图谱的相似度均达0.90以上。精密度试验以编号为4的药材制备供试品，l天内连续进样5次，记录各共有色谱峰保留时间和积分面积。考察色谱峰保留时间的一致性，各主要色谱峰保留时间的RSD分别为0.04~0.70%。同时考察1~8#特征色谱峰的相似度，各图谱的相似度均达0.90以上。重现性试验取编号为4的药材6份，按3项下方法进行供试品制备并检测，考察各色谱峰相对保留时间、峰面积比值的一致性，同时计算各色谱指紋图谱的相似度。结果表明，所考察的共有峰的相对保留时间及相对峰面积具有较好的重现性，各主要色谱峰保留时间的RSD分别为0.08~0.16%。同时考察1~8#特征色谱峰的相似度，各图谱的相似度均达0.90以上。实施例5单面针HPLC指紋图谱建立指紋特征峰确定综合分析30批供试品HPLC图谱，确定了8个稳定出现的主要色谱峰作为单面针的特征指紋峰，各批次样品中8个主要色谱峰的绝对保留时间见表2，积分面积见表3，平均保留时间见表4。代表性指紋图谱见图2表230批单面针药材绝对保留时间表<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>表330批单面针药材各特征峰积分面积<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>表430批单面针8个特征峰平均保留时间表<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>单面针药材指紋图谱的分析与评价详细比较30批次单面针的液相色谱图，8个特征指紋的有无及含量差异分别构成各自的特征(见图3)，对30批次样品所得的数据进行相似性分析所得结果见表5:表5<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>从此结果可以看出，所检测30批样本的相似度在0.378~0.946间，各样品差异虽然较大，但也有17批样本的相似度在0.9以上，这17批样品显示了较好的一致性；另有4批样本相似度在0.8~0.9之间，查看这21批相似度在0.8以上样本的原始液相色谱图，发现它们均有一共同点6#峰的表观丰度与峰面积比较高而且差别不明显。另外，样品9的相似度低(小于0.8)却是由于7#和8#峰的表观丰度均较6#峰的为高，和构建的指紋图谱共有模式中7#、8#与6#峰的比例关系正好相反，因此它和指紋图谱共有模式的相似性较差，见图4。单面针药材指紋图谱共有模式的建立上述分析表明，单面针药材批间质量差异大，以30批样本的指紋图共建的共有模式难以体现样本之间的差异，为此，根据其相似程度，分别建立共有模式并进行评价整体相似度在0.90以上的样本(17批)指紋共有模式(以平均值方法生成，见图5):分别计算满足该相似度要求的17批药材(1、12、14、18、19、20)8个特征峰峰面积的平均数(A)、标准平均偏差(SD),见表6;各特征峰峰面积与8个特征峰总峰面积的比值、表7，图6);各特征峰峰面积与参照峰(6#)峰面积的比值(表8，图7)。表6相似度大于0.90的17批单面针药材峰面积参数<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>表7相似度大于0.90的样品中各特征峰峰面积与8个特征峰总峰面积的比值<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>*注峰面积比例计算公式I=A/A和I=A/A;其中A表示各特征峰峰面积，<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>A表示某批次药材中8个特征峰的总峰面积，A表示某批次样品中6#特征峰total6的峰面积。表8相似度大于0.90的样品各特征峰峰面积与参照峰峰面积的比值<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>从以上几个图表所显示出的信息可知，这17批样品中各特征峰峰面积与总峰面积及参照峰峰面积的比值较为稳定，即无论这17批样品中各特征峰峰面积的绝对值高低如何变化，它们与总峰面积及参照峰峰面积的比例关系是一致的，这也是这17批样品相似度较高的根本原因。拟定相似度0.90以上样品的各指紋峰与总峰面积、参照峰峰面积的比例关系见表9。表9<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>表8相似度0.90^上样品的各!旨紋峰与总峰面积、参照峰峰面积的最小比值"*注划定依据为x-SD，其中^表示多批次样品中同一特征峰与总峰面积或参照峰峰面积比值的平均值；SD表示多批次样品中同一特征峰与总峰面积或参照峰峰面积比值的相对标准平均偏差。整体相似度在0.80以上的样本(21批)指紋共有模式(以平均值方法生成，如图8):同前法分析与评价相似度在0.8以上的21批药材(1、3、4、5、6、7、10、11、12、13、14、15、16、18、19、20、21、22、23、24、29)的指紋图谱，分别计算这21批药材的8个特征峰峰面积的平均数(A)、标准平均偏差(SD)，见表10;21批样品中各特征峰峰面积占总峰面积的比例(见表ll，图9);21批合格样品中各特征峰峰面积与参照峰峰面积的比例关系(见表12,图IO)表10相似度大于0.8的21批单面针药材峰面积参数<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>表11相似度大于0.80的21批样品中各特征峰峰面积占总峰面积的比例<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>230.0560.0110.0310.0650.0770.6770.0450.038240.0780.0140.0240.1400.2180.3600.1280.037290.0650.0090.0210.1040.2000.4680.1060.026平均值0.0600.0120.0240.0680.1040.6000.0800.051表12相似度大于0.80的21批样品各指紋峰与参照峰(6#)峰面积的比值峰号样品号1#2#3#4#5#6#7#8#10.1510.0250.0510.1220.22110.1830扁30.0340.0070.0190.0480.05610.0590.03340扁0.0070細0.0150.02710.0780.04950.1120.0170細0.1360.16010.0940.06360.0750.0130.0250細0.05310.0830鄉70.1120.0200.0850.2120.32810.1700.107100.1240.0230.0500.1490.26310.1000,249110.0530細0.0140.0280.01610.0600細120.0720.0130.0330.1260.17710.1390.068130.2130雄0.0750.1400.45310.2210.129140.1170.0170.0370扁0.13110.1710.154150.0830扁0.0500.1460.17910.2320.097160.1590.0340.0720.2030.27310.2310層180.0880.0230.0490.1110.15210.1730.137190.0940.0250.0340.0710頻10.1070細200.1400.0260.0490.1600.23810.0970.124210.0460.0100馬0.0360扁10.0840.062220.1590.0460.0540.1740.26210.1360.103230.0820扁0.0460.0970.11310.0670,056240.2180.0390細0.3900.60410.3550.103290.1380.0190.0450.2230.42910.2270.056平均值0.1100皿0.0450.1300.20310.1460.091以上几个图表所显示出的信息可知，这21批样品中各特征峰峰面积与总峰面积及参照峰峰面积的比值较为稳定，即不管这21批样品中各特征峰峰面积的绝对值高低如何变化，它们与总峰面积及6#内标峰峰面积的比例关系是比较一致的。拟定相似度0.80以上样品的各指紋峰与总峰面积、参照峰面积的比例关系见表13。表13相似度0.80以上样品的各指紋峰与总峰面积、参照峰峰面积的最小比值<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>小结本研究共测试30批单面针药材，研究结果表明由于该药材药用部位、生长期、采收时间等的差异，造成30批药材整体指紋图谱差异极大，为此，考虑到企业的生产实际情况，为扩大单面针药源的选择，釆用相似度0.80以上样品来构建共有模式并作为评价标准。权利要求1.一种单面针药材的鉴别方法，包括如下步骤第一步，建立单面针药材的HPLC标准指纹图谱，包括1)供试品溶液的制备精密称取单面针药材粉末，经石油醚预处理后，挥干石油醚，残渣中加入甲醇加热回流，合并滤液，水浴蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至容量瓶中，定容至刻度，得到供试品溶液；2)高效液相色谱分析精密吸取供试品溶液进样，色谱条件色谱柱为KromasilRP-C184.6mm×250mm，5μm；HPG1313A自动进样系统；流动相为乙腈-0.2％磷酸三乙胺溶液；采用梯度洗脱方式0min-10min-30min-70min，乙腈与0.2％磷酸三乙胺溶液的体积比为5∶95-10∶90-10∶90-40∶60；检测波长210～366nm；得到单面针药材HPLC标准指纹图谱；3)测定精密吸取30批单面针药材的供试品溶液各5-20μl，分别注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到30批单面针药材的HPLC指纹图谱并进行比较，得到由共有特征峰构成的单面针药材HPLC标准指纹图谱。所述单面针标准指纹图谱中，共有特征峰有8个，计算各个特征峰与总峰面积的积分相对比值(相对峰面积)，其中1号峰的平均Rt为3.364min，相对峰面积为4.2～7.8％；2号峰的平均Rt为4.620min，相对峰面积为0.8～1.6％；3号峰的平均Rt为10.772min，相对峰面积为1.5～3.3％；4号峰的平均Rt为12.799min，相对峰面积为3.7～9.9％；5号峰的平均Rt为13.828min，相对峰面积为4.5～16.3％；6号峰的平均Rt为34.015min，相对峰面积为46.9～73.1％；7号峰的平均Rt为58.820min，相对峰面积为5.3～10.7％；8号峰的平均Rt为62.179min，相对峰面积为2.7～7.5％；第二步，以上述相同的方法测定待测单面针药材样品的指纹图谱；第三步，将第二步所测定的待测单面针药材样品指纹图谱与第一步构建的单面针标准指纹图谱对比，筛选符合单面针药材标准指纹图谱的合格单面针药材。2、如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述第一步l)中，单面针药材粉末细度为40目。3、如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述第一步l)中，加入石油醚加热回流不少于10分钟，其中，lg单面针药材加入石油醚量不少于10ml;加入甲醇加热回流l次以上，每次不少于10分钟，其中lg单面针药材加入甲醇量不少于10ml。4、如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述第一步l)中，lg单面针药材加入石油醚30ml加热回流30分钟；加入甲醇30ml加热回流2次，每次1小时。5、如切糸I^步1所^的古法.JL步吉^F右千.所^繁一击3〗精密吸取单面针药材的供试品溶液10^1。6、如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述第一步l)中，残渣用甲醇定容至2ml。7、如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述第一步l)中，供试品溶液高效液相分析前用0.45pm微孔滤膜滤过。8、如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述第一步2)中，检测波长为280nm。9、如权利要求l所述的单面针药材鉴别方法，其特征在于所述8个共有特征峰的相对保留时间为，l号峰的平均相对保留时间Rt为3.364min，标准偏差SD为0.019;2号峰的平均相对保留时间Rt为4.620min，标准偏差SD为0.008;3号峰的平均相对保留时间Rt为10.772min，标准偏差SD为0.102;4号峰的平均相对保留时间Rt为12.799min,标准偏差SD为0.082;5号峰的平均相对保留时间Rt为13.828min，标准偏差SD为0.101;6号峰的平均相对保留时间Rt为34.015min,标准偏差SD为0.603;7号峰的平均相对保留时间R,为58.820min，标准偏差SD为0.074;8号峰的平均相对保留时间Rt为62.179min，标准偏差SD为0.256。10.<image>imageseeoriginaldocumentpage4</image>全文摘要本发明涉及一种单面针药材的鉴别方法，包括建立单面针药材的HPLC标准指纹图谱、以上述相同的方法测定待测单面针药材样品的指纹图谱和将第二步所测定的待测单面针药材样品指纹图谱与第一步构建的单面针标准指纹图谱对比，筛选符合单面针药材标准指纹图谱的合格单面针药材。其中，建立单面针药材的HPLC标准指纹图谱包括制备供试品溶液，在色谱柱为KromasilRP-C184.6mm×250mm，5μm；流动相为乙腈-0.2％磷酸三乙胺溶液；采用梯度洗脱方式0min-10min-30min-70min，乙腈与0.2％磷酸三乙胺溶液的体积比为5∶95-10∶90-10∶90-40∶60；检测波长280nm；得到单面针药材HPLC指纹图谱，并通过对30批单面针药材的HPLC指纹图谱进行比较，确定了其共有指纹特征，得到单面针药材的标准指纹图谱。本发明为单面针药材的质量控制和真伪鉴别提供了一种全新的方法。文档编号G01N30/02GK101266233SQ200710064499公开日2008年9月17日申请日期2007年3月16日优先权日2007年3月16日发明者左之文,朱大安,晖滕,王振勇,祝晨陈申请人:株洲千金药业股份有限公司