一种肌苷片质量的测定方法

专利名称：：一种肌苷片质量的测定方法专利说明一种肌苷片质量的测定方法所属领域本发明涉及一种药物的分析测定方法。具体来说，本发明涉及一种对肌苷片主要有效成分的测定方法。
背景技术：
：肌苷是人体中的正常成分，参与人体内核酸代谢、能量代谢和蛋白质合成，活化丙酮酸氧化酶系，提高辅酶A的活性，可使处于低能缺氧状态下的组织细胞继续进行代谢。还可改善肝脏功能，有助于受损肝细胞功能的恢复，可刺激体内产生抗体，并提高肠道对铁的吸收。肌苷片是辅酶类药物，有改善肌体代谢作用。用于各种类型肝脏疾患、心脏疾患、白细胞减少症、血小板减少症、中心视网膜炎、视神经萎缩等属于国家基本药物。药用肌苷是由产肌苷的微生物发酵生成的代谢产物，肌苷产生菌在发酵过程中除产生肌苷(化学名称次黄嘌呤核苷)外还产生次黄嘌呤等肌苷分子的类似物，由于它们结构相似在肌苷片的生产过程中这些类似物很难被除去，因此在肌苷片中含有少量的次黄嘌呤等杂质。而次黄嘌呤与肌苷有共同的紫外吸收结构，因此我国药品部颁标准中所采用的紫外分光光度法测定肌苷片中肌苷含量就难以排除次黄嘌呤等肌苷类似物的干扰。有报道用高压液相色谱法测定肌苷片中肌苷含量，虽分离效果较好但所需设备昂贵、测试成本高难以推广应用。
发明内容为克服现有分析方法的不足，本发明提供一种肌苷片质量的测定方法，具体是采用酶电极型生物传感器法定量测定肌苷片中肌苷含量，用双酶共固定技术将核苷磷酸化酶(EC2.4.2.1)与黄嘌呤脱氢酶(EC1.2.3.2)制成固定化复合酶膜，结合过氧化氢型电极构成肌苷酶电极生物传感器，用于肌苷片中肌苷的含量测定，从而方便、准确、快速地对肌苷片的质量进行测定。技术方案本发明提供的肌苷片质量的测定方法，包括下述顺序的步骤1固定化核苷磷酸化酶、黄嘌呤脱氢酶复合酶膜的制备1.1载体膜圈制备取直径10mm的核微孔膜片用环氧树脂粘贴在内径9.5mm的橡胶密封圈上，放置过夜使固化完全即得。1.2载体膜圈表面处理将载体膜圈置20％甲醇溶液中浸泡15min，取出用蒸馏水冲净、晾干。1.3固定化复合酶膜制备取核苷磷酸化酶0.1单位、黄嘌呤脱氢酶0.03单位、20％牛血清白蛋白5μl、2％戊二醛2μl、均匀喷涂在载体膜圈表面，静置固化15min，用蒸馏水洗去多余反应物，冷冻干燥即得。将此固定化复合酶膜装在过氧化氢电极头部便构成酶电极。2固定化肌苷酶膜参数基础活性＞50，线性1～270mg/L；各点偏差小于1mg，响应30s测定值大于60s测定值的90％，膜完整性亚铁氢化钾测定值-2～6范围内，工作寿命＞25d。3过氧化氢电极制备两电极均为长20mm的圆柱体，铂电极表面积4mm2，银电极表面积60mm2，用专用模具置备。两电极之间填充环氧树脂，电极套头端与酶膜圈应嵌合良好，铂电极与酶膜须紧密接触(见图1)，铂电极为正极；银电极为负极。两电极之间极化电压0.65V，酶电极输出电流0～500nA。4肌苷酶电极生物传感器结构肌苷酶电极生物传感器由生化反应系统(一次仪表)和电信号处理系统(二次仪表)组成(见图2)。5测定方法仪器定标采用0.1mmol/LpH7.2的磷酸盐缓冲液，标准液含肌苷268mg/L，取标准液25μl注入反应池60s后仪器自动显示酶膜基础活性，按动定标键(Calibrate)定标268，自动清洗后即可测定样品。样品制备取肌苷片5片，精密称定，研细，精密称取适量(约相当于肌苷0.10g)，置100ml量瓶中加水适量使溶解，用水稀释至刻度，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密取续滤液10ml，置50ml量瓶中加水稀释至刻度，摇匀，即得，进样量25μl。有益效果用共固定化核苷磷酸化酶-次黄嘌呤脱氢酶复合H2O2电极测定肌苷片中肌苷含量是目前该分析领域最先进的测试手段，其先进性表现为(1)与紫外分光光度法相比具有方法简单、分析专一性好的优点，能测出单个肌苷组分，而不是具有紫外吸收的多个组分；(2)与常规酶法分析相比较，因为采用固定化技术将可溶性酶固定在电极头部反复使用，在测定过程中不会造成酶的流失，从而减低了酶法测定的成本；(3)采用H2O2电极为基础电极，较之pH电极和氧电极其基线电流更加稳定，分析精度高于其它方法。(4)肌苷化学稳定性较差在外界条件改变时易分解产生次黄嘌呤干扰肌苷测定，使测得的结果偏高。采用酶电极法测定肌苷片中的肌苷含量，由于酶促反应专一性高、样品不需分离直接稀释500倍即可进样分析、处理条件温和、反应时间短暂结果较为可靠。图1是肌苷酶电极结构示意图；其中1铂电极；反应(2)，2银电极；反应(3)，3内膜，4固定化核苷磷酸化酶-次黄嘌呤脱氢酶；反应(1)，5核微孔膜，6密封圈，7底物图2是肌苷酶电极生物传感器结构示意图；其中1进样器，2光电开关，3信号处理器，4酶电极，5搅拌子，6电磁搅拌器，7泵1，8缓冲液，9泵2，10废液具体实施例方式1仪器与试药核苷磷酸化酶(EC2.4.2.1)、黄嘌呤脱氢酶(EC1.2.3.2)、肌苷对照品美国Sigma公司；牛血清白蛋白、戊二醛上海化学试剂采购供应站进口分装；核微孔膜(0.2μm)美国Nucleopore公司；铂、银纯度为99.999％，中国人民银行济南分行；其它试剂均为分析纯。SBA-40型肌苷生物传感分析仪。2测定原理固定化双酶复合酶膜结合过氧化氢电极测定肌苷依据下述反应3肌苷对照品溶液制备精密称取肌苷对照品268mg置1000ml容量瓶中，加蒸馏水溶解、定容，作为对照品溶液。4酶电极专一性试验取可能的干扰物配成浓度268mg/L的溶液，以268mg/L的肌苷标准液在肌苷酶电极上的响应为268，测定干扰物溶液在同一酶电极上的相对响应。结果见表1表1酶电极专一性试验Tab1Specificityofenzymeelectrode5酶电极最适pH不同pH磷酸盐缓冲液对肌苷酶电极响应的影响见表2所示，在pH6.8时酶电极响应值最高，所以本研究采用pH6.8的磷酸盐缓冲液。表2不同pH磷酸盐缓冲液对肌苷酶电极响应的影响Tab2EffectsofenzymeelectrodefordifferentpHbuffer6精密度试验对含有肌苷的同一标准液连续测定20次，方法同“仪器定标”结果为n＝20，X＝200.3(mg/L)，s＝2.4(mg/L)，RSD＝1.18％。7线性关系试验用肌苷酶电极测定50、100、150、200、250mg/L肌苷标准液，以浓度为X，响应值为Y进行回归分析。得线性回归方程Y＝1.582+0.974X，r＝0.9986，其中X为浓度，Y为响应值，r为相关系数。8加样回收试验取稀释的肌苷片样品溶液分为5份加已知浓度的肌苷标准液进行回收试验。结果见表3表3肌苷回收试验结果Tab3Recoveryresultsforinosine(n＝3)9酶电极法与紫外分光光度法对比试验酶电极法照“仪器定标”操作，紫外分光光度法照卫生部部颁标准肌苷片含量测定项下操作。结果见表4表4肌苷片中肌苷含量测定结果％Tab4Contentsofinpsineinitstablets％(n＝3)权利要求1.一种肌苷片质量的测定方法，包括下述顺序的步骤1固定化核苷磷酸化酶、黄嘌呤脱氢酶复合酶膜的制备1.1载体膜圈制备取直径10mm的核微孔膜片用环氧树脂粘贴在内径9.5mm的橡胶密封圈上，放置过夜使固化完全即得。1.2载体膜圈表面处理将载体膜圈置20％甲醇溶液中浸泡15min，取出用蒸馏水冲净、晾干。1.3固定化复合酶膜制备取核苷磷酸化酶0.1单位、黄嘌呤脱氢酶0.03单位、20％牛血清白蛋白5μl、2％戊二醛2μl、均匀喷涂在载体膜圈表面，静置固化15min，用蒸馏水洗去多余反应物，冷冻干燥即得。将此固定化复合酶膜装在过氧化氢电极头部便构成酶电极。2.固定化肌苷酶膜参数基础活性＞50，线性1～270mg/L；各点偏差小于1mg，响应30s测定值大于60s测定值的90％，膜完整性亚铁氢化钾测定值-2～6范围内，工作寿命＞25d。3.过氧化氢电极制备两电极均为长20mm的圆柱体，铂电极表面积4mm2，银电极表面积60mm2，用专用模具置备。两电极之间填充环氧树脂，电极套头端与酶膜圈应嵌合良好，铂电极与酶膜须紧密接触(见图1)，铂电极为正极；银电极为负极。两电极之间极化电压0.65V，酶电极输出电流0～500nA。4.肌苷酶电极生物传感器结构肌苷酶电极生物传感器由生化反应系统(一次仪表)和电信号处理系统(二次仪表)组成(见图2)。5.测定方法仪器定标采用0.1mmol/LpH7.2的磷酸盐缓冲液，标准液含肌苷268mg/L，取标准液25μl注入反应池60s后仪器自动显示酶膜基础活性，按动定标键(Calibrate)定标268，自动清洗后即可测定样品。样品制备取肌苷片5片，精密称定，研细，精密称取适量(约相当于肌苷0.10g)，置100ml量瓶中加水适量使溶解，用水稀释至刻度，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密取续滤液10ml，置50ml量瓶中加水稀释至刻度，摇匀，即得，进样量25μl。全文摘要本发明涉及一种肌苷片质量的测定方法，属生物传感器
技术领域：
。制备方法是将核苷磷酸化酶与次黄嘌呤脱氢酶共固定化后与H2O2电极结合构成肌苷酶电极生物传感器，采用0.1mmol.L-1pH7.2的磷酸盐缓冲液，标准液含次黄嘌呤268mg.L-1，取标准液25μl注入反应池25s后仪器自动显示酶膜基础活性，按动定标键(Calibrate)定标100，自动清洗后即可测定样品。文档编号G01N27/49GK101162214SQ20071011417公开日2008年4月16日申请日期2007年11月16日优先权日2007年11月16日发明者孙士青,史建国,杨俊惠,马耀宏,李雪梅,张立群,孟庆军,艳杨,王丙莲申请人:山东省科学院生物研究所