专利名称：一种新型肌苷产生菌及其生产肌苷的方法
技术领域：
本发明涉及一种生产肌苷的微生物菌株及利用该菌株发酵生产肌苷的方法。
肌苷(Inosine)，学名次黄嘌呤核苷，是有一定医疗价值的药物，可用于治疗肝脏、心脏疾病，白血球、血小板减少症；中心视神经膜炎、视神经萎缩等疾病及放疗造成的血小球减少症；此外，还可作为合成抗病毒药和食品呈味剂的原料。
生产肌苷大致有3种方法1.利用化学全合成法；2.酶解法，从酵母菌或其他细胞中提取核糖核酸，在利用酶法降解提取肌苷；3.发酵法；目前，国内外一般采用枯草杆菌发酵法生产肌苷。1963年，已有报道从各种菌的嘌呤缺陷型生产各种嘌呤核苷酸衍生物；同年，报道了枯草杆菌的腺嘌呤缺陷型产肌苷达7g/l，基本建立肌苷的工业生产。(乔宾福工业微生物84(2))，1970年，日本协和发酵工业公司分离出KY13714(Akira Funya et al，Appl.Microbiol.，1970 20(2)265)，产肌苷10g/l左右。1981年，上海工业微生物研究所采用枯草芽孢杆菌301菌株，在生产罐中，平均产肌苷12g/l(项目年度编号89203223).1986年，复旦大学采用枯草芽孢杆菌FD8601在240升发酵罐上平均产肌苷17.59g/l。(成果鉴定编号国家级872129)1994年，吴江报道(南京农业大学学报94.17(2)，66-69)用枯草杆菌变异株在5L全自动发酵罐上进行多次试验，肌苷产量为15g/l。1994年，刘长云等报道(中国药科大学学报94，25(1)，56-60)采用枯草芽孢杆菌的变异株LSBS1255，摇瓶72h，产肌苷为27.43mg/ml。1995年，邱玉棠等报道(核农学报，9(3)，129-133)，利用GMI-741摇瓶发酵，产肌苷25.18g/l。1995年，陈宁等报道(天津轻工业学院学报)用枯草杆菌TSXB29，在最佳摇瓶发酵条件下，平均摇瓶产肌苷27.85g/l。上述研究都是采用枯草杆菌利用酵母粉发酵生产肌苷，该工艺采用药用酵母粉(难容于水)为主要原材料，价格较高(目前每吨约10000元)，培养基灭菌温度、时间较难控制，易造成污染，发酵结束后，发酵醪液粘度较大，增加后提取——离子交换工序的难度。
本发明的目的是提供一种新型肌苷产生菌及其利用该菌株发酵生产肌苷的方法。以便能用较便宜并易溶于水的材料代替以往肌苷发酵中采用的价格昂贵的原材料——药用酵母粉，并解决上述现有发酵法生产肌苷所存在的问题。
本发明所提供的微生物菌株是经选育的肌苷高产突变株产氨短杆菌(Brevibacteriumammoniagenes)GMA-1198。该菌种保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NOM201025。保藏时间为2001年7月11日。该菌种以下简称为GMA-1198 CCTCCM201025。
本肌苷高产突变株产氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)GMA-1198 CCTCCM201025的微生物特性为具有腺嘌呤、生物素双重营养缺陷型及对8-氮杂鸟嘌呤、6-巯基嘌呤、黄胺呱有抗性，在保藏斜面或肉汤平皿上28～34℃培养12～18小时，斜面培养物呈淡黄色，平皿上菌落颜色呈淡黄色，直径约1～10mm，其生产适宜条件为1.培养物(肉汤平皿或保藏斜面培养基同)蛋白胨3～6g/l，牛肉膏10～18g/l，酵母膏5～1 0g/l，琼脂15～25g/l。2.培养温度25℃～35℃。培养物pH值6.5～7.5。在液体活化培养基中，28℃～34℃，培养12～18小时，每毫升菌数在2.0×1010以上，在培养物中散发出浓烈的氨味，pH值上升到8.0以上。其适宜生长条件为1.培养物葡萄糖10～30g/l，尿素3～6g/l，玉米浆4～10g/l，蛋白胨5～15g/l，酵母膏5～15，腺嘌呤0.010～0.040。2.培养温度25～35℃。3.培养pH值6.0～9.0。
本发明所提供的生产肌苷的方法，其特点是用肌苷高产突变株产氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)GMA-1198 CCTCC M201025做发酵菌株，利用糖质原料和生长素进行摇瓶发酵。
所说的糖质原料可为葡萄糖或(和)用糖化酶和α-淀粉酶水解的淀粉双酶水解糖(用糖化酶和α-淀粉酶水解)或(和)糖蜜等；所说的生长素为谷氨酸钠加次黄嘌呤，其组分为(重量百分比)谷氨酸钠80～90％，次黄嘌呤10～20％。
所说的生长素还可采用味精母液或谷氨酸发酵液经硫酸或盐酸冷冻、等电点提取后的高峰液再添加次黄嘌呤，生长素(100％)＝80～90％谷氨酸钠+10～20％次黄嘌呤[均折实际含量(重量)]。
利用本肌苷高产突变株产氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)GMA-1198 CCTCCM201025，摇瓶发酵生产肌苷的工艺过程如下(1)化冻干保藏种(GMA-1198 CCTCC M201025)打开冻干管，用常规方法挑选产肌苷最高的单菌落，用接种针接种于保藏斜面上培养。
(2)斜面菌种活化将培养好的保藏斜面种(GMA-1198 CCTCC M201025)划线于新配制的活化斜面上进行活化。
(3)菌种的液体活化将培养好的活化斜面种接一环于液体活化培养基中进行液体活化，使液体种的菌数达到2.0×1010个/ml以上。
(4)摇瓶发酵按5～10％(V/V)接种量，接入含糖质原料和生长素发酵培养基中进行发酵，待残糖下降至3g/l以下时，停止发酵。适宜的发酵培养基成份如下(按每升培养基所含克重g/l计算)总还原糖100～140，玉米浆10～50，硫酸铵5～15，生长素2～10，磷酸二氢钾1～5，碳酸钙10～40，尿素2～8，硫酸镁0.5～2，pH6.5～7.5。
(5)发酵完毕的摇瓶发酵醪液经提取工艺(可采用一般传统的提取工艺)即得含肌苷的制品。
在步骤(1)中，冻干用的牛奶必须新鲜牛奶，冻干管保藏的菌种保藏的时间较长，保藏时间可长达10年以上。从冻干种中转出来种必须进行分纯，挑选出产肌苷最高的单菌落，再接一批于保藏斜面上培养，备用。
在步骤(2)中，培养好的保藏斜面种保藏时间最长不要超过半年，如时间太长，必须从冻干种中转出种来。
在步骤(5)中，发酵完毕后的摇瓶发酵醪液可先分析测定肌苷含量后再提取肌苷。采用的分析方法以纸层析为准，发酵液下摇瓶后，用4000r/m转速的离心机离心10分钟，用50ul微量进样器点3号层析纸，硫酸铵作展开剂，展层5～10小时，烘干，用紫外分析仪照出肌苷斑点，剪下斑点，用0.001mmol/l的HCl浸泡1-4小时。用752紫外分光光度计于260nm波长处测定紫外光吸收值，计算发酵醪液含肌苷量。
本发明中用生长素代替以往肌苷发酵采用药用酵母粉和氯化钾作为原料，与用枯草杆菌采用药用酵母粉等作为原料的现有工艺相比，发酵培养基灭菌温度、时间较易控制，降低污染可能性，放罐发酵液粘度小，避免因消毒不彻底而增加的染菌机会(酵母粉消毒较难彻底)；且发酵液离心后，非常澄清，发酵醪液沉淀物也比用现有工艺进行发酵时少，这样就有利后提取工序——离子交换工序，提高提取率产氨短杆菌发酵速度、长菌速度比肌苷产生菌枯草杆菌快，产苷期大为提前，在同样实验条件下本发明的发酵周期只要60小时左右，而现有工艺发酵周期要70h；本发明在最佳摇瓶发酵工艺条件下，产肌苷最高可达28g/l，达到现有工艺的最高水平；同时，因发酵原材料不用酵母粉，使发酵成本降低，其主要原材料成本比现有工艺下降20％左右。
实施例一利用肌苷高产突变株产氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)GMA-1198 CCTCCM201025做发酵菌株，以葡萄糖为原料摇瓶发酵生产肌苷。
打开冻干管，在管内加少许无菌水，用接种针将保藏的菌种转入活化斜面中，32℃培养24小时，再将活化好的斜面种转入液体活化培养基中，24℃培养15小时，后用无菌水按一定稀释度进行进行稀释，涂肉汤平皿，肉汤平皿18-34℃培养18-30小时，挑选产肌苷最高的单菌落，用接种针接种于保藏斜面上培养。保藏斜面培养基的组成(g/l)蛋白胨4，牛肉膏14，酵母膏7，琼脂20，pH7.0。)，转接到新配置的活化斜面培养基上，活化斜面培养基的组成(g/l)如下葡萄糖20，尿素4.0，玉米浆6，蛋白胨1 0，酵母膏10，腺嘌呤0.025，琼脂20，pH7.0。经32℃恒温培养20小时后，接一环于液体活化培养基中，液体活化培养基的组成(g/l)如下葡萄糖20，尿素4.0，玉米浆6，蛋白胨1 0，酵母膏10，腺嘌呤0.025，pH7.0。液体活化培养基于32℃水浴摇床(冲程70mm、转速96r/m)振荡培养15小时，这时，菌液浓度一般OD(菌液稀释20倍，用721分光光度计650nm波长、1cm比色皿，蒸溜水作参比，测定光吸收值)达0.8以上。取1ml菌液(5％接种量)，接入发酵培养基中，发酵培养基的组成(g/l)如下葡萄糖120，玉米浆30，(NH4)2SO410，KH2PO43，生长素6，尿素5(分开灭菌)，CaCO320(先称入空三角瓶中)MgSO4·7H2O1，pH7.0。
发酵培养基装于500ml三角瓶中，装量20ml，于76mm冲程、转速120r/m往复式摇床振荡培养，温度控制方式如下0～12小时，32℃；12～24小时，33℃；24～36小时，34℃；36～48小时，35℃；48～61小时，36℃。待残糖下降至3g/l以下时，停止发酵，这时的发酵液澄清，镜检菌体完整。发酵液经离心后，取上清液，用纸层析法测定肌苷含量，其肌苷含量为25.4g/l，与国内目前采用的发酵工艺(采用药用酵母粉)相比，发酵主要原材料成本下降20％左右。
实施例二利用肌苷高产突变株产氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)GMA-1198 CCTCCM201025做发酵菌株，以淀粉双酶糖为原料摇瓶发酵生产肌苷。
打开冻干管(方法同实施例一)，转入保藏斜面中，保藏斜面培养基的组成(g/l)蛋白胨4，牛肉膏14，酵母膏7，琼脂20，pH7.0。)，转接到新配置的活化斜面培养基上，活化斜面培养基的组成(g/l)如下葡萄糖20，尿素4.0，玉米浆6，蛋白胨10，酵母膏10，腺嘌呤0.025，琼脂200，pH7.0。经32℃恒温培养20小时后，接一环于液体活化培养基中，液体活化培养基的组成(g/l)如下淀粉双酶糖(新酶解，折实际含糖计算)20，尿素4.0，玉米浆6，蛋白胨10，酵母膏10，腺嘌呤0.025，pH7.0。液体活化培养基于32℃水浴摇床(冲程70mm、转速96r/m)振荡培养15小时，这时，菌液浓度一般OD(菌液稀释20倍，用721分光光度计650nm波长、1cm比色皿，蒸溜水作参比，测定光吸收值)达0.8以上。取1ml菌液(5％接种量)，接入发酵培养基中，发酵培养基的组成(g/l)如下淀粉双酶糖(折实际含葡萄糖计算)120，玉米浆25，(NH4)2SO410，KH2PO43，生长素6，尿素5(分开灭菌)，CaCO320(先称入空三角瓶中)MgSO4·7H2O1，pH7.0。
发酵培养基装于500ml三角瓶中，装量20ml，于76mm冲程、转速120r/m往复式摇床振荡培养，温度控制方式如下0～12小时，32℃；12～24小时，33℃；24～36小时，34℃；36～48小时，35℃；48～56小时，36℃，待残糖下降至2.5g/l以下时，停止发酵。下摇瓶时，放瓶发酵液澄清，镜检菌体完整，发酵液经离心后，取上清液，用纸层析法测定其肌苷含量，产肌苷27.6g/l，与国内目前采用的发酵工艺(采用药用酵母粉)相比，发酵主要原材料成本下降24％左右。
实施例三利用肌苷高产突变株产氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)GMA-1198 CCTCCM201025做发酵菌株，以甘蔗糖蜜为原料摇瓶发酵生产肌苷。
打开冻干管(方法同实施例一)，转入保藏斜面中，保藏斜面培养基的组成(g/l)蛋白胨4，牛肉膏14，酵母膏7，琼脂20，pH7.0。)，转接到新配置的活化斜面培养基上，活化斜面培养基的组成(g/l)如下葡萄糖20，尿素4.0，玉米浆6，蛋白胨10，酵母膏10，腺嘌呤0.025，琼脂20，pH7.0。经32℃恒温培养20小时后，接一环于液体活化培养基中，液体活化培养基的组成(g/l)如下葡萄糖20，尿素4.0，玉米浆6，蛋白胨10，酵母膏10，腺嘌呤0.025，pH7.0。液体活化培养基于32℃水浴摇床(冲程70mm、转速96r/m)振荡培养15小时，这时，菌液浓度一般OD(菌液稀释20倍，用721分光光度计650nm波长、1cm比色皿，蒸溜水作参比，测定光吸收值)达0.8以上。取1ml菌液(5％接种量)，接入发酵培养基中，发酵培养基的组成(g/l)如下甘蔗糖蜜(折实际含糖计算)120，玉米浆20，(NH4)2SO410，KH2PO43，生长素4，尿素5(分开灭菌)，CaCO320(先称入空三角瓶中)MgSO4·7H2O1，pH7.0。
发酵培养基装于500ml三角瓶中，装量20ml，于76mm冲程、转速120r/m往复式摇床振荡培养，温度控制方式如下0～12小时，32℃；12～24小时，33℃；24～36小时，34℃；36～48小时，35℃；48～72小时，36℃，待残糖下降至3g/l以下时，停止发酵。下摇瓶时，放瓶发酵液较澄清，镜检菌体完整，发酵液经离心后，取上清液，用纸层析法测定其肌苷含量，产肌苷18.7g/l，与国内目前采用的发酵工艺(采用药用酵母粉)相比，发酵主要原材料成本下降17％左右。
权利要求
1.一种新型肌苷产生菌，其特征在于该菌株是经选育的肌苷高产突变株产氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)GMA-1198 CCTCC M201025。
2.一种肌苷生产方法，其特征在于用肌苷高产突变株产氨短杆菌(Brevibacteriumammoniagenes)GMA-1198 CCTCC M201025做发酵菌株，利用糖质原料和生长素进行摇瓶发酵。
3.根据权利要求2所述的肌苷生产方法，其特征在于所说的糖质原料为为葡萄糖或(和)用糖化酶和α-淀粉酶水解的淀粉双酶水解糖或(和)糖蜜。
4.根据权利要求2所述的肌苷生产方法，其特征在于所说的生长素为谷氨酸钠加次黄嘌呤，其组分为(重量百分比)谷氨酸钠80～90％，次黄嘌呤10～20％。
5.根据权利要求2所述的肌苷生产方法，其特征在于所说的生长素为味精母液或谷氨酸发酵液经硫酸或盐酸冷冻、等电点提取后的高峰液再添加次黄嘌呤，生长素(100％)＝80～90％谷氨酸钠+10～20％次黄嘌呤[(均折实际含量(重量)]。
6.根据权利要求2所述的肌苷生产方法，其特征在于所说的摇瓶发酵生产肌苷的工艺过程为(1)化冻干保藏种(GMA-1198 CCTCC M201025)打开冻干管，用常规方法挑选产肌苷最高的单菌落，用接种针接种于保藏斜面上培养；(2)斜面菌种活化将培养好的保藏斜面种(GMA-1198 CCTCC M201025)划线于新配制的活化斜面上进行活化；(3)菌种的液体活化将培养好的活化斜面种接一环于液体活化培养基中进行液体活化，使液体种的菌数达到2.0×1010个/ml以上；(4)摇瓶发酵按5～10％(V/V)接种量，接入含糖质原料和生长素的发酵培养基中进行发酵，待残糖下降至3g/l以下时，停止发酵；(5)发酵完毕的摇瓶发酵醪液经提取工艺(可采用一般传统的提取工艺)即得含肌苷的制品。
7.根据权利要求6所述的肌苷生产方法，其特征是在在步骤(4)中，适宜的发酵培养基成份如下(按每升培养基所含克重g/l计算)总还原糖100～140，玉米浆10～50，硫酸铵5～15，生长素2～10，磷酸二氢钾1～5，碳酸钙10～40，尿素2～8，硫酸镁0.5～2，pH6.5～7.5，其中碳酸钙单独称入三角瓶中，尿素分开灭菌。
全文摘要
本发明提供一种新型肌苷产生菌及其生产肌苷的方法，该新型肌苷产生菌为经选育的肌苷高产突变株产氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)GMA－1198 CCTCCM201025。本发明所提供的生产肌苷的方法，其特点是用GMA－1198 CCTCC M201025做发酵菌株，利用糖质原料和生长素进行摇瓶发酵。本发明发酵成本低、肌苷提取率高，产肌苷最高可达28g/l，达到现有工艺的最高水平。
文档编号C12P19/40GK1410527SQ0112788
公开日2003年4月16日 申请日期2001年9月25日 优先权日2001年9月25日
发明者施庆珊, 邱玉棠, 李良秋, 林小平 申请人:广东省微生物研究所