专利名称：一种提高肌苷发酵过程糖苷转化率及产率的方法
技术领域：
本发明涉及一种发酵法制备肌苷的改进方法。
背景技术：
枯草芽胞杆菌是工业生产肌苷的常用菌株。在枯草芽胞杆菌嘌呤途径合成的代谢途径已经清楚的前提下，理论上通过计算可以得出嘌呤生产的得率在0.5g核苷/g葡萄糖，而目前实际得率仅有0.18g核苷/g葡萄糖，较理论值有较大的差距，所以仍具有很大的研究空间。但是，相对于产率的提高而言，提高糖苷转化率却有相当大的难度。
近来，代谢工程领域的研究结果表明，在枯草杆菌中糖酵解途径(EMP)相对于三羧酸循环(TCA)过量，即EMP通量超出了TCA代谢的能力，造成碳“溢流”以及过量ATP的合成。那么，连接EMP和TCA的丙酮酸会发生积累，并且会通过其它途径进行代谢以缓解持续的“溢流”。因此，过量碳的溢流会导致有机酸和其他物质的生成。在枯草芽胞杆菌中，分析葡萄糖在胞内的代谢途径，明显可以看到产物肌苷是通过HMP途径进而经由嘌呤途径而合成的，这样代谢流在EMP、TCA和HMP之间的合理分配就成为提高肌苷产率的前提。
发明内容
本发明采用在培养基中添加一定量的柠檬酸或柠檬酸盐来提高枯草芽胞杆菌肌苷发酵过程的糖苷转化率。柠檬酸或柠檬酸盐可以抑制丙酮酸激酶的活性，减少丙酮酸的积累，造成磷酸烯醇式丙酮酸的积累。磷酸烯醇式丙酮酸是EMP途径限速酶磷酸果糖激酶的抑制剂，所以磷酸烯醇式丙酮酸的积累降低了磷酸果糖激酶的活性，从而降低了EMP途径的通量，缓解了EMP和TCA之间的代谢溢流。同时，葡萄糖总通量没有变化，所以更多的葡萄糖进入HMP途径合成肌苷，相应地提高了肌苷的产率和糖苷转化率。
技术方案本发明所说的发酵法制备肌苷的方法，采用现有的菌株及发酵工艺，其特征在于，在发酵培养基中添加柠檬酸或其盐，使其在培养基中的浓度为0.01～5g/L，优选0.08～2g/L，更优选0.1～1g/L。所说的柠檬酸盐优选柠檬酸钾或柠檬酸钠。
本发明根据调整代谢流分配的原理提出了适用于提高枯草杆菌肌苷发酵过程中糖苷转化率的方法，它通过降低丙酮酸激酶和磷酸果糖激酶的活力，减弱糖酵解途径通量，降低有机酸的合成，缓解EMP和TCA之间的代谢溢流，使更多的葡萄糖进入HMP途径，合成更多的产物。从而在糖耗相同的基础上合成较多的肌苷，即提高了糖苷转化率。在整个发酵过程的不同时期，糖苷转化率较对照提高6.6％-51.7％，放瓶时达到0.267g核苷/g葡萄糖。
具体实施例方式
下面通过实施例对本发明作进一步的说明，所举之例并不限制本发明的保护范围实施例采用的菌株为枯草芽胞杆菌；培养基为在发酵培养基(现有)中添加2g/L柠檬酸钠；摇瓶培养方法37℃，20ml/500ml三角瓶，260rpm，56小时。实验结果及对比情况见表1表1
从表1可以看出，在整个发酵过程的不同时期，加柠檬酸钠时的糖苷转化率较对照提高6.6％-51.7％，放瓶时达到0.267g核苷/g葡萄糖；加柠檬酸钠时的肌苷产率较对照提高16.5％-22.7％，放瓶时达到16g/L。
采用表2中的方法进行发酵过程糖代谢关键酶比活(U/mg蛋白)测定，测定结果见表3。
表2
表3
由表3可以看出，柠檬酸钠的添加抑制了EMP途径关键酶6-磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶的活性，对葡萄糖激酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶活性影响不大。至于柠檬酸合成酶活性下降是由于柠檬酸存在的缘故，菌体直接优先利用外源添加的柠檬酸，然后再用自行内源合成柠檬酸。所以，酶学研究的结果进一步验证了本发明提出的方法。
权利要求
1.一种发酵法制备肌苷的方法，采用现有的菌株及发酵工艺，其特征在于，在发酵培养基中添加柠檬酸或其盐，使其在培养基中的浓度为0.01～5g/L。
2.如权利要求1所说的方法，其特征在于，其中所说的柠檬酸或其盐的浓度为0.08～2g/L。
3.如权利要求2所说的方法，其特征在于，其中所说的柠檬酸或其盐的浓度为0.1～1g/L。
4.如权利要求1～3所说的任意一种方法，其特征在于，其中所说的柠檬酸盐为檬酸钾或柠檬酸钠。
全文摘要
本发明涉及一种发酵法制备肌苷的改进方法。本发明根据调整细胞代谢流分配的原理，采用在培养基中添加柠檬酸或其盐的方法，来有效提高枯草芽胞杆菌肌苷发酵过程的糖苷转化率及肌苷产率。
文档编号C12P19/00GK1554769SQ200310122798
公开日2004年12月15日 申请日期2003年12月25日 优先权日2003年12月25日
发明者储炬, 陈双喜, 张嗣良, 庄英萍, 储 炬 申请人:华东理工大学