专利名称：一种小麦低分子量麦谷蛋白亚基基因及其胚乳特异表达启动子的连续核酸序列及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物基因工程技术领域，尤其是涉及一种小麦低分子量麦谷蛋白亚基基因及其胚乳特异表达启动子(XYGluD3-LMWGS1)的核酸序列及其应用，其应用基于该序列通过基因工程方法改良小麦加工品质。
背景技术：
小麦低分子量麦谷蛋白(Low Molecular Weight Glutenin)是小麦种子中的一类重要的贮藏蛋白。编码这类蛋白的基因座位(Glu-3)位于第一同源群染色体(1A、1B、1D)的短臂上。每个基因座位包括2-7个基因，它们分别编码分子量大小不同的亚基。Glu-3的三个位点(即Glu-A3、Glu-B3和Glu-D3)均存在基因等位变异，故其编码的亚基都存在着多态性。每个六倍体普通小麦品种应该包含多个不同的低分子量麦谷蛋白亚基(LMW-GS)。小麦LMW-GS组成对其加工品质性状有重要的影响，它和高分子量麦谷蛋白亚基(HMW-GS)相互作用，共同决定着小麦面团的弹性和强度。LMW-GS组成对加工品质的贡献已从遗传、蛋白结构等方面得到确证。研究认为基因Glu-A3b和Glu-B3b分别优于其等位基因Glu-A3d和Glu-B3h。利用SDS-PAGE、PCR方法进行追踪，通过转基因导入外源HMW-GS和LMW-GS基因，提高小麦的加工品质的研究在国外已有成功的报道。
小麦低分子量麦谷蛋白亚基基因(XYGluD3-LMWGS1)存在于面包小麦小偃6号等品种中，是Glu-D3位点的一个基因。该基因编码的LMW-GS含有304个氨基酸残基(其中N-末端的20个为信号肽)，其中包含9个半胱氨酸残基；比所有已知LMW-GS多1个半胱氨酸残基，该亚基类型的出现与面包加工品质呈正相关，是中国独特的优质基因资源。
发明内容
本发明以我国优质小麦品种小偃6号为材料，提供一种小麦低分子量麦谷蛋白亚基基因及其启动子的核酸序列及其应用，首次从小偃6号中克隆了Glu-D3位点的一种LMW-GS基因(XYGluD3-LMWGS1)；并开展了基于该基因的分子标记和转基因研究，以培育出新的优质种质或品种。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为一种小麦低分子量麦谷蛋白亚基基因及其胚乳特异表达启动子的连续核酸序列，其特殊之处在于该基因及其启动子序列为1TTGTAGAAAC TGCCATCCTT TACATGTAAA GCGGATTCGA TGAGTCATGT51 CATGCTCTAT AGACGTCAGT TTATCTTATC ATCTTACAGG AAAGTACAAA101 GTTAGTTTTC TGAAAAGCAA CCGAATATAG AAGAACACTC CACACTCAAG151 GCTTTACTAA TCGAGCATAT CCTAACAGCC CACACATGAT TGCAAACTTA201 GTCATACACA AGTTTTGCCT TTCTTGTTTA CGGCTGACAG CCTATACAAG251 GTTCCAAACT CGGTTGTAAA AGTGATACTA TCTTGATAAG TGTGTGACAT301 GTAAAGTTAA TAAGGTGAGT CATATATAGC AAATATCGGG GTTTCTGTAC351 TTTGTGTGTG ATCGTATGCA CAACTAAAAA TCAACTTTGA TGATCAATAT401 ATCCAAAAGT ACGCTTGTAG CTAGTGCAAA CCTAACACAA TGTAACAAAA
451 TAATTCATTT CAGATGGAGC CAAACAGAAT TATTAAAGCT GATGCAAAGA501 AGGAAAAGAG GTGGTTCCTG GGCTACTATA AATAGGCATG AAGTATAAAG551 ATCATCACAA GCACAAGCAT CAGAACCAAG CAACACTAGT TAACACCAAT601 CCACCATGAA GACCTTCCTC GTCTTTGCCC TCCTCGCCGT TGCGGCGACA651 AGTGCAATTG CGCAGATGGA GACTAGATGC ATCCCTGGTT TGGAGAGACC701 ATGGCAGCAG CAACCATTAC CACCACAACA GACATTTCCA CAACAACCAC751 TATTTTCACA ACAACAACAA CTATTTCCTC AACAACCATC ATTTTCGCAG801 CAACAACCAC CATTTTGGCA GCAACAACCA CCATTTTCTC AGCAACAACC851 AATTCTACCA CAGCAACCAC CATTTTCGCA GCAACAACAA CTAGTTCTAC901 CGCAACAACC ACCATTTTCA CAGCAACAAC AACCAGTTTT ACCTCCACAA951 CAATCACCTT TTCCACAACA ACAACAACAC CAACAGCTGG TGCAACAACA1001 AATCCCTGTT GTTCAGCCAT CCATTTTGCA GCAGCTAAAC CCATGCAAGC1051 TATTCCTCCA GCAGCAGTGC AGCCCTGTGG CAATGCCACA ACGTCTTGCT1101 AGGTCGCAAA TGTTGCAGCA GAGCTGTTGC CATGTGATGC AACAACAATG1151 TTGCCAGCAG TTGCCGCAAA TCCCCCAGCA ATCCCGCTAT GAGGCAATCC1201 GTGCTATCAT CTACTCCATC ATCCTGCAAG AACAACAACA GGTTCAGGGT1251 TCCATCCAAT CTCAGCAGCA GCAACCCCAA CAGTTGGGCC AATGTGTTTC1301 CCAACCCCAA CAACAGTCGC AGCAGCAACT CGGGCAACAA CCTCAACAAC1351 AACAATTGGC ACAGGGTACC TTTTTGCAGC CACACCAGAT AGCTCAGCTT1401 GAGGTGATGA CTTCCATTGC GCTCCGTATC CTGCCAACGA TGTGCAGTGT1451 TAATGTGCCG TTGTACAGAA CCACCACTAG TGTGCCATTC GACGTTGGCA1501 CCGGAGTTGG TGCCTACTGA TAAGGAAAGA TCTCTAGTAA TATATAATTG
1551 GGTCACCGTT GTTTAGTCGA TGGATATGTC GATGCAGCGG TGAC上述胚乳特异表达启动子(XYGluD3-LMWGS1)的PCR方式克隆时的引物序列为5’TTGTAGAAACTGCCATCCTT 3’5’GTCACCGCTGCATCGACATA 3’一种小麦低分子量麦谷蛋白亚基基因及其胚乳特异表达启动子的连续核酸序列的应用，其特殊之处在于通过基因枪、农杆菌介导、花粉管通道等方法导入小麦，培育出加工品质优良的小麦品种或小麦种质。
一种小麦低分子量麦谷蛋白亚基基因及其胚乳特异表达启动子的核酸序列的应用，其特殊之处在于根据该基因的胚乳特异表达启动子的核酸序列构建种子胚乳特异表达载体，将外源目的基因导入小麦，培育出加工品质优良的小麦品种和小麦种质。
与现有技术相比，本发明具有的优点和效果如下1、本发明首次从小偃6号中克隆了Glu-D3位点的一种LMW-GS基因(XYGluD3-LMWGS1)；并开展了基于该基因的分子标记和转基因研究，以期培育出新的优质种质或品种；2、本发明以我国优质小麦品种小偃6号为材料，通过位点特异PCR扩增Glu-D3位点的一种基因的完整编码区和其胚乳特异表达启动子区，并将该基因及其启动子克隆入一种克隆载体中。
3、本发明经测序和分析结果表明，基因XYGluD3-LMWGS1是不同于已经公布的所有LMW-GS基因的一种新的LMW-GS基因类型，该序列特征显示该序列的独特之处和导致优质的潜在因素。
具体实施例方式1、基因序列小麦麦谷蛋白Glu-D3位点控制的一种低分子量麦谷蛋白亚基基因及其胚乳特异表达启动子(XYGluD3-LMWGS1)的连续核酸序列。该基因及其启动子的序列为1TTGTAGAAAC TGCCATCCTT TACATGTAAA GCGGATTCGA TGAGTCATGT51 CATGCTCTAT AGACGTCAGT TTATCTTATC ATCTTACAGG AAAGTACAAA101 GTTAGTTTTC TGAAAAGCAA CCGAATATAG AAGAACACTC CACACTCAAG151 GCTTTACTAA TCGAGCATAT CCTAACAGCC CACACATGAT TGCAAACTTA201 GTCATACACA AGTTTTGCCT TTCTTGTTTA CGGCTGACAG CCTATACAAG251 GTTCCAAACT CGGTTGTAAA AGTGATACTA TCTTGATAAG TGTGTGACAT301 GTAAAGTTAA TAAGGTGAGT CATATATAGC AAATATCGGG GTTTCTGTAC351 TTTGTGTGTG ATCGTATGCA CAACTAAAAA TCAACTTTGA TGATCAATAT401 ATCCAAAAGT ACGCTTGTAG CTAGTGCAAA CCTAACACAA TGTAACAAAA451 TAATTCATTT CAGATGGAGC CAAACAGAAT TATTAAAGCT GATGCAAAGA501 AGGAAAAGAG GTGGTTCCTG GGCTACTATA AATAGGCATG AAGTATAAAG551 ATCATCACAA GCACAAGCAT CAGAACCAAG CAACACTAGT TAACACCAAT601 CCACCATGAA GACCTTCCTC GTCTTTGCCC TCCTCGCCGT TGCGGCGACA651 AGTGCAATTG CGCAGATGGA GACTAGATGC ATCCCTGGTT TGGAGAGACC701 ATGGCAGCAG CAACCATTAC CACCACAACA GACATTTCCA CAACAACCAC751 TATTTTCACA ACAACAACAA CTATTTCCTC AACAACCATC ATTTTCGCAG801 CAACAACCAC CATTTTGGCA GCAACAACCA CCATTTTCTC AGCAACAACC
851 AATTCTACCA CAGCAACCAC CATTTTCGCA GCAACAACAA CTAGTTCTAC901 CGCAACAACC ACCATTTTCA CAGCAACAAC AACCAGTTTT ACCTCCACAA951 CAATCACCTT TTCCACAACA ACAACAACAC CAACAGCTGG TGCAACAACA1001 AATCCCTGTT GTTCAGCCAT CCATTTTGCA GCAGCTAAAC CCATGCAAGC1051 TATTCCTCCA GCAGCAGTGC AGCCCTGTGG CAATGCCACA ACGTCTTGCT1101 AGGTCGCAAA TGTTGCAGCA GAGCTGTTGC CATGTGATGC AACAACAATG1151 TTGCCAGCAG TTGCCGCAAA TCCCCCAGCA ATCCCGCTAT GAGGCAATCC1201 GTGCTATCAT CTACTCCATC ATCCTGCAAG AACAACAACA GGTTCAGGGT1251 TCCATCCAAT CTCAGCAGCA GCAACCCCAA CAGTTGGGCC AATGTGTTTC1301 CCAACCCCAA CAACAGTCGC AGCAGCAACT CGGGCAACAA CCTCAACAAC1351 AACAATTGGC ACAGGGTACC TTTTTGCAGC CACACCAGAT AGCTCAGCTT1401 GAGGTGATGA CTTCCATTGC GCTCCGTATC CTGCCAACGA TGTGCAGTGT1451 TAATGTGCCG TTGTACAGAA CCACCACTAG TGTGCCATTC GACGTTGGCA1501 CCGGAGTTGG TGCCTACTGA TAAGGAAAGA TCTCTAGTAA TATATAATTG1551 GGTCACCGTT GTTTAGTCGA TGGATATGTC GATGCAGCGG TGAC2.应用方法上述基因及其胚乳特异表达启动子的核酸序列，可以通过以下途径应用1)通过基因枪、农杆菌介导、花粉管通道等本领域工作人员共知的方法导入小麦，培育出加工品质优良的小麦品种和小麦种质；2)根据该基因核酸序列可以建立简捷的特异PCR标记体系，并通过该标记体系进行定向育种，获得加工品质优良的小麦新品种或新种质；3)根据基因核酸序列可以构建其酵母表达载体，通过本领域共知的研究方法将其导入酵母，然后通过在面粉中添加该转基因酵母提高面筋弹性。
4)根据该基因的胚乳特异表达启动子的核酸序列构建种子胚乳特异表达载体，通过本领域共知的研究方法将外源目的基因导入小麦，培育出加工品质优良的小麦品种和小麦种质。
本发明位点特异PCR引物设计对所有已知LMW-GS基因按Glu-3位点分类，再对每类进行序列同源性比对，根据特定区域的保守序列设计出Glu-D3位点特异的LMW-GS基因PCR引物，序列如下Primer 1 5’TTGTAGAAACTGCCATCCTT 3’Primer 2 5’GTCACCGCTGCATCGACATA 3’基因的扩增CTAB法提取小麦基因组DNA，利用下述条件扩增目的基因小麦LMW-GS基因稳定的PCR反应体系为反应体积为20μl，Mg2+浓度为2.5mmol/L，dNTP浓度为200umol/L，模板DNA量为30-60ng，每种引物含量为50ng，Taq酶0.5U；PCR反应条件为95℃预变性1min；循环反应为94℃ 1min，62℃ 1min，72℃，2min，30循环后，再72℃延伸7min。
基因克隆将扩增产物通过pGEM-T easy载体进行直接克隆，并通过菌落PCR和质粒酶切验证克隆产物是否正确。
序列分析序列分析通过ABI370测序仪完成。得到上述基因核酸序列。
权利要求
1.一种小麦低分子量麦谷蛋白亚基基因及其胚乳特异表达启动子的连续核酸序列，其特征在于该基因及其启动子序列为1 TTGTAGAAAC TGCCATCCTT TACATGTAAA GCGGATTCGA TGAGTCATGT51 CATGCTCTAT AGACGTCAGT TTATCTTATC ATCTTACAGG AAAGTACAAA101GTTAGTTTTC TGAAAAGCAA CCGAATATAG AAGAACACTC CACACTCAAG151GCTTTACTAA TCGAGCATAT CCTAACAGCC CACACATGAT TGCAAACTTA201GTCATACACA AGTTTTGCCT TTCTTGTTTA CGGCTGACAG CCTATACAAG251GTTCCAAACT CGGTTGTAAA AGTGATACTA TCTTGATAAG TGTGTGACAT301GTAAAGTTAA TAAGGTGAGT CATATATAGC AAATATCGGG GTTTCTGTAC351TTTGTGTGTG ATCGTATGCA CAACTAAAAA TCAACTTTGA TGATCAATAT401ATCCAAAAGT ACGCTTGTAG CTAGTGCAAA CCTAACACAA TGTAACAAAA451TAATTCATTT CAGATGGAGC CAAACAGAAT TATTAAAGCT GATGCAAAGA501AGGAAAAGAG GTGGTTCCTG GGCTACTATA AATAGGCATG AAGTATAAAG551ATCATCACAA GCACAAGCAT CAGAACCAAG CAACACTAGT TAACACCAAT601CCACCATGAA GACCTTCCTC GTCTTTGCCC TCCTCGCCGT TGCGGCGACA651AGTGCAATTG CGCAGATGGA GACTAGATGC ATCCCTGGTT TGGAGAGACC701ATGGCAGCAG CAACCATTAC CACCACAACA GACATTTCCA CAACAACCAC751TATTTTCACA ACAACAACAA CTATTTCCTC AACAACCATC ATTTTCGCAG801CAACAACCAC CATTTTGGCA GCAACAACCA CCATTTTCTC AGCAACAACC851AATTCTACCA CAGCAACCAC CATTTTCGCA GCAACAACAA CTAGTTCTAC901CGCAACAACC ACCATTTTCA CAGCAACAAC AACCAGTTTT ACCTCCACAA951CAATCACCTT TTCCACAACA ACAACAACAC CAACAGCTGG TGCAACAACA1001 AATCCCTGTT GTTCAGCCAT CCATTTTGCA GCAGCTAAAC CCATGCAAGC1051 TATTCCTCCA GCAGCAGTGC AGCCCTGTGG CAATGCCACA ACGTCTTGCT1101 AGGTCGCAAA TGTTGCAGCA GAGCTGTTGC CATGTGATGC AACAACAATG1151 TTGCCAGCAG TTGCCGCAAA TCCCCCAGCA ATCCCGCTAT GAGGCAATCC1201 GTGCTATCAT CTACTCCATC ATCCTGCAAG AACAACAACA GGTTCAGGGT1251 TCCATCCAAT CTCAGCAGCA GCAACCCCAA CAGTTGGGCC AATGTGTTTC1301 CCAACCCCAA CAACAGTCGC AGCAGCAACT CGGGCAACAA CCTCAACAAC1351 AACAATTGGC ACAGGGTACC TTTTTGCAGC CACACCAGAT AGCTCAGCTT1401 GAGGTGATGA CTTCCATTGC GCTCCGTATC CTGCCAACGA TGTGCAGTGT1451 TAATGTGCCG TTGTACAGAA CCACCACTAG TGTGCCATTC GACGTTGGCA1501 CCGGAGTTGG TGCCTACTGA TAAGGAAAGA TCTCTAGTAA TATATAATTGGGTCACCGTT GTTTAGTCGA TGGATATGTC GATGCAGCGG TGAC
2.根据权利要求1所述的一种小麦低分子量麦谷蛋白亚基基因及其胚乳特异表达启动子的连续核酸序列，其特征在于所述胚乳特异表达启动子(XYGluD3-LMWGS1)的PCR方式克隆时的引物序列为5’TTGTAGAAACTGCCATCCTT 3’5’GTCACCGCTGCATCGACATA 3’
3.一种小麦低分子量麦谷蛋白亚基基因及其胚乳特异表达启动子的连续核酸序列的应用，其特征在于通过基因枪、农杆菌介导、花粉管通道等方法导入小麦，培育出加工品质优良的小麦品种和小麦种质。
4.一种小麦低分子量麦谷蛋白亚基基因及其胚乳特异表达启动子的连续核酸序列的应用，其特征在于根据基因的胚乳特异表达启动子的核酸序列构建种子胚乳特异表达载体，将外源目的基因导入小麦，培育出加工品质优良的小麦品种和小麦种质。
全文摘要
本发明涉及一种小麦低分子量麦谷蛋白亚基基因及其胚乳特异表达启动子的连续核酸序列及其应用，本发明以我国优质小麦品种小偃6号为材料，提供一种小麦低分子量麦谷蛋白亚基基因及其胚乳特异表达启动子的核酸序列及其应用，首次从小偃6号中克隆了Glu－D3位点的一种LMW－GS基因(XYGluD3－LMWGS1)；并开展了基于该基因的分子标记和转基因研究，以培育出新的优质种质或品种。
文档编号C12N15/11GK1683531SQ20031012223
公开日2005年10月19日 申请日期2003年12月30日 优先权日2003年12月30日
发明者赵惠贤, 范三红, 徐虹, 胡胜武, 郭蔼光 申请人:西北农林科技大学