专利名称：改善纤维素转化过程产率的方法
改善纤维素转化过程产率的方法
1. 由联邦政府资助研究开发的发明权利声明
本工作部分由美国能源部基本合同号DE-AC36-99GO 10337下的国家 可再生能源实验室分包合同号ZCO-0-30017-01的合同提供资金。因此， 美国政府可拥有本申请的某些权利。
2. 相关申请的交叉引用
本申请要求于2006年11月13日提交的、美国临时申请系列号 60/858,579、题为"改善纤维素转化过程产率的方法(Mehtod for Improving Yield of Cellulose Conversion Process )"的临时申请的优先权，其全部内容 在此通过引用并入本文。
3. 发明领域
本发明涉及改善纤维素物质的除化转化中期望的糖的产率的方法。
4.
背景技术：
由纤维素物质生产糖，以及其后的发酵和将这些糖蒸馏进入乙醇中的 技术在一段时间前即为已知。其较早的J^A主要出现在二次世界大战期间， 当时燃料对于德国、日本和苏联这样的国家非常珍贵。早期的方法主要集 中在酸水解上，但其工程和设计相当复杂，且对于过程变量如温度、压力 和酸浓度上小的变化非常敏感。"Production of Sugars From Wood Using High-Pressure Hydrogen Chloride", Biotechnology and Bioengineering, 巻XXV， 2757-2773(1983)中对这些早期方法有广泛讨论。
二次世界大战到1970年代早期，石油的丰富供应减緩了对乙醇转化的
4研究。然而，由于1973的石油危机，研究者更多地致力于研发用木材和农 业副产品生产乙醇作为替代能源的方法。此研究对于将乙醇发展为汽油添 加物以减轻美国对于外国石油生产的依赖、提高燃料的辛烷值、降低作为 环境标准的排气污染物尤为重要。
随着当前所知的"石油危机"，美国环境保护局(the Environmental Proctection Agency of the United States )7>布了必须减少铅添加物的条例， 以减少空气污染。在乙醇实质上可以取代铅的情况下， 一些精炼厂选择了 乙醇作为代用品，特别是它可以轻易地引入精炼厂的操作中，而无须昂贵 的资本设备^。
除了改善几十年前研发的高压高温的气体糖化作用方法之外，当前的 研究主要集中在酶促转化过程。这些方法使用来自多种生物、可将纤维素 降解为可发酵的糖的酶，这样的生物如嗜中温和嗜热真菌、酵母和细菌。 对于这些方法和其扩大至商业化的能力以及乙醇生产的低效率，都仍存在 不确定性。
纤维素和半纤维素是由光合作用产生的最丰富的植物材料。其可以被 许多微生物降解而用作能量来源，这样的微生物包括细菌、酵母和真菌， 它们产生的胞外酶能够将聚合底物水解为单体糖(Aro等人，2001)。生物体 对于使用哪些糖通常是有限制的，这决定了在转化过程中最好生产哪些糖。 随着对不可再生资源的限制的邻近，纤维素成为主要的可再生能源的潜力 是巨大的(Krishna等人，2001)。通过生物学方法有效利用纤维素是克服食 物、饲料和燃料短缺的的一个途径(Ohmiya等人，1997)。
纤维素酶是水解纤维素(P-l，4-葡聚糖或p D-糖苷键)使之形成葡萄糖、 纤维二糖、纤维寡糖等的酶。纤维素酶惯例上分为三个主要类别内切葡 聚糖酶(EC 3.2.1.4)("EG")、外切葡聚糖酶或称纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.91)("CBH")和p-葡糖苷酶([(5-D-葡糖苷葡糖水解酶([PI-D-glucoside glucohydrolase) ; EC 3.2.1.21)("BG")。 (Knowles等人，1987和Shulein， 1988)。内切葡聚糖酶主要作用于纤维素纤维的非结晶部分，而纤维二糖水 解酶还可以降解晶态纤维素。在处理机械纸浆(Pere等人，1996)、用作饲料添加物(WO 91/04673) 和在谷物湿磨中，纤维素酶也已被证实可用于将纤维素生物质降解为乙醇 (其中纤维素酶将纤维素降解为葡萄糖，酵母或其它微生物再将葡萄糖发酵 为乙醇)。单独糖化和发酵为这样的过程，其中生物质例如玉米秸秆中的纤 维素转化为葡萄糖，然后酵母菌林将葡萄糖转化为乙醇。同时糖化和发酵 为这样的过程，其中生物质例如玉米秸秆中的纤维素转化为葡萄糖，同时 在同一反应器中，酵母菌林将葡萄糖转化为乙醇。由轻易可得的纤维素来 源所生产的乙醇提供了稳定、可更新的燃料来源。
已知有许多细菌、酵母和真菌产生纤维素酶。某些真菌产生能够降解 结晶形式纤维素的完整纤维素酶系(即完整纤维素酶)。为了将晶态纤维素
有效地转化为葡萄糖，需要完整纤维素酶系包含各来自CBH、 EG和BG 类别的成分，还包含对于水解晶态纤维素作用较少的单独的成分(Filho等 人，1996)。特别地，EG型纤维素酶和CBH型纤维素酶的组合相互作用， 比单独使用任一种酶能更有效地降解纤维素(Wood， 1985; Baker等人， 1994;及Nieves等人，1995)。
此外，本领域已知纤维素酶可用于处理纺织品以提高洗涤剂組合物的 清洁能力，用作软化剂，用于改善棉织物的触感和外观等(Kumar等人， 1997)。对于清洁性能提高的(美国专利号4,435,307;英国申请号2，095，275 和2，094，826)和用于处理织物改善纺织品触感和外观的含纤维素酶的洗涤 剂组合物(美国专利号5,648,263、 5,691,178和5,776,757，及英国申请号 1,358,599)已有所描述。
因此，真菌和细菌中产生的纤维素酶受到了重大关注。特别地，已证 实木霉属物种(7Wc^^fer附"5/7/7.)(例如长枝木霉(7>/c/^ /erw" /o"g/6rflc/r/a似附)或里氏木審(7Wc/ro^/e/7wa/res^))的发酵产生能够降解 结晶形式纤维素的完整纤维素酶系。多年来，木霉属纤维素酶的生产已通 过经典诱变、筛选、选择和高度改进的、大规模廉价发酵条件的t艮得到 了改进。木霉属物种的多成分纤维素酶系能将纤维素水解为葡萄糖，还有 来自其它微生物，特别是细菌菌林的具有不同性质、用于有效水解纤维素的纤维素酶，并且在丝状真菌中表达这些蛋白质用于工业规才莫的纤维素酶 生产将十分有利。然而，许多研究结果表明丝状真菌中细菌酶的产率低
(Jeeves等人，1991)。
可溶性糖，如葡萄糖和纤维二糖，在工业中对于生产化学产品和生物 产品有许多用途。纤维素水解的优化使得可以使用更少量的酶，提高生产 可溶性糖的成本效益。尽管研发了许多方法，本领域中仍需改善由纤维素 物质获得的可溶性糖的产率。
5.发明简述
本发明提供了通过在处于或约为纤维素酶的热变性温度的温度下，将 纤维素底物或预处理的纤维素底物与纤维素酶进^"孵育，提高由纤维素起 始材料的S^糖化作用得到的可溶性糖的产率的方法。本发明还提供了通 过在处于或约为纤维素酶的热变性温度的温度下，将纤维素底物或预处理 的纤维素底物与纤维素酶进行孵育，提高由纤维素起始材料的酶促糖化作 用得到的葡萄糖产率的方法。
本发明还提供了将纤维素物质转化为葡萄糖的方法，其通过组合纤维 素物质与纤维素酶，将纤维素物质和纤维素酶的组合在高于约38'C的温度 进行孵育，以引起水解反应，将至少20%所述纤维素物质转化为可溶性糖， 其中葡萄糖的組分相对于可溶性糖至少为0.75。本发明还提供了将纤维素 物质转化为纤维二糖的方法，其通过组合纤维素物质与包含内切葡聚糖酶 1的酶混合物，孵育纤维素物质和纤维素酶的组合以引起水解反应，将达 50%的纤维素物质转化为可溶性糖，其中葡萄糖的组分相对于所述可溶性 糖少于约0.5。
纤维素酶可以是由^:生物产生的完整纤维素酶、纤维素酶混合物或其 组合，所述微生物来自曲霉属(爿^7Cgl7/MS)、木霉属、镰孢属(Fwsfln'"附入 金小抱子属(Orr>ws/70/77iw )、青霉属(尸《"/"'//,7/附)、腐质霉属(好"附/a /")、 脉孢菌属(7VeMrw/wm)、或其可选的有性型如棵孢壳属(￡>wen'ce//")和 肉座菌属(fl>/wcTeff)(见Kuhls等人，1996)。优选地，可以使用物种如 解纤维热酸菌(爿"Wo,/rer附"s ce〃M/o/j;&CMS )、嗜热方文线菌(77rc附o6,y f/fl/"sca)、灰腐质霉(好M附/a /fl gr/Mtt )或里氏木霉。 本文提供了本发明的这些特点和其它特点。 6.附图简述技术人员会理解附图目的仅为举例说明，而非旨在以任何方式限制本 发明的范围。
图1A-B显示用3.3 mg/g来自it^达P-葡糖苷酶的里氏木霉的完整纤 维素酶，在38C(空心标志)和53'C(实心标志)下，稀酸处理的玉米秸秆向 可溶性糖的转化。图2A-B显示用12 mg/g来自it^达p-葡糖苷酶的里氏木霉的完整纤维素酶，在M。c(空心标志)和syc(实心标志)下，稀酸处理的玉米秸秆向可溶性糖的转化。图3A-B显示用18 mg/g来自过表达p-葡糖苦酶l的里氏木霉的完整 纤维素酶，在38。C(空心标志)和53X:(实心标志)下，稀酸处理的玉米秸秆 向可溶性糖的转化。图4A-B显示用20 mg/g来自it^达p-葡糖苷酶的里氏木霉的完整纤维素酶，在3s。c(空心标志)和s;rc(实心标志)下，稀酸处理的玉米秸秆向可溶性糖的转化。图5A-B显示用20 mg/g来自it^达p-葡糖苷酶的里氏木霉的完整纤 维素酶，在38匸(空心标志)和53匸(实心标志)下，稀酸处理的玉米秸秆向 可溶性糖的转化。图6A-B显示用12mg/g来自里氏木霉的完整纤维素酶，在38。C(空心 标志)和53。C(实心标志)下，稀酸处理的玉米秸秆向可溶性糖的转化。图7A-B显示用12mg/g来自表达CBHl-El融合蛋白的里氏木霉的完 整纤维素酶，在WC(空心标志)和53。C(实心标志)下，稀酸处理的玉米秸 秆向可溶性糖的转化。图8A-B显示用15 mg/g的EG1和里氏木霉CBH1的酶混合物(方形) 或El和灰腐质霉CBH1的酶混合物(圆形)，在MX:(空心标志)和6S。C(实 心标志)下，稀酸处理的玉米秸秆向可溶性糖的转化。图9A-B显示用15 mg/g的EG1、里氏木霉CBH1和里氏木霉CBH2 的酶混合物(方形)或El、灰腐质霉CBH1和里氏木霉CBH2的酶混合物(圆 形)，在WC(空心标志)和65。C(实心标志)下，稀酸处理的玉米秸秆向可溶 性糖的转化。图10A-B显示用15 mg/g的EG1、里氏木霉CBH1的酶混合物(方形) 和褐色高温单孢菌(r./附c") E3或E1、灰腐质霉CBH1和褐色高温单孢 菌E3的酶混合物(圆形)，在38'C(空心标志)和6S'C(实心标志)下，稀酸处 理的玉米秸秆向可溶性糖的转化。图11A-F显示用里氏木霉菌林，在syC(实心标志)和外。C(空心标志)， 稀酸处理的玉米秸秆向可溶性糖的转化。图12A-F用来自表达CBH1-E1融合蛋白的里氏木霉的完整纤维素酶， 在s;rc(实心标志)和外。C(空心标志)下，稀酸处理的玉米秸秆向可溶性糖 的转化。7.不同实施方案的详细说明除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语含义与本发明所属领 域普通技术人员所通常理解的相同。Singleton等人，DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY,第2版，John Wiley 和Sons, New York (1994)，和Hale & Marham， THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, N. Y. (1991)为技术人 员提供了本发明中使用的许多术语的普通词典。尽管在实施或检验本发明 时可以使用与本文所描述的相似或等同的任何方法或材料，仍在此描述优 选的方法或材料。数值范围包括定义范围的数值。应理解本发明不限于所 描述的具体方法、方案和试剂，因为这些可以有所变化。本文提供的标题不限制本发明的不同方面或实施方案，它们以参照整 个说明书为准。因此，紧接着在下文中定义的术语将通过参照整个说明书 而被更完整的定义。术语"纤维素酶"指能够将纤维素(P-l，4-葡聚糖或p D-糖苷键)聚合物水9解成更短的纤维，寡聚物、纤维二糖和/或葡萄糖的一类酶。术语"外切纤维二糖水解酶"(CBH)指一组分类为EC 3.2.1.91的纤维素 酶。这些酶也称为外切葡聚糖酶或纤维二糖水解酶。CBH酶从纤维素的还 原端或非还原端水解纤维二糖。 一般而言，CBHI型酶优先从纤维素的还 原端水解纤维二糖，而CBHII型酶优先水解纤维素的非还原端。术语"纤维二糖水解酶活性"在此定义为1，4-D-葡聚糖纤维二糖水解酶 (E.C. 3.2.1.91)活性，其催化纤维素、纤维四糖(cellotetriose )或任何含卩-1,4 连接的葡萄糖的聚合物之中1,4-p-D-糖苷键的水解，从链端释放纤维二糖。 为本发明的目的，纤维二糖水解酶活性通过水溶性还原糖从纤维素的释放 来确定，这是通过Lever等人，1972， Anal. Biochem. 47:273-279的PHBAH 方法所测量的。纤维二糖水解酶攻击的外切葡聚糖酶才莫式和攻击的内切葡 聚糖酶模式，可以通过相似的、对从取代的纤维素(如羧曱基纤维素或羟乙 基纤维素)中释放的还原糖的测量进行区别(Ghose， 1987， Pure & Appl. Chem. 59: 257-268)。真正的纤维二糖水解酶对非取代的纤维素的活性， 相对于其对取代的纤维素的活性，活性之比会非常高(Bailey等人，1993， Biotechnol. Appl. Biochem. 17: 65-76).术语"内切葡聚糖酶"(EG)指一组分类为EC 3.2.1.4的纤维素酶。EG 酶水解纤维素内部的(3-1，4糖苷键。本文将术语"内切葡聚糖酶"定义为内 切1，4-(l，3;l，4)-j3-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(endo-l，4画(l，3;l，4)-p-D-glucan 4-glucanohydrolase ) (E.C. No. 3.2.1.4)，其催化内切水解纤维素中的 1，4-J5-D-糖苷键、纤维素衍生物(例如羧甲基纤维素)、地衣淀粉、混合的|5-1，3 葡聚糖如谷物p-D-葡聚糖或木糖葡聚糖中的p-l，4键、及其它含纤维素成 分的植物材料。为本发明的目的，内切葡聚糖酶活性可以根据Ghose， 1987， Pure and Appl. Chem. 59: 257-268的操作用羧甲基纤维素(CMC)水解测 定。术语"P-葡糖苷酶"在此被定义为p-D-葡糖苷葡糖水解酶(E.C. 3.2.1.21),其催化水解纤维二糖，释放P-D-葡萄糖。为本发明的目的，p-葡糖苷酶活性可以用本领域已知的方法，例如HPLC进行测定。"纤维素分解活性"包括外切葡聚糖酶活性、内切葡聚糖酶活性或此两 种类型的酶活性、以及P-葡糖苷酶活性。许多微生物产生水解纤维素的酶，包括细菌热酸菌属 (^"V/o/to附ws)、嗜热菌属(rto歸A^/")、 芽孢杆菌属(5fl"7/"s) 和纤维单胞菌属(CW/"/o附卵fls);链霉菌属(&"/7to/wj;cM);酵母如假 丝酵母属(CVm&V^ )、克鲁维酵母属(A7w"m 附j;c^ )、毕赤酵母属(尸/c&Vi )、 酵母属(S"ccA"AWWj;ce51)、 裂殖酵母属(5"c^o5^"/i"fY7附j;ce51)、或子囊 菌酵母属(yflirmv/")以及真菌支顶孢属(Jc/^/mmfVwi)、曲霉属、短梗 霉属(Jw"o6awVWii附)、金小孢子属、隐、球酵母属(Oj^tococois )、 /^7/6wVZ/w附、錄抱属、腐质霉属、稻温病菌属(M"grtfl/wf^Ag)、 毛霉属 (Afwo r)、毁丝霉属()、新丽鞭毛菌属(A^ c"/// i"s^c)、 脉孢菌属(A^wmy/wra)、拟青霉属(尸"e"7o/wj;c^)、青霉属、单鞭毛菌 属(尸/ro附ycey )、裂褶菌属(5"c/r/zo尸/^〃"附)、棵节菌属(ra/"/v 附^ces1)、 嗜热子嚢菌属(77^r附ofl^"s)、梭孢壳属、弯颈霉属 (7^[v/wc/ffrf/w附)或木霉属、或其可选的有性型如棵孢壳属和肉座菌属(见 Kuhls等人，1996)。"非天然存在的，，组合物包括通过以下方式产生的组合物(l)以天然存 在的比例或非天然存在、即改变的比例组合成分纤维素分解酶;或(2)修饰生 物以过表达或低表达(underexpress) —种或多种纤维素分解酶;或(3)修 饰生物使其缺失至少一种纤维素分解酶或(4)修饰生物以表达异源成分纤 维素分解酶。成分纤维素分解酶可以在组合形成非天然存在的组合物之前 作为分离的多肽^:供。某种程度上，我们发现提高糖化温度能提高来自纤维素物质的葡萄糖 产率，并且还使纤维素的总转化得到改善，从而在更高的孵育温度下增加 转化产物中的葡萄糖组分。本发明提供了通过在处于或约为纤维素酶的热变性温度的温度下，将 纤维素底物或预处理的纤维素底物与纤维素酶进^f亍孵育，提高由纤维素起 始材料的S^糖化得到的可溶性糖的产率的方法。本发明还提供了通过在处于或约为纤维素酶的热变性温度的温度下，将纤维素底物或预处理的纤 维素底物与纤维素酶进行孵育，提高由纤维素起始材料的酶促糖化得到的 葡萄糖产率的方法。在本7>开文件的方法中，纤维素物质可以是任何含纤维素的物质。纤 维素物质可以包括但不限于纤维素、半纤维素和木质素纤维素物质。在一 些实施方案中，纤维素物质包括但不限于生物质、草本材料、农业废物、林业废物、城市固体废物、废纸、及纸浆和纸残渣(paper residue)。在 一些实施方案中，纤维素物质包括木材、木浆、造纸於渣、纸浆废物流、 刨花板、玉米秸秆、玉米纤维、稻、纸和纸浆加工废物、木本或草本才直物、 果浆、菜浆、浮石、酒糟(distillers grain)、草、稻壳、甘蔗渣、棉、黄 麻、大麻、亚麻、竹、剑麻、蕉麻、稻草(straw)、玉米芯、酒糟、叶、 麦秸秆、椰子毛、藻类、柳枝稷及其混合物(见例如，Wiselogel等人，1995， Handbook on Bioethanol(Charles E.Wyman编)，105-118页，Taylor & Francis, Washington D.C; Wyman， 1994， Bioresource Technology 50: 3-16; Lynd, 1990， Applied Biochemistry and Biotechnology 24/25: 695-719; Mosier等人，1999， Recent Progress in Bioconversion of Ljgnocellulosics， in Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, T.Scheper主编， 巻65， 23-40页,Springer-Verlag， New York)。纤维素物质可以直接使用，或可以经过用本领域已知方法所进行的预 处理。这样的预处理包括化学、物理和生物学预处理。例如，物理预处理 技术可以包括而不限于各种类型的研磨、破碎、蒸热/蒸汽爆炸(steam explosion)，辐照和湿热(hydrothermolysis)。化学预处理技术可以包括 而不限于稀酸、碱、有机溶剂、氨、二氧化硫、二氧化碳、和控制pH的 湿热。生物学预处理技术可以包括而不限于使用能溶解木质素的微生物。 预处理可以发生几分钟到几小时，如从约1小时到约120。在一个实施方案中，可以通过升高温度和加入稀酸、浓酸或稀碱溶液 进4亍预处理。可以加入预处理溶液一定时间，所述时间足以使半纤维素成 分至少部分水解，然后中和。在一些实施方案中，预处理选自蒸汽爆炸、制浆、研磨、酸水解及其 组合。纤维素酶与纤维素物质的反应在约25。C、约30'C、约35L、约40。C、 约45。C、约50。C、约55。C、约60'C、约65。C、约70'C、约75X:、约80。c、约85。c、约9ox:、约95'c、约ioox:进行。在一些实施方案中，酶与底物在处于或约为纤维素酶的热变性温度下反应。pH范围可为从约pH 5、 约pH 5.5、约pH 6、约pH 6.5、约pH 7、约pH 7.5、约pH 8.0到约pH 8.5。 通常pH范围为从约pH 4.5到约pH 9。在这些条件下孵育纤维素酶导致从 纤维素物质中释》文或释出大量可溶性糖。大量指至少20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%、 95%或更多的可溶性糖为可获得的糖。纤维素酶处理可以发生几分钟到几小时，如从约0.1小时到约120小 时，优选约12小时到约72小时，更优选约24到48小时。纤维素酶的量是使用的酶和给定的反应时间和条件的函数。优选地， 纤维素酶用量的总量可为约2-40 mg/g纤维素物质。在本发明公开的方法中，纤维素酶可以是完整纤维素酶、补加了一种 或多种酶活性的完整纤维素酶、和纤维素酶混合物。在一些实施方案中， 纤维素酶可为完整纤维素酶制品。本文使用的用语"完整纤维素酶制品"指 含天然存在和非天然存在的纤维素酶的组合物。"天然存在的"组合物由天 然存在的来源产生，包含一种或多种纤维二糖水解酶类型、 一种或多种内 切葡聚糖酶类型和一种或多种P-葡糖苷酶成分，其中这些组分各自以由来 源产生的比例存在。天然存在的组合物是由就纤维素分解酶而言未被修饰 的生物所产生的，于是酶成分的比例为天然的生物所产生的、未改变的。一般而言，纤维素酶可以包括但不限于(i)内切葡聚糖酶(EG)或 1，4-(5-d-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶(EC 3.2.1.4)， (ii)外切葡聚糖酶，包括 1，^p-d-葡聚糖葡聚糖水解酶(也称为纤维糊精酶(cdlodextrinase ) )(EC 3.2丄74)和l，4-p-d-葡聚糖纤维二糖水解酶(外切纤维二糖水解酶，CBH)(EC 3.2.1.91)，及(iii)卩-葡糖苷酶(BG)或P-葡糖普葡糖水解酶(EC 3.2.1.21)。在本发明中，纤维素酶可以来自任何可用于水解纤维素物质的^:生物。13在一些实施方案中，纤维素酶为丝状真菌的完整纤维素酶。"丝状真菌"包括真菌门(Ew附j;cWa)和卵菌门(O0附j;co似)的所有丝状体。在一些实施方案中，纤维素酶为支顶孢属、曲霉属、棵孢壳属、镰孢 属、腐质霉属、毛霉属、毁丝霉属、脉孢菌属、小柱孢属(Sc^"/Www)、梭 孢壳属、弯颈霉属或木霉属物种的完整纤维素酶。在一些实施方案中，纤维素酶为棘孢曲霉(爿s/wg/〃"s "c"/e"^^)、 泡盛曲霉(y4s/7erg,7/"s1 "hwwC)、 臭曲霉(y45/wg,7/附/< ^/附)、日本曲霉(As/7Cg/〃M57'fl/ w.c"51 )、构巢曲霉(As/7W.〃W51 w/flf"/tfWS1 )、黑曲霉(/1s/;e/"g/〃w51 w/gc)或米曲霉(As/7erg/〃ws 的完整纤维素酶。另一方面，纤维素酵为軒抱状錄抱(尸WSa/7'M附6fl"/7V//0/flfes )、 尸"Stf/7'M/Wcemzfe、 弯钩錄抱(F"5w/m附cm A:w〃em^ )、 大刀錄抱(F"5w/w附 cw/附orw附)、禾本^H^抱(F附w'w附gm附/wea/"w附)、禾赤錄抱(F附fl"'M附 gm附/"w附)、异抱錄抱(F"5w/m附/r"ems/wm附)、合欢木錄抱(F"sa尸/w附 "egM"d/ )、 尖錄抱(F"s"/7'm附 a^5/ww附)、多枝錄抱(F附an'w附 rWcw/a似附)、粉红錄抱(F"sfl"Vi附rasew附)、接骨木錄抱(F"5W"/w附 sa附6wc/關附)、狀色嫌抱(Fwsa由附samK^ M附)、拟分枝抱嫌抱(F"5yiWw附s/w尸W/7'c/r/wV/es1)、 疏色嫌刀菌(F"5w/m附sm一wew附)、 Fw5^/m附/0尸wAwm附、类拟丝抱嫌刀菌(Fw5w/"附加'c/ro幼e"》,Wes)或嫌抱 霉(fVwfl/77mi vewemi似附)的完整纤维素酶。另一方面，纤维素酶为特异 腐质霉(//w附/co/" //tso/ertsO 、 柔毛腐质霉(J7m附/co/" /"flWgf'"os")、 米 黑毛霉(Afwcw /w/e/^/)、嗜热毁丝霉(A(vce//o/ /^/^m ,/^,附0/^//")、 粗糙脉孢菌(iVew仍/w )、嗜热小柱孢菌(Sc^fl/fV//"/m幼e簡op緒M附)或太瑞斯梭抱壳霉(r^/"v/ate"e欲/s )的完整纤维素酵。 另一方面，纤维素酶为哈茨木霉(7Wc/^&r/M Aarz/朋MW)、康宁木霉(7Wc/iofife/7mi Z^/i/"g//)、长枝木霉、里氏木霉例如RL-P37(Sheir-Neiss 等人，Appl. Microbiol. Biotechnology, 20 (1984) 46-53页；Montenecourt B.S.， Can.， 1-20， 1987)， QM9414 (ATCC No. 26921)， NRRL 15709, ATCC 13631， 56764, 56466， 56767，或绿色木霉(Trichoderma viride)例如ATCC 32098和32086的完整纤维素酶。在一些实施方案中，纤维素酶为里氏木霉RutC30完整纤维素酶，可 以作为里氏木霉ATCC 56765从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection )获得。在本公开文本中，纤维素酶可以来自任何本领域已知、致使表达能够 水解纤维素物质的酶的微生物培养方法。发酵可以包括摇瓶培养、小规^莫 或大^Mt发酵，如连续发酵、批发酵、补料分批发酵或固态发酵，它们在 实验室或工业发酵罐中在适当培养基中在允许纤维素酶表达或分离的^H牛 下进行。微生物通常在适合生产能够水解纤维素物质的酶的细胞培养基中培 养。在包含碳和氮来源和无机盐的适当营养培养基中，用本领域已知的规 程进行培养。适当培养基、温度范围和其它适合生长和纤维素酶生产的条 件为本领域已知。作为非限制性例子，用里氏木霉生产纤维素酶的正常温 度范围为24'C到28°C。某些真菌产生的完整纤维素酶系包括外切纤维二糖水解酶或CBH型 纤维素酶、内切葡聚糖酶或EG型纤维素酶和P-葡糖苷酶或BG型纤维素 酶(Schulein， 1988)。然而，有时这些系统缺乏CBH型纤维素酶，例如细 菌纤维素酶也通常只有很少或没有CBH型纤维素酶。此外，已证实EG成 分和CBH成分协同相互作用，更有效地降解纤维素。见例如Wood, 1985.。 多成分或完整纤维素酶系中的不同成分，即多种内切葡聚糖酶和外切纤维 二糖水解酶，通常具有不同性质，如等电点、分子量、糖基化程度、底物 特异性和i^作用模式。在一些实施方案中，使用的纤维素酶通过发酵生产，没有经过或只经 过最少的回收和/或纯化。例如， 一旦细胞将纤维素酶分泌到细胞培养基中， 即可以使用含纤维素酶的细胞培养基。在一些实施方案中，完整纤维素酶 制品包含发酵物质的未分级成分，包括细胞培养基、细胞外酶和细胞。可 选地，完整纤维素酶制品可以用任何方^^的方法进行处理，例如沉淀、离 心、亲和性、过滤或本领域已知的任何其它方法。在一些实施方案中，完整纤维素酶制品可以例如被浓缩，然后使用，而不经进一步纯化。在一些 实施方案中，完整纤维素酶制品包含降低细胞存活或杀死细胞的化学剂。 在一些实施方案中，用本领域已知的方法裂解细胞或进行透化。含有增加的量的纤维二糖水解酶和/或P-葡糖苷酶的纤维素酶对于乙 醇生产有用。由此过程得到的乙醇可以再用作辛烷增强剂或直接用作燃料 替代汽油，由于乙醇作为燃料来源比石油衍生的产品对于环境更为友好， 这是有利的。已知使用乙醇会改善空气质量，还可能降低局部臭氧水平和 烟雾。而且，用乙醇代替汽油可对于緩和不可再生能量和石化产品供给的 突发性变化所带来的影响有战略重要性。乙醇可以由纤维素生物质如树、草本植物、城市固体废物及农业和林 业废物通过糖化和发酵过程产生。然而，由微生物产生的天然存在的纤维 素酶混合物中，各个纤维素酶的比例可能无法最有效地将生物质中的纤维 素快速转化为葡萄糖。已知内切葡聚糖酶作用产生新的纤维素链端，其本 身即为纤维二糖水解酶作用的底物，从而提高了整个纤维素酶系的水解效 率。因此，使用增加或优化的纤维二糖水解酶活性可能大大增强乙醇的生 产。乙醇可以通过生物质的降&降解和将释;^文的糖类转化为乙醇而产生。 此种乙醇常常称为生物乙醇或生物燃料。它可以在混合物中被用作燃料添 加剂或增充剂，从少于1%至达100%(燃料代用品)。增强的纤维素转化可以通过在更高的温度^f吏用CBH多肽实现，所述 CBH多肽在例如下列美国专利公开US20050054039、 US20050037459、 US20060205042、 US20050048619A1和US20060218671中的任一篇中均有 所描述。过表达P-葡糖苷酶的方法为本领域已知。见例如US 6,022,725。 也见例如US20050214920。在一些实施方案中，纤维素酶为外切纤维二糖水解酶融合蛋白，适当 的例子包括CBH1和解纤维热酸菌内切葡聚糖酶或嗜热放线菌内切葡聚糖 酶，CBH1和解纤维热酸菌内切葡聚糖酶和特别是解纤维热酸菌El或 GH74内切葡聚糖酶(见例如美国专利7>开号20060057672)。在一些实施方案中，纤维素酶混合物包含的纤维素酶选自里氏木霉内切葡聚糖酶l(EGl)、里氏木霉纤维二糖水解酶l(CBHl)和里氏木霉纤维二 糖水解酶2(CBH2)、灰腐质霉纤维二糖水解酶l(CBHl)和解纤维热酸菌内 切葡聚糖酶E1(E1)、褐色高温单孢菌(77^"附0附0"os/7em/附ai) E3外切 纤维素酶及其组合。本发明公开的方法可以用于生产单糖、二糖和多糖作为化学品、微生 物的发酵原料，和作为生产蛋白质、有机产品、化学品和燃料、塑料及其 它产品或中间体的诱导物。特别地，处理废物(干酒糟、酿酒的废酒糟、甘蔗渣等)的价值可以通过部分或完全溶解纤维素或半纤维素得以增加。除了 乙醇，可以由纤维素和半纤维素产生的一些化学品包括丙酮、乙酸盐(酯)、 甘氨酸、赖氨酸、有机酸(例如乳酸)、1，3-丙二醇、丁二醇、甘油、乙二醇、 糠醛、聚羟基链烷酸酯(盐)、顺式、顺式-粘康酸、动物饲料和^4t。本发明还提供将纤维素物质转化为葡萄糖的方法，其包括组合纤维素 物质与纤维素酶，孵育所述纤维素物质和纤维素酶的组合，引起水解反应， 将纤维素物质转化为可溶性糖，其中所述可溶性糖包含葡萄糖和纤维二糖， 葡萄糖的组分相对于所述可溶性糖至少为0.75。本发明还提供将纤维素物质转化为纤维二糖的方法，其包括组合纤维 素物质与包含内切葡聚糖酶l的纤维素酶混合物。在一些实施方案中，内 切葡聚糖酶1可以包含解纤维热酸菌El内切葡聚糖酶，包括美国专利号 5,536,655和6,013,860,及专利申请
发明者B·凯莱门, C·米奇森, E·A·拉雷纳斯 申请人:丹尼斯科美国公司