用于定向生物标志物信号放大的荧光方法和材料的制作方法

专利名称：用于定向生物标志物信号放大的荧光方法和材料的制作方法
交叉参考
本申请要求2006年10月6日申请的美国临时申请No.60/825,615的优先权，该临时申请在此引入作为参考。
背景技术：
荧光杂交探针已发展成为DNA和RNA的序列特异性检测的一种重要工具。由附加的荧光标记(或染料)产生的信号可被实时监测且能提供简单、快速和可靠的检测生物靶标和事件的方法。从微阵列和实时PCR到荧光原位杂交(FISH)中都可看到其应用的例子。
近期在多发色团研究领域中，尤其关于偶联的聚合物(CPs)的研究，已经突出显示了这些材料在显著改善此类方法的检测灵敏度方面的潜力(Liu and Bazan，Chem.Mater.，2004)。这些材料的集光结构可以制成水溶性的且适合放大多种探针标记的荧光输出量(参见2003年6月20日申请的美国专利申请No.10/600,286，以及Gaylord，Heeger，and Bazan，Proc.Natl.Acad.Sci.，2002，以上文件均在此完整引入作为参考)。
阳离子CPs尤其显示出对带相反电荷的核酸的强亲和性，保证了从光激发的聚合物(集光供体)到荧光标记的探针/靶标对的能量传递所需的距离。与直接激发的单独染料相比，光输出量可以增加75倍(Liu andBazan，J.Am.Chem.Soc.，2005)。信号放大无论对同源还是异源检测形式都会增加很多优势。
这些结果显示CPs在核酸诊断领域中很有应用前景，在样品量十分少时尤其如此。但是，已经有扩增(或复制)核酸靶标的方法存在，即PCR。相比之下，在蛋白质识别领域中并不存在扩增靶标物质的这样的简单方法。因此，CP应用导致的信号增强在本领域中具有重要意义。
染料标记的抗体在诸如免疫组化、蛋白质阵列、ELISA试验和流式细胞分析等应用中常规用于检测蛋白质靶标。将CP材料整合到这些方法学中可使这些试验的性能具有显著的提升，可达到原先常规染料无法达到的检测水平。


发明内容
一般来讲，在一个方面，一种测定方法包括提供被怀疑含有靶标生物分子的样本，提供与信号产生发色团偶联并且能够与靶标生物分子互相作用的传感器，提供偶联的聚合物，包括但并不局限于
其中该聚合物与传感器静电相互作用，并且在激发时能够将能量传递至传感器信号发色团，在传感器可结合至靶标生物分子(如果存在)上的条件下将样本在溶液中与传感器和多发色团接触，向该样本施加能够激发多发色团的光源，以及检测是否从信号发色团上发出光来。
在一个实施方式中，R基团是磺酸基团。在另一个实施方式中，传感器是一种生物分子，例如蛋白质、核酸或抗体。
在另一个实施方式中，传感器可包括与多个信号发色团偶联的多个传感器，其中多个发色团中的至少两个在从多发色团能量传递时能发射不同波长的光。
一般来讲，在另一个方面，提供了一种多发色团复合物，其包含偶联到至少一种生物分子上的多发色团。生物分子可包括但并不局限于传感器生物分子、生物偶联物和靶标生物分子。复合物的多发色团更进一步地偶联至信号发色团上，且包括下述结构
其中CP1、CP2、CP3和CP4是任选地被取代的偶联的聚合物区段或寡聚结构，它们彼此相同或不同。在一个实施方式中，偶联的聚合物是阳离子偶联聚合物。在另一种实施方式中，偶联的聚合物是阴离子偶联聚合物。在一个更进一步的实施方式中，偶联的聚合物是电荷中性的偶联的聚合物。在一个实施方式中，CP1、CP2、CP3和CP4是芳香族重复单元，选自苯、萘、蒽、芴、噻吩、呋喃、吡啶和噁二唑，每个任选地被取代，并且其中CP3和CP4可含有一个或多个可通过连接体连接的独特生物偶联位点。
在一个替代的实施方式中，多发色团包括生物偶联位点，该生物偶联位点包括但并不局限于马来酰亚胺、硫醇、琥珀酰亚胺酯(NHS酯)、胺、叠氮化物化学、羧基/EDC(1-乙基-3-[3-二甲基氨丙基]碳二亚胺盐酸盐、磺基-SMCC(磺基琥珀酰亚胺基4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷-1-羧酸酯)、胺/BMPH(N-[β-马来酰亚胺基丙酸]酰肼·TFA)、以及磺基-SBED磺基琥珀酰亚胺基[2-6-(生物素酰氨基)-2-(对-叠氮基苯甲酰氨基)-己酰氨基]-乙基-1，3′-二硫代丙酸酯。
复合物的多发色团具有如下结构
其中R1是加溶基，包括但并不局限于乙二醇寡聚物、乙二醇聚合物、ω-烷氧基铵盐和ω-烷氧基磺酸盐等。
可替代地，在另一个实施方式中，复合物的多发色团具有如下结构
其中R1是加溶基，选自乙二醇寡聚物、乙二醇聚合物、ω-铵盐烷氧基和ω-磺酸盐烷氧基。在具体的实施方式中，该1和2可包括具有如下结构的a-g连接基团
*＝用于共价连接至不饱和骨架上的位点 另外，3可以是具有如下结构的h基团
L＝连接体 A＝生物偶联位点 *＝用于共价连接至不饱和骨架上的位点 在另一个实施方式中，复合物的多发色团可具有如下结构
其中R1是加溶基，包括但并不局限于乙二醇寡聚物、乙二醇聚合物、ω-铵盐烷氧基和ω-磺酸盐烷氧基。
在另一个实施方式中，复合物的多发色团可具有如下结构
其中R1是加溶基，选自乙二醇寡聚物、乙二醇聚合物、ω-铵盐烷氧基和ω-磺酸盐烷氧基。
在另一个实施方式中，复合物的多发色团具有如下结构
其中R1是加溶基，包括乙二醇寡聚物、乙二醇聚合物、ω-铵盐烷氧基、和ω-磺酸盐烷氧基。
一般地，在另一个方面，提供了一种用于鉴定靶标生物分子的多发色团复合物，其包含多发色团、共价连接至该多发色团的传感器生物分子、共价连接至该多发色团的信号产生发色团，其中信号发色团能够接受在多发色团激发时来自多发色团的能量，并且传感器生物分子能够与靶标生物分子相互作用。在一个实施方式中，信号发色团和传感器生物分子都通过多个连接体共价连接至多发色团上。在一个替代实施方式中，信号发色团和传感器生物分子都通过三官能化连接体共价连接至多发色团上，该三官能化连接体共价连接多发色团、信号发色团和传感器生物分子。
在一个实施方式中，连接体具有连接化学部分，包括但并不局限于马来酰亚胺/硫醇、琥珀酰亚胺酯(NHS酯)/胺、叠氮化物化学部分、羧基/EDC(1-乙基-3-[3-二甲基氨丙基]碳二亚胺)盐酸盐/胺、胺/磺基-SMCC(磺基琥珀酰亚胺基4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷-1-羧酸酯)/硫醇、胺/BMPH(N-[β-马来酰亚胺基丙酸]酰肼·TFA)/硫醇。在一个特定的实施方式中，该多发色团是偶联的聚合物，例如聚阳离子偶联的聚合物。
一般地，在另一个方面，提供了一种测定方法，包括以下步骤提供怀疑含有靶标生物分子的样本；提供包含多发色团、共价连接的信号发色团和共价连接的传感器生物分子的多发色团复合物，其中信号发色团能够在多发色团激发后接受来自多发色团的能量，并且传感器生物分子能够与靶标生物分子相互作用；在传感器生物分子可结合至靶标生物分子(如果存在)的条件下，将样本在溶液中与多发色团复合物接触；向样本施加能够激发发色团的光源，以及检测是否从信号发色团上发出光来。在一个具体的实施方式中，多发色团是偶联的聚合物，例如聚阳离子偶联的聚合物。
一般地，在另一个方面，提供了一种测定方法，包括以下步骤提供怀疑含有靶标生物分子的样本；提供偶联至信号发色团并且能够与靶标生物分子相互作用的第一生物偶联物；提供与多发色团偶联的第二生物偶联物，其中该发色团包含如下结构
其中CP1、CP2、CP3和CP4是任选地被取代的偶联的聚合物区段或寡聚结构，它们彼此相同或不同，其中第二生物偶联物可结合至第一生物偶联物，并且在这种结合后，多发色团的激发能够将能量传递至信号发色团，在第一生物偶联物可结合至靶标生物分子(如果存在)的条件下将样本在溶液中与第一生物偶联物接触，将该溶液与第二生物偶联物接触，向样本施加能够激发发色团的光源，以及检测是否从信号发色团上发出光来。在一个实施方式中，CP1、CP2、CP3和CP4是芳香族重复单元，包括但并不局限于苯、萘、蒽、芴、噻吩、呋喃、吡啶和噁二唑，每个任选地被取代，并且其中CP3和CP4可含有一个或多个通过连接体连接的独特生物偶联位点。在一个具体的实施方式中，多发色团是偶联的聚合物，例如聚阳离子偶联的聚合物、阴离子偶联的聚合物和/或电荷中性的偶联的聚合物。
在一个相关的实施方式中，多发色团具有生物连接位点，包括但并不局限于马来酰亚胺、硫醇、琥珀酰亚胺酯(NHS酯)、胺、叠氮化物化学部分、羧基/EDC(1-乙基-3-[3-二甲基氨丙基]碳二亚胺盐酸盐、磺基-SMCC(磺基琥珀酰亚胺基4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷-1-羧酸酯)、胺/BMPH(N-[β-马来酰亚胺基丙酸]酰肼·TFA)、以及磺基-SBED磺基琥珀酰亚胺基[2-6-(生物素酰氨基)-2-(对-叠氮基苯甲酰氨基)-己酰氨基]-乙基-1，3′-二硫代丙酸酯。
在一个具体的实施方式中，多发色团具有如下结构
其中R1是加溶基，选自乙二醇寡聚物、乙二醇聚合物、ω-铵盐烷氧基和ω-磺酸盐烷氧基。
在另一个实施方式中，多发色团具有如下结构
其中R1是加溶基，选自乙二醇寡聚物、乙二醇聚合物、ω-铵盐烷氧基和ω-磺酸盐烷氧基。
在一个更进一步的实施方式中，1和2可包括一个或多个具有如下结构的a-g连接基团
*＝用于共价连接至不饱和骨架的位点 在一个实施方式中，3是具有如下结构的基团h

L＝连接体 A＝生物偶联位点 *＝用于共价连接至不饱和骨架的位点 在另一个实施方式中，复合物的多发色团具有如下结构
其中R1是加溶基，包括但并不局限于乙二醇寡聚物、乙二醇聚合物、ω-铵盐烷氧基和ω-磺酸盐烷氧基。
在另一个实施方式中，复合物的多发色团具有如下结构
其中R1是加溶基，包括但并不局限于乙二醇寡聚物、乙二醇聚合物、ω-铵盐烷氧基和ω-磺酸盐烷氧基。
在另一个实施方式中，复合物的多发色团具有如下结构
其中R1是加溶基，包括但并不局限于乙二醇寡聚物、乙二醇聚合物、ω-铵盐烷氧基和ω-磺酸盐烷氧基。在一个具体的实施方式中，该多发色团是偶联的聚合物，例如聚阳离子偶联的聚合物、阴离子偶联的聚合物和/或电荷中性的偶联的聚合物。
在一个实施方式中，第一和第二生物偶联物中的至少一个是抗体。在一个特定的实施方式中，第一和第二生物偶联物都是抗体。
一般地，在另一个方面，提供了一种测定方法，包括以下步骤提供怀疑含有靶标生物分子的样本；提供包含共价连接的第一生物偶联物的多发色团；提供包含能够与靶标分子相互作用的传感器生物分子、信号发色团以及能够与第一生物偶联物结合的共价连接的第二生物偶联物的传感器生物分子复合物，其中在这种结合后，多发色团的激发能够将能量传递给信号发色团；在传感器生物分子可结合至靶标生物分子(如果存在)的条件下将样本在溶液中与传感器生物分子复合物接触；将溶液与多发色团接触；向样本施加能够激发发色团的光源；以及检测是否从信号发色团上发出光来。在一个具体的实施方式中，多发色团是偶联的聚合物，例如聚阳离子偶联聚合物、阴离子偶联聚合物和/或电荷中性偶联聚合物。
在一个实施方式中，第一和第二生物偶联物包括但并不局限于蛋白质、抗体和核酸、在一个相关的实施方式中，第一生物偶联物是链亲和素或生物素，传感器生物分子是一种抗体，并且在第一生物偶联物是生物素时，第二生物偶联物是链亲和素，或者在第一生物偶联物是链亲和素时是生物素。在另一个实施方式中，第一生物偶联物是链亲和素或生物素，传感器生物分子是一种核酸，并且在第一生物偶联物是链亲和素时第二生物偶联物是生物素，或者在第一生物偶联物是链亲和素时为生物素。
一般地，在另一个方面，提供一种用于鉴定生物分子的生物识别复合物。该复合物可包含生物偶联物、共价连接至该生物偶联物的信号发色团、共价连接至该生物偶联物的多发色团，其中多发色团的激发能够将能量传递至信号发色团上。
在一个实施方式中，生物偶联物可包括但并不局限于抗体或链亲和素。在一个具体的实施方式中，该多发色团是偶联的聚合物，例如聚阳离子偶联聚合物、阴离子偶联聚合物和/或电荷中性偶联聚合物。
一般地，在一个方面，提供了一种测定方法，包括以下步骤提供怀疑含有靶标生物分子的样本；提供包含生物偶联物、共价连接至生物偶联物的信号发色团以及共价连接至生物偶联物的多发色团的生物识别复合物，其中多发色团的激发能够将能量传递给信号发色团；在生物偶联物可结合至靶标生物分子或靶标相关生物分子(如果存在)的条件下将样本在溶液中与生物识别复合物接触；向该溶液施加能够激发发色团的光源；以及检测是否从信号发色团上发出光来。在一个具体的实施方式中，多发色团是偶联的聚合物，例如聚阳离子偶联聚合物、阴离子偶联聚合物和/或电荷中性偶联聚合物。
一般地，在另一个方面，提供了一种用于鉴定靶标生物分子的生物识别复合物，其包含生物偶联物、共价连接至该生物偶联物的多发色团、以及共价连接至该多发色团的信号发色团，其中多发色团的激发能够将能量传递给信号发色团。在一个实施方式中，该生物偶联物是抗体。在另一个实施方式中，该生物偶联物是链亲和素。在一个具体的实施方式中，多发色团是偶联的聚合物，例如聚阳离子偶联聚合物、阴离子偶联聚合物和/或电荷中性偶联聚合物。
一般地，在另一个方面，提供了一种测定方法，包括以下步骤提供怀疑含有靶标生物分子的样本；提供包含生物偶联物复合物的生物识别复合物，该生物偶联物复合物包含生物偶联物、共价连接至生物偶联物的多发色团、以及共价连接至多发色团的信号发色团，其中多发色团的激发能够将能量传递给信号发色团；在生物偶联物可结合至靶标生物分子或靶标相关生物分子(如果存在)的条件下将样本在溶液中与生物识别复合物接触；向该溶液施加能够激发发色团的光源；以及检测是否从信号发色团上发出光来。在一个具体的实施方式中，多发色团是偶联的聚合物，例如聚阳离子偶联聚合物、阴离子偶联聚合物和/或电荷中性偶联聚合物。
在另一个方面，提供的方法是此处公开的一系列方法中的任何方法，其中通过靶标生物分子的检测来检测基因的表达。
在另一个方面，提供的方法是此处公开的一系列方法中的任何方法，其中检测靶标生物分子提供的结果可用于诊断患者的疾病状态。在一个实施方式中，诊断疾病的方法包括以下步骤检查或分析关于样本中是否存在靶标生物分子的数据；以及给患者、医务人员或医疗卫生管理者提供一个结论；该结论是基于检查和分析有关疾病诊断的数据而作出的。在一个相关的实施方式中，提供结论包括经由网络传输数据。
一般地，在另一个方面，提供了用于鉴定靶标生物分子的试剂盒。在一个实施方式中，试剂盒包括多发色团、共价连接至该多发色团的传感器生物分子、共价连接至多发色团的信号发色团，其中信号发色团在多发色团激发时能够接受来自于多发色团的能量，并且传感器生物分子能够与靶标生物分子相互作用。在一个具体的实施方式中，该试剂盒还包括一种基质。
引入参考 在本说明书中提及的所有出版物和专利申请都在此引入作为参考，如同每个单独的出版物或专利申请被特别地和单独地在此引入作为参考一样。



所附的权利要求书中详细地说明了本发明的新特征。参考以下阐述说明性实施方式的详细描述和附图将会更好地理解本发明的特征和优点，在这些说明性实施方式中应用本发明的原理，在附图中 图1.本发明一个实施方式中的多发色团的静电结合示意图。
图2.FITC标记抗体的直接激发图，阐明放大的染料发射(左)，和本发明一个实施方式的多发色团的结构示意图(右)。
图3.Cy3标记抗体的直接激发图，阐明放大的染料发射(左)，和本发明一个实施方式的多发色团的结构示意图(右)。
图4.本发明一个实施方式中生物偶联的多发色团的示意图。
图5.偶联至抗体(左)或染料(右)的多发色团的示意图。
图6.偶联至染料标记的可与第一抗体结合的第二抗体的多发色团的示意图。
图7.与链亲和素偶联的多发色团的示意图，该链亲和素用于结合染料标记的和生物素标记的第一抗体(左)或染料标记的或生物素标记的核酸(右)。
图8.偶联至与染料偶联的抗体的多发色团(左)和偶联至与染料偶联的链亲和素的多发色团(右)的示意图。
图9.本发明一个实施方式中多发色团的结构示意图。
图10.本发明一个实施方式中具有生物偶联位点的单体的示意图。
图11.本发明一个实施方式的单体的合成途径示意图。
图12.本发明另一个实施方式的单体的合成途径示意图。
图13.通过连接体(左)或通过三官能化连接体(右)生物偶联至染料和生物分子上的多发色团的示意图。
图14.同时偶联至染料和抗体上的多发色团(左)以及同时偶联至染料和蛋白质上的多发色团(右)的示意图。
图15.用两种染料标记的DNA探针的单一和多重检测图。
图16.连接至染料和第二抗体的多发色团的示意图，该第二抗体对于针对蛋白质的第一抗体是特异性的。
图17.连接至染料和用于结合第二抗体上生物素的链亲和素的多发色团的示意图。显示第二抗体对于针对蛋白质的第一抗体是特异性的。
图18.本发明一个实施方式中偶联的聚合物多发色团的结构示意图。
图19.本发明另外的实施方式中偶联的聚合物多发色团的结构示意图。
图20.本发明实施方式中各种芳香族单元的结构的示意图。
图21.具有马来酰亚胺生物偶联位点的偶联的聚合物多发色团的结构示意图。
图22.显示一个代表性逻辑装置实例的流程图。
图23.显示一个代表性试剂盒实例的示意图。
图24.本发明一个实施方式的红外(IR)光谱分析图。
图25.本发明一个实施方式的光谱图。
图26.本发明一个实施方式的荧光光谱图。
图27A.本发明一个实施方式中与生物素化有关的结构的示意图。
图27B.本发明的生物素-亲和素结合试验的示意图。
图27C.本发明一个实施方式中关于生物素-亲和素结合试验的荧光光谱图。
图28.本发明另一个实施方式的红外(IR)光谱分析图。
图29.本发明另一个实施方式的光谱图。
图30A.对照聚合物结构的示意图。
图30B.涉及本发明一个实施方式的实验性聚合物结构的示意图。
图30C.关于所述对照和实验性聚合物的荧光光谱图。
图31A.关于本发明一个实施方式的对照聚合物和实验性聚合物结构的示意图。
图31B.关于对照和实验性聚合物的荧光试验示意图。
图32A.本发明聚合物的一个实施方式的荧光光谱图。
图32B.显示本发明一个实施方式的荧光光谱校正值的图。
图33A.本发明一个实施方式的聚合物的荧光信号强度图。
图33B.涉及本发明一个实施方式的聚合物的信号放大图。
图34.本发明另一个实施方式的光谱图。
图35A.本发明的生物素-亲和素结合试验的示意图。
图35B.本发明一个实施方式的荧光素发射图。
图36A.涉及本发明一个实施方式的聚合物结构的示意图。
图36B.涉及本发明一个实施方式的聚合物的荧光试验的示意图。
图36C.本发明聚合物的一个实施方式的荧光光谱图。
发明详述 尽管带电的多发色团结构和基本静电相互作用能够有效地放大染料标记的抗体信号，但是更加定向的多发色团结合方法可保证更低的背景和改善信号。多发色团材料可直接偶联(共价连接)至抗体和/或染料，在试验中提供增加的控制(多发色团-染料间距)。基本上，信号染料与放大聚合物紧密偶联。此外，多发色团的偶联并不局限于染料或抗体；而是多发色团可以偶联至任何种类的生物分子上，包括蛋白质(诸如亲和素/链亲和素)、核酸、亲和性配体、糖类、脂类、肽、以及酶的底物。这些形式可应用于一系列广泛的应用中，诸如DNA微阵列、FISH试验、PCR试验，也包括上述的基于蛋白质的检测应用。聚合物材料的性质进一步允许使用单一激发波长(激光、滤光片等)放大一种以上的染料。这就使得同时检测多个靶标(多重)成为可能。关于多发色团及其应用的详情公开如下，每个在此引入作为参考美国专利申请序列号No.11/329,495，2006年1月10日申请，以US 2006-0183140 A1公布；美国专利申请序列号No.11/329,861，2006年1月10日申请，以US2006-0216734 A1公布；美国专利申请序列号No.11/344,942，2006年1月31日申请，以US 2006-0204984 A1公布；美国专利申请序列号No.10/648,945，2003年8月26日申请，以US 2004-0142344 A1公布；美国专利申请序列号No.10/600,286，2003年6月20日申请，以US2004-0219556 A1公布；美国专利申请序列号No.10/666,333，2003年9月17日申请，以US 2005-0059168 A1公布；和美国专利申请序列号No.10/779,412，2004年2月13日申请，以US 2005-0003386 A1公布。
在进一步详细描述本发明之前，应当理解本发明并不局限于描述的特定的方法学、装置、溶液或器具等，因为这些方法、装置、溶液或器具当然可发生变化。同样应当理解此处使用的术语仅用于描述特定实施方式的目的，并非有意限制本发明的范围。
除非本文清楚指出为其他意思，使用单数形式“一个”和“一种”包括复数形式的所述内容。例如，提及“一个聚集传感器”包括多个聚集传感器，提及“一种探针”包括多种探针，以此类推。另外，使用具体的复数形式的内容，诸如“二”、“三”等，除非文本清楚指出其他意思，应当理解是同一主题的较大数目。
诸如“联结”、“附加”、“偶联”以及“连接”的术语在此处可互换使用，并且涵盖直接以及间接的联结、附加、连接或偶联，除非文本清楚指出其他意思；在一个实例中，短语“偶联的聚合物”按照本领域的常规含意来使用，指的是含有一系列不饱和键的聚合物，并且文中指出术语“偶联”应当理解为不仅是单纯的或直接的或间接的联结、附加或连接。
当述及数值范围时，应当理解在述及的该范围上限和下限之间的每个介于中间的整数值和每个分数，以及在这些数值之间的每个亚范围，也被具体公开。任何范围的上限和下限可独立地被包括在该范围内或被排除在该范围之外，并且当上下限两者中的任何一个、两个都被包括在内或都不包括时，每个范围也被涵盖在本发明之内。当一个被讨论的数值具有内在的限值时，例如当一个组分可以用浓度从0至100％来表示，或当一种水溶液的pH可为1至14时，那些内在的限值就被具体地公开了。当一个数值被明确地述及时，应当理解那些与所述数值大约相同数量或量的数值也处于本发明的范围之内，基于它们的范围也处于本发明的范围之内。当一个组合被公开时，该组合内元素的每个亚组合也同样被具体地公开且处于本发明范围之内。相反地，当不同元素或元素组被公开时，其组合也同样被公开。当一项发明的任何元素被公开为具有多个替代物时，每个替代物单独地或与其他替代物任意组合地被排除的本发明的实例也同样在此处公开；一项发明的一个以上的元素可具有此类的排除，并且具有此类排除的元素的所有组合由此被公开。
除非另外定义或文中清楚指出为别的意思，此处使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的同样的含意。尽管任何与此处描述的类似或等同的方法和材料可以用于本发明的实践或测试，现在描述优选的方法和材料。
所有此处提及的出版物在此引入作为参考，目的是公开和描述引用的参考文件的具体材料和方法学。提供此处所述的出版物仅仅因为它们的公开早于本申请的申请日。而不应理解为承认由于在先的发明，本发明不早于此公开内容。
定义 在描述本发明时，将采用下述术语，并且定义如下。
“烷基”指含1至24个碳原子的支链的、非支链的或环形的饱和烃基，任选地在一个或多个位置被取代，并且包括多环化合物。烷基基团的实例包括任选地被取代的甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基、正庚基、正辛基、正癸基、己基辛基、十四烷基、十六烷基、二十烷基、二十四烷基等，以及环烷基基团，诸如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、金刚烷基和降冰片基(norbomyl)等。术语“低级烷基”指含1至6个碳原子，优选1至4个碳原子的烷基基团。取代的烷基基团上的取代基的例子包括羟基、氰基、烷氧基、＝O、＝S、-NO2、卤素、卤代烷基、杂烷基、羧基烷基、胺、酰胺、硫醚和-SH。
“烷氧基”指“-O烷基”基团，其中烷基如上述定义。“低级烷氧基”基团意指含有一至六个，优选地一至四个碳原子的烷氧基。
“烯基”指2至24个碳原子的支链、非支链或环形烃基，其含有至少一个碳碳双键，任选地在一或多个位点被取代。烯基的实例包括乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基(烯丙基)、1-甲基乙烯基、环丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、异丁烯基、1，4-丁二烯基、环丁烯基、l-甲基丁-2-烯基、2-甲基丁-2-烯-4-基、异戊二烯基、戊-1-烯基、戊-3-烯基、1，1-二甲基烯丙基、环戊烯基、己-2-烯基、1-甲基-1-乙基烯丙基、环己烯基、庚烯基、环庚烯基、辛烯基、环辛烯基、癸烯基、十四烯基、十六烯基、二十烯基、二十四烯基等。此处优选的烯基含有2至12个碳原子。术语“低级烯基”意指含有2至6个碳原子，优选2至4个碳原子的烯基基团。术语“环烯基”意指有3至8个碳原子，优选5至6个碳原子的环形烯基基团。取代的烯基基团上的取代基的例子包括羟基、氰基、烷氧基、＝O、＝S、-NO2、卤素、卤代烷基、杂烷基、胺、硫醚和-SH。
“烯氧基”指“-O烯基”基团，其中烯基如上述定义。
“烷基芳基”指与芳基基团共价连接的烷基基团。优选地，该烷基是一种低级烷基。烷基芳基基团的实例包括苯甲基、苯乙基、苯丙基、1-苄基乙基、苯丁基、2-苯甲基丙基等。
“烷基芳氧基”指“-O烷基芳基”基团，其中烷基芳基如上述定义。
“炔基”指2至24个碳原子的支链或非支链烃基，其含有至少一个-C≡C-三键，任选地在一个或多个位点被取代。炔基的实例包括乙炔基、正丙炔基、异丙炔基、炔丙基、丁-2-炔基、3-甲基丁-1-炔基、辛炔基、癸炔基等。此处优选的炔基含有2至12个碳原子。术语“低级炔基”意指含有2至6个，优选2至4个碳原子，以及一个-C＝C-三键的炔基基团。取代的炔基基团上的取代基的实例包括羟基、氰基、烷氧基、＝O、＝S、-NO2、卤素、卤代烷基、杂烷基、胺、硫醚和-SH。
此处提及的“抗体”在最广泛的意义上使用，具体包括单克隆抗体(包括全长的单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片断(例如Fab、F(ab′)2和Fv)，只要它们对选定抗原表现出结合活性或亲和性即可。
此处使用的“抗原”指任何能够引发免疫应答的物质。
“酰胺”指-C(O)NR′R″，其中R′和R″独立地选自氢、烷基、芳基、和烷基芳基。
“胺”指-N(R′)R″基团，其中R′和R″独立地选自氢、烷基、芳基、和烷基芳基。
“芳基”指具有至少一个环的芳香基团，该环具有偶合的pi电子系统，包括碳环、杂环、桥连和/或多环芳基基团，并可任选地在一个或多个位点处被取代。典型的芳基基团含有1至5个芳香环，这些环可以是稠合和/或连接的。芳基基团的例子包括苯基、呋喃基、唑基(azolyl)、硫代呋喃基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、三嗪基、联苯基、茚基、苯并呋喃基、吲哚基、萘基、喹啉基、异喹啉基、喹唑啉基、吡啶并吡啶基(pyridopyridinyl)、吡咯并吡啶基(pyrrolopyridinyl)、嘌呤基、四氢化萘基(tetralinyl)等。任选取代的芳基基团的例子包括烷基、烷氧基、烷基羧基、烯基、烯氧基、烯羧基、芳基、芳氧基、烷基芳基、烷基芳氧基、稠合的饱和或不饱和的任选取代的环、卤素、卤代烷基、杂烷基、-S(O)R、磺酰基、-SO3R、-SR、-NO2、-NRR′、-OH、-CN、-C(O)R、-OC(O)R、-NHC(O)R、-(CH2)nCO2R或-(CH2)nCONRR′，其中n为0-4，且其中R和R′独立地是H、烷基、芳基或烷基芳基。
“芳氧基”指″-O芳基″基团，其中芳基如上述定义。
“碳环”指任选取代的含有至少一个环的化合物，且其中所有环原子都是碳，并且可以是饱和的或不饱和的。
“碳环芳基”指任选取代的芳基基团，其中环原子是碳。
“卤代”或“卤素”指氟代、氯代、溴代或碘代。卤化物指卤素的阴离子形式。
“卤代烷基”指在一个或多个位点处被卤素取代的烷基基团，包括仅被一种类型的卤素原子取代的烷基基团以及被混合的不同类型的卤素原子取代的烷基基团。卤代烷基基团的例子包括三卤代甲基基团，例如三氟甲基(trfiluoromemyl)。
“杂烷基”指一种烷基基团，其中一个或多个碳原子和相连接的氢原子被任选取代的杂原子替换，包括仅被一种类型的杂原子取代的烷基以及被混合的不同类型的杂原子取代的烷基基团。杂原子包括氧、硫和氮。如此处所使用的，氮杂原子和硫杂原子包括氮和硫的任何氧化形式，以及具有四个共价键的氮的任何形式，包括质子化形式。任选取代的杂原子指用烷基、芳基、烷基芳基或羟基来替换连接在氮原子上的一个或多个氢。
“杂环”指含有至少一个饱和或不饱和的环的化合物，该环具有至少一个杂原子且任选地在一个或多个位点上被取代。典型的杂环基团含有1至5个环，其可以是稠合的和/或连接的，其中每个环含有五个或六个原子。杂环基团的实例包括哌啶基、吗啉基和吡咯烷基。任选取代的杂环基团的示例性取代基对于烷基或芳基在环碳处，对于杂烷基在杂原子处。
“杂环芳基”指在至少一个芳香环上有至少1个杂原子的芳基基团。杂环芳基基团的例子包括呋喃基、噻吩基、吡啶基、哒嗪基、吡咯基、N-低级烷基-吡咯并、嘧啶基、吡嗪基、三嗪基、四嗪基、三唑基、四唑基、咪唑基、联吡啶基、三吡啶基、四吡啶基、吩嗪基、菲罗啉基(phenanthrolinyl)、嘌呤基等。
“烃基”指含有1至大约20个碳原子的烃基取代基，包括支链的、非支链的和环形的种类以及饱和的和不饱和的种类，例如烷基基团、亚烷基基团、烯基基团、烷基芳基基团、芳基基团等。术语“低级烃基”意指有一个至六个碳原子，优选一至四个碳原子的烃基基团。
“取代基”指用以取代连接在碳或氮上的一个或多个氢的基团。取代物的例子包括烷基、亚烷基、烷基羧基、烷氧基、烯基、烯基羧基、烯氧基、芳基、芳氧基、烷基芳基、烷基芳氧基、-OH、酰胺、甲酰胺、羧基、磺酰基、＝O、＝S、-NO2、卤素、卤代烷基、稠合的饱和的或不饱和的任选取代的环、-S(O)R、-SO3R、-SR、-NRR′、-OH、-CN、-C(O)R、-OC(O)R、-NHC(O)R、-(CH2)nCO2R或-(CH2)nCONRR′，其中n是0-4，并且其中R和R′独立地是H、烷基、芳基或烷基芳基。取代也包括用任选取代的杂原子代替碳原子和一个或多个连接的氢原子。
“磺酰基”指-S(O)2R，其R是烷基、芳基、-C(CN)＝C-芳基、-CH2CN、烷基芳基或胺。
“硫代酰胺”指-C(S)NR′R″，其R′和R″独立地选自卤素、烷基、芳基和烷基芳基。
“硫醚”指-SR，其中R是烷基、芳基或烷基芳基。
此处所用的术语“结合对”指以比样本中其他成分更高的亲和力互相特异性结合在一起的第一和第二分子。结合对中成员之间的结合典型地是非共价的。结合对的例子包括免疫结合对(例如任何半抗原或抗原化合物与相应抗体或其结合部分或其片断组合，例如洋地黄毒苷和抗洋地黄毒苷、荧光素和抗荧光素、二硝基酚和抗二硝基酚、溴脱氧尿苷和抗溴脱氧尿苷、小鼠免疫球蛋白和山羊抗小鼠免疫球蛋白)和非免疫结合对(例如生物素-亲和素、生物素-链亲和素、激素[例如甲状腺素和氢化可的松]-激素结合蛋白、受体-受体激动剂或拮抗剂(例如乙酰胆碱受体-乙酰胆碱或其类似物)IgG-蛋白A、凝集素-碳水化合物、酶-酶辅因子、酶-酶抑制物、和互补的能形成核酸双链的多核苷酸对)等。结合对中的一个或两个成员可与其他分子偶联。
术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”在此处可互换使用，指的是任何长度的核苷酸的聚合形式，并可包含核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、其类似物、或其混合物。这些术语仅指分子的一级结构。由此，这些术语包括三链、双链和单链的脱氧核糖核酸(“DNA””)，以及三链、双链和单链的核糖核酸(“RNA”)。它也包括修饰的(例如通过烷基化和/或通过戴帽反应)和未修饰形式的多核苷酸。这些术语的其他详情以及碱基配对形成的详情可见2006年1月31日申请的美国申请序列号No.11/344,942，该申请在此引入作为完整性的参考。
“互补”或“基本互补”指核苷酸或核酸之间，例如，传感器肽核酸和靶标多核苷酸之间，杂交或碱基配对的能力。一般地，互补核苷酸是A和T(或A和U)，或C和G。当一条链的碱基(最佳比对和比较以及具有适当的插入或缺失)与另一条链的至少大约80％，通常至少大约90％至95％，以及更优选大约98％至100％的碱基配对时，两条单链多核苷酸或PNAs就被称作基本互补。
或者，当一个多核苷酸或PNA将在选择性杂交条件下与其互补物杂交时就存在基本互补性。典型地，当在至少14至25个碱基的延伸长度上至少有大约65％，优选地至少大约75％，更优选地至少大约90％互补时，选择性杂交就会发生。参见M.Kanehisa Nucleic Acids Res.12203(1984)。
“优先结合”或“优先杂交”指与样本中的非互补聚合物相比，一种多核苷酸或PNA与样本中其互补物结合的倾向增加。
多核苷酸杂交条件典型地包括小于大约1M的盐浓度，更常见地小于大约500mM和优选地小于大约200mM。在肽核酸和多核苷酸之间杂交的情况中，杂交可在含有少量盐或无盐的溶液中进行。杂交温度可低至5℃，但典型地高于22℃，更典型地高于大约30℃，优选地超过大约37℃。较长片断的的特异性杂交可能需要较高的杂交温度。其他因素可能影响杂交的严格性，包括碱基组成和互补链的长度，有机溶剂的存在和碱基错配的程度，所用参数的组合比任何单独一个参数的绝对值更加重要。其他可以控制的杂交条件包括缓冲液类型和浓度，溶液pH，用于降低背景结合的封闭试剂如重复序列或封闭蛋白质溶液的存在和浓度，去污剂类型和浓度，诸如能够提高多核苷酸相对浓度的聚合物的分子，金属离子和它们的浓度，螯合剂和它们的浓度，以及其他本领域已知的条件。
此处的“多重”指多种分析物可以被同时测定的试验或其他分析方法。
“具有”是类似于“包含”和“包括”的开放式用语，包括其它元素被包括在内的情况和没有包括在内的情况。
“任选的”或“任选地”意思是后面描述的事件或状况可能发生或可能不发生，并且该描述包括该事件或状况发生的情况以及没有发生的情况。
此处公开的本发明一般地涉及包括多发色团和信号发色团的测定和复合物，信号发色团通过增强的信号放大作用来用于鉴定靶标生物分子或与靶标分子相关联的生物分子。
一般地，在一个方面，本发明包括多发色团向传感器上的染料的能量传递，该传感器可以是生物分子，包括生物偶联物(例如，抗体)。
在一个实施方式中，用一种方法改变关于核酸传感器测定的形式，如Gaylord，Heeger，and Bazan，J.Am.Chem.Soc.，2003所述。具体而言，多发色团的信号放大可以基于非特异性静电结合事件，以显示杂交事件。任何建立的多发色团可以被选作供体，一种或多种染料，优选地具有高效能量传递历史的染料，例如荧光素和Cy3，可以被选作受体。可以预想染料可直接偶联至传感器分子上。如图1示意性地显示的，传感器可以是溶液中或底物上的生物分子(例如，抗体)，在其上可加上多发色团。在图1显示的实施方式中，染料可共价连接至(生物偶联至)一种抗体(Y形结构)，抗体具有净负电荷。阳离子多发色团(用波状线显示)的加入可以导致该多发色团和抗体之间的静电结合，使多发色团和染料紧密接近。由此可以满足荧光共振能量传递(FRET)所需的距离，并且用光(显示为hv)激发聚合物导致染料发射放大。可以想象多发色团可在染料不具备显著吸收的波长下激发。在一个实施方式中，染料可在比多发色团发射更长的波长下发射。在使用中可以想到一种测定方法包括以下步骤提供怀疑含有靶标生物分子的样本；提供偶联至信号发色团且能够与该靶标生物分子相互作用的传感器；提供与传感器静电作用并且在激发时能够传递能量至传感器信号发色团的多发色团；在传感器可结合至靶标生物分子(如果存在)的条件下将样本在溶液中与传感器和多发色团接触；接着，该方法可包括向样本施加能够激发多发色团的光源，以及检测是否从信号发色团上发出光来。
从图1显示的实施方式产生的数据的一个实例呈现在图2中。如图显示，FITC标记的小鼠抗人CD22抗体可以被直接激发(下线，标为FITC)，或通过激发静电结合的多发色团(图2所示的结构，右侧)并且随后经由FRET能量传递而间接激发(上线，标为被聚合物放大的信号)。该实验的细节包括直接激发FITC标记的小鼠抗人CD22抗体(下线，标为FITC，496nm激发，[FITC标记的小鼠抗人CD22抗体]＝1ng/mL)，和在2mL 1X SSPE中多发色团放大的染料发射(上线，380nm激发，[多发色团]＝1x10-6M，以重复单元计，RU)。供体多发色团的结构显示于图的右边。有利地，与直接激发相比，在存在多发色团的情况下的能量传递导致染料信号强度放大5倍。
图3显示了图1显示的实施方式产生的第二个数据的实例。在这里，该图显示了直接(下线，标为Cy3，540nm激发)和间接(上线，380nm激发)激发Cy3标记的驴抗小鼠第二抗体的光学报告信号的比较。实验条件类似于先前实验的条件，但是使用了一半的体积。供体多发色团结构显示于图3的右侧。多发色团放大的染料强度比直接染料激发的强度大10倍。
如此处所公开的，带电的多发色团与染料标记的抗体之间的静电结合是提高检测灵敏度例如生物分子靶标的灵敏度的一个可行的手段。在更进一步的实施方式中，共价连接多发色团至染料/生物分子(例如，抗体)复合物提供了几个优势，包括降低的背景和提高的能量传递。在直接连接至生物分子的例子中，生物识别事件，而不是静电结合事件，应当管理多发色团的存在。在这种方式下，多发色团与生物分子的非特异性结合可以被消除，减少任何由多发色团本身产生的背景发射。上述生物分子包括但并不局限于蛋白质、肽、亲和性配体、抗体、抗体片断、糖、脂类和核酸(如杂交探针和/或适体)。
在直接连接至染料或生物分子/染料复合物的例子中，供体-受体距离可以固定，而非依靠静电结合的强度，并且能量传递效率可被显著地提高。这对于提高染料信号和减少与供体-受体交叉联系(cross-talk)相关的背景荧光具有重要意义。此例中的交叉联系是指多发色团(供体)与染料(受体)发射峰之间的重叠。由于距离太远而无法产生能量传递的非特异结合的多发色团对背景荧光(或交叉联系)有贡献。供体和受体之间较短的(固定的)距离不但能够促进直接染料放大，而且能大大猝灭供体发射。这就导致在受体发射波长上有较少的供体发射，由此减少或甚至消除了对交叉联系校正的需要。
一般地，在另一个方面，本发明包括多发色团与亲和性配体(亲和性配体描述为对另一生物分子具有亲和性的生物分子)的生物偶联。图4显示了一类物质，其中多发色团(用波状线显示)连接至染料、生物分子、或生物分子/染料复合物(标为X)。与多发色团的连接可经由多发色团上作为生物偶联位点的第一功能性连接体A连接，该位点能与第二功能性连接体A’共价连接，A’又连接至生物分子和/或染料上(参见X)。这种排列可以固定多发色团和X之间的距离，因此保证了仅多发色团和X之间的特异性相互作用。可以预想该实施方式中的生物分子组分X可以是此处公开的多种生物分子中的任意一种，包括但并不局限于抗体、蛋白质、亲和性配体或核酸。
可以预想本文中的X可以是，但并不局限于，染料、荧光蛋白、纳米材料(例如Quantum Dot)、染料和产生化学发光的分子之间的偶联物、荧光蛋白和产生化学发光的分子之间的偶联物、纳米材料(例如Quantum Dot)和产生化学发光的分子之间的偶联物、链亲和素、亲和素、酶、酶底物、酶底物的类似物、受体、受体的配体、受体的配体类似物、DNA、RNA、修饰的核酸、DNA适体、RNA适体、修饰的核酸适体、肽适体、抗体、抗原、噬菌体、细菌或任何两种上述成分的偶联物。
A-A’和B-B’的连接化学包括，但并不局限于，马来酰亚胺/硫醇、琥珀酰亚胺酯(NHS酯)/胺、叠氮化物化学、羧基/EDC(1-乙基-3-[3-二甲基氨丙基]碳二亚胺盐酸盐/胺、胺/磺基-SMCC(磺基琥珀酰亚胺基4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷-1-羧酸酯)/硫醇、和胺/BMPH(N-[β-马来酰亚胺基丙酸]酰肼·TFA)/硫醇。
在另一个方面，本发明包括标记的多发色团。图5显示了两个标记的多发色团的实例。在一个实施方式中，在左侧，显示多发色团(以波状线显示)与抗体偶联，该抗体可以是，例如，1°或2°抗体。例如，在一个试验中，多发色团和抗体的偶联物可以作为报告物。多发色团用光(未显示)激发可导致多发色团的发射，显示出抗体(1°或2°)的存在。在图5右侧显示的另一个实施方式中，多发色团用染料例如发色团标记。在此例中，在显示的FRET过程里，多发色团可起到供体的作用，染料可起到受体的作用。在此处，多发色团可起到集光者的作用，多发色团激发之后是经由FRET过程将激发传送给染料。这就导致了放大的染料发射(与直接染料激发相比)。在一个实施方式中，供体多发色团的荧光可被猝灭(例如＞90％猝灭)。
一般地，在另一个方面，本发明包括一种测定靶标生物分子或标记的靶标生物分子的方法。如图6所示，在一个实施方式中，多发色团(以波状线显示)可连接至第一生物偶联物(显示为一个Y形的物体)，例如针对第二个染料标记的生物偶联物(例如1°抗体)特异性的2°抗体。在此处，1°和2°抗体之间的识别事件将导致供体多发色团和受体染料之间的距离缩短。经过该识别事件后，用光(显示为hv)激发供体多发色团将导致向受体染料的FRET(显示为弯曲的箭头)，并且观察到放大的染料发射(与直接激发染料相比)。在使用中，可以预想一种测定方法可包括提供怀疑含有靶标生物分子的样本，提供偶联至信号发色团并且能够与靶标生物分子相互作用的第一生物偶联物，例如1°抗体。接下来提供偶联至多发色团的第二生物偶联物，例如2°抗体，其中第二生物偶联物可结合至第一生物偶联物上并且其中在该结合后多发色团的激发能够将能量传递至信号发色团。接下来，该方法包括在第一生物偶联物能够结合至靶标生物分子(如果存在)的条件下，在溶液中将样本和第一生物偶联物接触，并且将溶液与第二生物偶联物接触。该方法接着包括向至靶标生物分子或标记的靶标生物分子施加光源，其中该光源能够激发多发色团，随后检测是否从信号发色团发射出光来。
一般地，在另一个方面，本发明包括一种使用多发色团和传感器生物分子复合物测定样本的方法。如图7左侧所示，多发色团(以波状线显示)可偶联至第一生物偶联物，例如链亲和素(SA)，其对生物素有极强的亲和性。在图7左侧，传感器生物分子(例如可以是1°或2°抗体的抗体)同时偶联至染料和第二生物偶联物(例如生物素部分)。经过第一和第二生物偶联物(例如SA和生物素)之间的生物识别事件后，多发色团和染料紧密靠近，并且供体多发色团的激发将导致向受体染料的FRET。染料发射将指示第一生物偶联物的存在(例如抗体)。与直接染料激发相比，当通过FRET间接激发时将会观察到染料信号强度的放大。
在如图7右侧显示的另一个实施方式中，传感器生物分子，例如核酸，同时偶联至染料和第一生物偶联物(例如生物素部分)上。经过第二生物偶联物(例如SA)和第一生物偶联物(例如生物素)之间的生物识别事件后，多发色团和染料紧密靠近，并且供体多发色团的激发将导致向受体染料的FRET。与直接染料激发相比，当通过FRET间接激发时将会观察到染料信号强度的放大。染料发射将指示传感器生物分子(例如核酸)的存在。
应用图7所示实施方式的方法可包括以下步骤提供怀疑含有靶标生物分子的样本；提供包含共价连接的第一生物偶联物(例如SA)的多发色团；提供包含能够与靶标生物分子相互作用的传感器生物分子、信号发色团、和共价连接的能与第一生物偶联物结合的第二生物偶联物的传感器生物分子复合物，其中在该结合后，多发色团的激发能将能量传递至信号发色团。该方法进一步包括以下步骤在传感器生物分子能结合至靶标生物分子(如果存在)的条件下，在溶液中将样本和传感器生物分子复合物接触；将溶液与多发色团接触；对样本施加能够激发多发色团的光源；以及检测是否从信号发色团发射出光来。
一般地，在另一个方面，本发明提供一种用于鉴定靶标生物分子的生物识别复合物，其包含生物偶联物、信号发色团和多发色团。图8显示了直接偶联至染料标记的生物偶联物如抗体的多发色团(左侧)。图8进一步显示了一个替代实施方式，其中多发色团偶联至染料标记的SA(右侧)。在左侧所示的实施方式中，生物偶联物(显示为Y形)与染料和多发色团之间的共价连接确保了供体多发色团和受体染料紧密靠近。在生物偶联物如抗体和它的靶标如抗原之间的生物识别事件后，供体多发色团的激发将导致向受体染料的FRET。在图8右侧所示的一个替代实施方式中，多发色团和染料仍然保持固定的足够近的距离。这样，在如SA和生物素部分之间的结合事件后，供体多发色团的激发将导致向受体染料的FRET。在图8所示的每个实施方式中，多发色团的激发导致放大的染料发射。
图9显示了CP结构的一个非限制实例。骨架可主要由芴-亚苯基重复单元组成并充当FRET过程中的供体。CP由R1和R2基团功能化。二者都可起到使具有亲水基团的CP溶解的作用，包括但并不局限于季胺或PEG-型官能团，而R2也可以通过能量水平修饰调节光学性质。以位点A功能化的第三共聚单体苯基基团允许与染料或生物分子生物偶联。连接体A可以是，但并不局限于马来酰亚胺、硫醇、琥珀酰亚胺酯(或NHS-酯)、胺、叠氮化物、生物素、亲和素/链亲和素、或可与生物分子或染料上的A’连接体反应的其他配体-受体(例如，参见图4)。
一种允许合成图9的示例性聚合物的独特单体显示于图10中。该单体具有两个适合于Suzuki偶联的位点(参见Liu and Bazan，J.Am.Chem.Soc.，2005；Liu and Bazan，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，2005；Bazan，Liu，美国临时申请No.60/666,333，申请于2003年9月17日)，以及重要地，一个允许生物偶联的位点A。位点A可以是生物偶联位点本身，或前体，诸如邻苯二甲酰亚胺(被保护的胺)。
图11和图12显示了几个适合的单体合成的实例。图11示意性地显示了具有邻苯二甲酰亚胺官能团的单体的合成，邻苯二甲酰亚胺作为被保护的胺。图12显示了具有马来酰亚胺的单体的合成，马来酰亚胺可生物偶联至硫醇。
合成用于聚合作用的两个单体结构的实例如下。第一步是一步合成用保护的胺(邻苯二甲酰亚胺的形式)功能化的单体，用于生物偶联至琥珀酰亚胺酯，第二步是四步合成用马来酰亚胺功能化的单体，用于生物偶联至硫醇。
N-4’-(3”，5”-二溴苯氧基)丁基邻苯二甲酰亚胺或1-(4’-邻苯二甲酰亚胺基丁氧基)3，5-二溴苯。在己烷中再结晶3，5-二溴苯酚(970mg，3.85mmol)。去除溶剂后，加入N-(4-溴丁基)邻苯二甲酰亚胺(1.38g，4.89mmol)、K2CO3(1.88g，13.6mmol)、18-冠-6(53mg，0.20mmol)和丙酮(20mL)。回流1小时，然后倒入100mL水中。使用二氯甲烷(4×30mL)萃取水相。合并有机相，用水、饱和NaHCO3和盐水洗涤，然后用MgSO4干燥，过滤。溶剂的去除产生白色固体，通过柱层析(4∶1己烷∶CH2Cl2)纯化，接着在己烷中再结晶，产生无色针状物(650mg，87％)。
N-甲氧羰基马来酰亚胺。马来酰亚胺(2.00g，20.6mmol)和N-甲基吗啉(2.08g，20.6mmol)在乙酸乙酯中冷却至0℃。滴加氯甲酸甲酯(1.4mL，20.7mmol)产生白色沉淀。溶液在0℃搅拌1小时，随后滤除固体。浓缩滤过液产生粉红色的油状物，后用柱层析(洗脱液3∶1己烷∶乙酸乙酯)纯化，产生淡黄色晶体。
N-(ω-羟己基)马来酰亚胺。将6-氨基-1-己醇和饱和NaHCO3(20mL)冷却至0℃。在搅拌下分批加入N-甲氧羰基马来酰亚胺。固体不会完全溶解。在0℃搅拌30分钟(大部分固体在20分钟后溶解)，然后去除冰浴且再搅拌30分钟，此时溶液呈淡粉红色。用水三倍稀释该液体并用氯仿(3×40mL)洗涤，MgSO4干燥，过滤，且通过旋转蒸发去除溶剂。
1-(6’-溴己氧基)-3，5-二溴苯。3，5-二溴苯酚在己烷中再结晶。去除溶剂后，加入1，6-二溴己烷、K2CO3、18-冠-6和丙酮。回流1小时，然后倒入100mL水中。使用二氯甲烷(4×30mL)萃取水相。合并有机相，用水、饱和NaHCO3和盐水洗涤，然后用MgSO4干燥，过滤。去除溶剂产生灰白色固体，用柱层析纯化，产生白色固体。
1-(6’-(6”马来酰亚胺基己氧基)己氧基)-3，5-二溴苯。将N-(ω-羟己基)马来酰亚胺、-(6’-溴己氧基)-3，5-二溴苯、K2CO3、18-冠-6和丙酮回流1小时，然后倾倒入100mL水中。使用二氯甲烷(4×30mL)萃取水相。合并有机相，用水、饱和NaHCO3和盐水洗涤，然后用MgSO4干燥，过滤。去除溶剂产生粗物质，用柱层析纯化产生纯产物。
一般地，在另一个方面，本发明提供一种用于鉴定靶标生物分子的多发色团复合物，其包含多发色团、传感器生物分子和信号发色团。如图13所示，在一个实施方式中，多发色团可同时生物偶联至染料和生物分子例如生物识别分子上。可用的生物分子包括但并不局限于抗体、亲和性配体、核酸、蛋白质、纳米材料或酶底物。接近多发色团共价连接染料的优点已在上面描述。通过将受体染料和生物识别分子都连接至多发色团上，有两个优点，通过固定供体-受体距离，保证受体处于供体多发色团的附近(反之亦然)，并且也提高了指示出生物识别事件的多发色团结合的特异性。这些共价复合物可通过此处所述的单体和连接化学制备。
如图13左侧所示，在一个实施方式中，多发色团(波状线)经过连接体官能团A-A’可生物偶联至染料X上，经过连接体官能团B-B’可生物偶联至生物分子Y上。在如图12右侧所示的一个替代实施方式中，多发色团可通过三功能化连接体经过连接体官能团A-A’、B-B’和C-C’生物偶联至染料X和生物分子Y上。在图13中所示的实施方式中，该X可以是，但并不局限于，染料、荧光蛋白、纳米材料(例如Quantum Dot)、染料和产生化学发光的分子之间的偶联物、荧光蛋白和产生化学发光的分子之间的偶联物、或纳米材料(例如Quantum Dot)和产生化学发光的分子之间的偶联物。该Y可以是，但并不局限于，链亲和素、亲和素、酶、酶底物、酶底物类似物、受体、受体的配体、受体的配体类似物、DNA、RNA、修饰的核酸、DNA适体、RNA适体、修饰的核酸适体、肽适体、抗体、抗原、噬菌体、细菌或任何上述两种成分的偶联物。
用于A-A’、B-B’和C-C’的连接化学可包括，但并不局限于，马来酰亚胺/硫醇、琥珀酰亚胺酯(NHS酯)/胺、叠氮化物化学、羧基/EDC(1-乙基-3-[3-二甲基氨丙基]碳二亚胺盐酸盐/胺、胺/磺基-SMCC(磺基琥珀酰亚胺基4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷-1-羧酸酯)/硫醇、和胺/BMPH(N-[β-马来酰亚胺基丙酸]酰肼·TFA)/硫醇。三功能连接体诸如可商购的磺基-SBED磺基琥珀酰亚胺基[2-6-(生物素酰氨基)-2-(对-叠氮基苯甲酰氨基)-己酰氨基]-乙基-1，3′-二硫代丙酸酯可以在X、Y和多发色团之间的三向连接中发挥很好的功能。
在使用中，图13显示的实施方式可以是一种鉴定靶标生物分子的多发色团复合物，其中该复合物包含多发色团、共价连接至该多发色团的信号发色团和共价连接至该多发色团的传感器生物分子。该复合物中的信号发色团能够接受多发色团激发时来自多发色团的能量，该传感器生物分子能够与靶标生物分子相互作用。可以预想该生物分子可包括但并不局限于抗体、蛋白质、亲和性配体、肽或核酸。
一般地，在另一个方面，本发明提供一种用于鉴定生物分子的生物识别复合物，其中该复合物包含生物偶联物、多发色团和信号发色团。在图14左侧显示的一个实施方式中，多发色团同时偶联至生物偶联物如抗体(1°或2°)和染料上。供体多发色团与受体染料之间的共价连接保证了紧密接近。供体多发色团的激发导致向该受体染料的FRET。当该生物偶联物是抗体时，如果该抗体结合至它的靶标(例如抗原)上，在供体多发色团激发后就会通过染料发射显示出来。在图14右侧显示的一个替代实施方式中，多发色团可同时偶联至SA和染料上。同样，供体多发色团与受体染料之间的共价连接保证了紧密接近，供体多发色团的激发导致向该受体染料的FRET。该SA复合物可用于标记或检测生物素标记的生物分子诸如生物素化的抗体或核酸。多发色团激发后向染料标记的FRET将会大大增强检测信号(即更高的灵敏度)。
图16显示了双标记的多发色团(以波状线显示)的一个实例，它同时生物偶联至受体染料和2°抗体(Y形结构)上。在一个试验中，未标记的1°抗体可结合至抗原，例如靶标蛋白质(显示为黑色三角形)。加入偶联至多发色团并且进一步偶联至染料的2°抗体，可特异性地与1°抗体结合。与直接激发结果相比，多发色团的光学激发可引起向染料的能量传递和染料发射放大。
图17显示了本发明一个实施方式的夹心型复合物的一个实例。在此，多发色团复合物由生物偶联至染料和生物分子如链亲和素(SA)的多发色团(以波状线显示)组成。未标记的1°抗体结合到靶标蛋白(显示为黑色三角形)上后，生物素标记的2°抗体与1°抗体特异性结合。在一个分离的步骤中，多发色团复合物的加入将导致生物素和链亲和素之间的特异性结合，与直接激发染料相比，多发色团激发将导致放大的染料发射。染料发射产生的信号将指示靶标蛋白的存在。
在一个进一步的方面，本发明提供供体能量向多个受体传递的多重化技术。通过在FRET系统中应用多发色团作为供体，也包括能够多重化的优点。一个供体可将能量传递至几个染料；由此在有一个激发源的情况下，可以监测多个染料的强度。当不同类型的细胞可通过蛋白质-抗体识别事件被监测时，这可用于包括但并不局限于细胞成像(即免疫组化)的应用。
在一个实施方式中，两种染料标记的抗体可与一种生物材料例如培养的细胞系孵育。抗体可以识别在其表面表达靶标蛋白的细胞并且仅特异性地结合至这些蛋白质上。通过使用不同染料标记这两种抗体，就有可能同时监测两种不同蛋白质或不同细胞类型的表达。典型地，这将需要两次扫描或成像，每次都用正确的激发波长。作为分析前的最后一个步骤，将这两个图像互相重叠。通过使用同时偶联至染料和多发色团的抗体，对两个染料可使用一种激发波长，并且一张图像将包括来自于两种抗体的每一个的数据组。
该实施方式的一个相关实例显示于图15中，其显示了一个供体多发色团将能量传递至荧光素标记的DNA探针(点线)、能量传递至德克萨斯红标记的DNA探针(短划线)、和能量传递至两种探针(实线)的发射光谱。另外，两种染料直接激发产生的光谱显示为朝向图15底部的实线。在这三个例子中均看到显著的染料放大。另外，每种染料均观察到强烈的信号，无论是否存在其他染料，显示出良好的多重化潜力。可以想像蛋白质诊断的平行结果。
考虑到用于多重化分析的潜力，可以想象多发色团可连接至多种染料上，包括，但并不局限于，荧光素、6-FAM、罗丹明、德克萨斯红、四甲基罗丹明、羧基罗丹明、羧基罗丹明6G、羧基对甲氨基酚、羧基罗丹明110、Cascade Blue、Cascade Yellow、香豆素、


Cy-Chrome、藻红蛋白、PerCP(多甲藻素叶绿素-a蛋白)、PerCP-Cy5.5、JOE(6-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基荧光素)、NED、ROX(5-(和-6)-羧基-X-罗丹明)、HEX、Lucifer Yellow、MarinaBlue、Oregon Green 488、Oregon Green 500、Oregon Green 514、AlexaFluor.RTM.350、Alexa

430、Alexa

488、Alexa

532、Alexa

546、Alexa

568、Alexa

594、Alexa

633、Alexa

647、Alexa

660、Alexa

680、7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸、BODIPY.RTM.FL、

FL-Br2、

530/550、

558/568、

564/570、

576/589、

581/591、

630/650、

650/665、

R6G、

TMR、

TR、其偶联物、和其组合。
可以想到此处描述的本发明可用于提高任一种商业化检测的灵敏度，其包括但并不局限于OraQuick Rapid HIV-1/2抗体检测，由OraSure Technologies，Inc.(Bethlehem，PA)生产，是FDA批准的用于口腔液体样本的HIV诊断测试。该检测在短至20分钟的时间内可提供超过99％准确性的筛查结果。
多发色团 集光多发色团系统可有效传递能量至邻近的发光物质。能量传递机制包括，例如共振能量传递(Forster(或荧光)共振能量传递，FRET)、量子电荷交换(Dexter能量传递)和类似机制。但是典型地，这些能量传递机制都处于相对较近的范围内，并且集光多发色团系统紧密靠近信号发色团对于高效能量传递是必需的。当集光多发色团系统的发色团个体数目较大时可产生发射的放大；与荧光团直接被泵浦光激发相比，当入射光(“泵浦光”)处于可被集光多发色团系统吸收并传递至荧光团的波长时，来自于荧光团的发射强度更强。
本发明使用的多发色团可以是电荷中性的、阳离子的或阴离子的。在一些实施方式中，多发色团是聚阳离子多发色团。
在多发色团是聚阳离子的实施方式中，它们可以与含有多个阴离子基团的生物分子如多糖、多核苷酸、肽、蛋白质、抗体等相互作用。在一些实施方式中，多发色团可与靶标抗体或多核苷酸静电作用，并且通过抗体抗原识别或传感器多核苷酸和靶标多核苷酸之间的杂交，使不带电的传感器多核苷酸上的信号发色团接近以便于能量接收。任何能吸收光和优选地发射或传递能量的聚阳离子多发色团可在描述的本方法中使用。可使用的多发色团的例子包括偶联的聚合物(CP)、饱和聚合物或以任意可行方式合并多个发色团的树状聚合物、和半导体纳米材料(SCNCs)。该CP、饱和聚合物和树状聚合物可制备成合并多个阳离子物质或可以衍生化以使它们在合成后为聚阳离子形式；通过在它们表面加入阳离子物质可使半导体纳米材料成为聚阳离子形式。在一些实施方式中，聚阳离子多发色团不是按照其在激发时传递能量的能力来检测，因此涉及此类检测方案的方法不需要多发色团发射或传递能量。
在一些实施方式中，多发色团是CP。在一个具体的实施方式中，CP包含一定量的一种类型的“低带隙重复单元”，使聚合物在大约450nm至大约1000nm的范围内具有吸收。低带隙重复单元在聚合前可表现或不表现这种吸收，但在合并入偶联的聚合物之后确实能引入这种吸收。这种吸收特征允许聚合物在多种设置下在产生较少背景荧光的波长下被激发，这些设置包括分析生物样本和成像和/或检测分子。CP吸收向较低能量和较长波长的转移因此允许更灵敏和更可靠的方法。另外，许多可商购的仪器中加入了在此波长下工作的成像部件，至少部分原因是为避免此类问题。例如，在扩增反应中进行实时检测的热循环仪和微阵列阅读仪都在此区域内工作。提供在这个区域内吸收的聚合物可使检测方法适应这些形式，也允许进行全新的方法。
整合入能够降低带隙的重复单元可产生具有这些特征的偶联的聚合物。产生能在这些波长下吸收光的聚合物的任选取代的种类的例子包括2，1，3-苯并噻二唑、苯并硒二唑(benzoselenadiazole)、苯并碲二唑(benzotellurodiazole)、萘并硒二唑(naphthoselenadiazole)、4，7-二(噻吩-2-基)-2，1，3-苯并噻二唑、方酸染料(squaraine dyes)、喹喔啉、低带隙商业化染料、石蜡和氰基取代的石蜡和其异构体。关于合适的多发色团的组成、结构、性质和合成方面的详情可见于2005年1月10日提交的美国临时申请No.60/642,901和2006年1月10日提交、现以US 2006-0183140 A1公布的美国专利申请序列号No.11/329,495中，两者均在此引入作为参考。
多发色团可被描述为一组共价结合的发色团单元或发色团的共价集合体。多发色团可包括，但并不局限于，线性结构，诸如偶联的聚合物(CPs)和树状结构(Wang，Gaylord，and Bazan，Adv.Mater.，2004，Wang，Hong，and Bazan，Org.Lett.，2005。
图18显示了作为线性多发色团的CP的通常结构。在一个实施方式中，该CP可由Liu和Bazan的美国专利申请序列号No.10/666,333“构象柔性阳离子偶联聚合物”(Conformationally Flexible CationicConjugated Polymers)的表1和表2或方案1中所述的单元组成，也包括此处图10所示的含有一个或多个独特生物偶联位点的单体。该CP优选地含有至少大约0.01mol％的生物偶联位点，并且可含有至少大约0.02mol％、至少大约0.05mol％、至少大约0.1mol％、至少大约0.2mol％、至少大约0.5mol％、至少大约1mol％、至少大约2mol％、至少大约5mol％、至少大约10mol％、至少大约20mol％或至少大约30mol％。CCP可含有最多100mol％的生物偶联位点，可含有大约99mol％或更少、大约90mol％或更少、大约80mol％或更少、大约70mol％或更少、大约60mol％或更少、大约50mol％或更少、或大约40mol％或更少。
在图18中，单元CP1、CP2、CP3和CP4是任选被取代的偶联聚合物区段或寡聚结构，并且它们可以彼此相同或不同。CP1、CP2、CP3和CP4可为芳香重复单元并可选自苯、萘、蒽、芴、噻吩、呋喃、吡啶和噁二唑，每个任选地被取代。另外，CP3和CP4可含有一个或多个独特的生物偶联位点，由的连接体L连接，如图3h所示。这些生物偶联位点可以是，但并不局限于，马来酰亚胺、硫醇、琥珀酰亚胺酯(NHS酯)、胺、叠氮化物化学、羧基/EDC(1-乙基-3-[3-二甲基氨丙基]碳二亚胺盐酸盐、磺基-SMCC(磺基琥珀酰亚胺基4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷-1-羧酸酯)、胺/BMPH(N-[β-马来酰亚胺基丙酸]酰肼·TFA)、或磺基-SBED磺基琥珀酰亚胺基[2-6-(生物素酰氨基)-2-(对-叠氮基苯甲酰氨基)-己酰氨基]-乙基-1，3′-二硫代丙酸酯，它们可以在如图13的X、Y和CP之间作为三向连接体。
典型的芳香族重复单元显示于Liu和Bazan的美国专利申请序列号No.10/666,333“构象柔性的阳离子偶联聚合物”的表1中，代表性聚合物区段和寡聚结构显示于表2中。
图18含有CP3和CP4，其可以是有角度的连接体(间位形式)，并且可以是具有5至20个原子的单环或多环任选取代的芳基基团。CP3和CP4单元可以均匀地或随机地沿聚合物主链分布。
CP1、CP2、CP3和CP4中的每一个任选地在一个或多个位置处被一个或多个基团取代，这些基团选自--R1--A、--R2-B、--R3--C和-R4--D，这些基团可以经由桥接官能团--E--和--F--连接在一起，前提是整个聚合物必须被多个阳离子、阴离子、或电荷中性的水溶性基团取代。
R1、R2、R3和R4独立地选自烷基、烯基、烷氧基、炔基、芳基、烷基芳基、芳基烷基和聚环氧烷，每个任选地被取代，其可含有一个或多个杂原子，或可能不存在。R1、R2、R3和R4可独立地选自C1-22烷基、C1-22烷氧基、C1-22酯、具有1至大约22个碳原子的聚环氧烷、具有1至大约22个碳原子的环状冠醚，或不存在。优选地，R1、R2、R3和R4可选自具有1至大约12个碳原子的直链或支链烷基基团，或具有1至大约12个碳原子的烷氧基基团。应当理解，一个以上的官能团可以连接到如通式所示的环的一个或多个位置上。
A、B、C和D独立地选自H、--SiR′R″R″′、--N+R′R″R″′、胍基、组氨酸、聚胺、吡啶基团和锍基团。R′、R″和R″′独立地选自氢、C1-12烷基和C1-12烷氧基和C3-12环烷基。优选地，R′、R″和R″是低级烷基或低级烷氧基基团。
E和F独立地选自缺无、--O--、--S--、--C(O)--、--C(O)O--、--C(R)(R′)--、--N(R′)--和--Si(R′)(R″)，其中R′和R″如上述定义。
X是O、S、Se、--N(R′)--或--C(R′)(R″)--，并且Y和Z独立地选自--C(R)＝和--N＝，其中R、R′和R″如上述定义。
图19显示了一个由含有芴单元和芳香族单元1、2和3的骨架组成的CP。单元1和2可以是、但并不局限于，显示于图20中的结构。单元3含有生物偶联位点。R1官能团被标为加溶基，可以是，但并不局限于，带电的烷基官能团(如(CH2)nNMe3Br，或(CH2)nSO3Na)或亲水基团(如乙二醇单元，(OCH2CH2)n)。
来自于图19的π-偶合的单元1、2和3包括Liu和Bazan的美国专利申请序列号No.10/666,333“构象柔性的阳离子偶联聚合物”的表1和2和方案1中描述的那些物质。图20显示了可能存在于如图19所示的普通CP结构内的π-偶合的单元的几个具体实例，用星号表示共价结合至CP骨架的位点。这些单元包括以典型的对位形式(a、b和e)或以间位形式(c和d)连接至CP骨架的苯单元，间位形式允许在CP骨架内具有更好的柔性。这些单元可被改变电子结构的部分功能化(b、d和e)，包括供体基团(烷氧基或乙二醇单元)和吸电子基团(氟)或用亲水性乙二醇单元或带电基团如季胺或磺酸酯改善水溶性(e)。也包括诸如噻吩(f)和苯并噻二唑基团(g)的单元，其可以起到改变电子结构的作用。这些单元好可以像上述那样被功能化。单元h含有特异性生物偶联位点A，例如马来酰亚胺，其经由连接体L例如烷氧基共价结合至π-偶合的区段上，并且可以以邻位、对位或间位的形式被整合至CP骨架上。
特定聚合物结构的几种变体包括显示于图21中的那些，其含有一定百分比的经由醚和烷氧基连接体连接的具有马来酰亚胺或琥珀酰亚胺酯生物偶联位点的单元。
本发明有用的偶联聚合物包括但并不局限于以下所述
抗原-抗体相互作用 抗原和抗体之间的相互作用与其他非共价蛋白质-蛋白质相互作用相同。一般地，抗原和抗体之间存在四种类型的结合相互作用(i)氢键，(ii)分散力，(iii)Lewis酸和Lewis碱之间的静电力，和(iv)疏水相互作用。某些物理力对抗原抗体结合有贡献，例如表位形状与不同抗体结合位点的适配或互补。此外，其他材料和抗原可与抗体交叉反应，由此竞争可以获得的自由抗体。
抗原抗体之间结合的亲和常数和特异性的测定是决定免疫测定效率的一个关键因素，不仅可用于评价最好的抗原和抗体制备物以备使用，而且一旦确定基本的免疫测定设计就可用于维持质量控制。
抗体 抗体分子属于一个称为免疫球蛋白的血浆蛋白家族，它们的基本组件免疫球蛋白折叠或域，被以各种形式应用于免疫系统和其他生物识别系统的许多分子中。一个典型的免疫球蛋白具有四个多肽链，含有一个称为可变区的抗原结合区和一个称为恒定区的非可变区。
天然的抗体和免疫球蛋白通常是大约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由两个相同的轻(L)链和两个相同的重(H)链组成。每个轻链通过一个共价二硫键与一个重链连接，但不同免疫球蛋白同种型的重链之间二硫键的数目不同。每个重链和轻链也具有规律地隔开的链内二硫桥。每个重链在一端具有一个可变区(VH)，紧随着几个恒定区。每个轻链在一端具有一个可变区(VL)，在另一端有一个恒定区。轻链的恒定区和重链的第一恒定区对齐，并且轻链可变区与重链的可变区对齐。
按照它们重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可分成不同的类别。至少有五(5)个主要的免疫球蛋白类别IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中几个可进一步分成亚类(同种型)，例如IgG-1、IgG-2、IgG-3和IgG-4；IgA-1和IgA-2。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构象众所周知。有关抗体结构、功能、使用和制备方面更详尽的信息在2006年2月14日授权的美国专利No.6,998,241中有讨论，其完整内容在此引入作为参考。
夹心测定 抗体或多抗体夹心测定是本领域技术人员周知的，包括1984年12月4日授权的美国专利No.4,486,530和其中提及的参考文献所公开的那些。图6、7、8和14显示的结构可直接按照描述的使用或以各种夹心形式使用。夹心形式或夹心测定是指使用连续的识别事件来建立起多种生物分子的层，并且使用报告元件来显示特定生物分子的存在。一个标准的实例是抗体的连续使用。在这些测定中，第一抗体结合靶标，第二抗体结合第一抗体，第三抗体可结合第二抗体，以此类推。每一个接续的层都可加上额外的报告基团。另一个策略是重复加入两个(或多个)可互相识别的组分的交替层，或两个以上的链识别关系的组分，其包含一个或两个多聚结构形式的组分。在这样的设置中，每个多聚结构中的一个或多个官能团可用报告基团标记且未被占据的官能团可作为其他组分的识别位点，并且这个系统将随后提供一个信号放大的平台。这种方法的一个典型实例是使用链亲和素-报告分子偶联物和生物素化的抗链亲和素抗体。在此类测定中，生物素化的传感器分子(核酸或抗体)可用于结合靶标生物分子，其随后被含有链亲和素-报告分子偶联物和生物素化抗链亲和素抗体的检测系统识别。通过连续几轮生物素化抗体与标记的链亲和素复合物的相互作用，就可以建立起这种情况中的夹心结构，以实现信号放大。通过多发色团与生物素化抗体或链亲和素报告分子复合物额外偶联，可能进一步增加信号输出。基本上，这种类型的信号放大系统中多发色团的整合可进一步放大信号至更高的水平。
通过直接整合集光多发色团到常用的识别元件中，图6、7、8、14、16和17中描述的生物素化聚合物复合物可用于创建光学增强的夹心试验。多发色团偶联的结构的优点也可以直接应用于第一靶标识别元件而无需连续的识别元件。例如，如图14所示，第一抗体可直接偶联至多发色团-染料复合物上。这种复合物可用于直接探查是否存在靶标生物分子。
多核苷酸 扩增的靶标多核苷酸可进行扩增后处理。例如，在一些例子中，可能需要在杂交之前把靶标多核苷酸片断化来提供更易接近的区段。核酸的片断化可通过任何能产生适合所进行试验的大小的片断的方法来实现；适当的物理、化学和酶方法在本领域中众所周知。
扩增反应可以在至少在部分扩增循环中允许传感器多核苷酸与扩增产物杂交的条件下进行。当以此种模式进行测定时，该杂交事件的实时检测可以通过监测扩增中的光发射来实现。
实时PCR产物分析(和相关的实时逆转录PCR)提供了一种众所周知的实时PCR监测技术，该技术已应用于许多应用中，其可以修改用于此处描述的方法(参见，Laurendeau et al.(1999)″TaqMan PCR-basedgene dosage assay for predictive testing in individuals from a cancer familywith INK4 locus haploinsufficiency″Clin Chem 45(7)982-6；Laurendeau etal.(1999)″Quantitation of MYC gene expression in sporadic breast tumorswith a real-time reverse transcription-PCR assay″Clin Chem59(12)2759-65；和Kreuzer et al.(1999)″LightCycler technology for thequantitation of bcr/abl fusion transcripts″Cancer Research 59(13)3171-4，以上所有内容均在此引入). 样本 原则上，样本可以是任何怀疑含有能够在聚集传感器上引发聚集反应的聚集物的材料。在一些实施方式中，样本可以是任何来源的生物材料，其包含能够从活的生命体(包括细胞、组织或体液)直接或间接获得的多核苷酸，以及由该生命体留下的沉积物，包括病毒、支原体和化石。样本可整体或部分地包含由合成手段制备的聚集物。典型地，获得的样本为主要为水性的介质或分散于主要为水性的介质中。样本的非限制实例包括血液、尿、精液、奶、痰、粘液、口腔拭子、阴道拭子、直肠拭子、抽出液、针吸活检组织、例如通过手术或尸检获得的组织切片、血浆、血清、脊髓液、淋巴液、皮肤外分泌物、呼吸道、消化道、和泌尿生殖道、泪液、唾液、肿瘤、器官、体外细胞培养组分样本(包括但并不局限于细胞在细胞培养基中生长产生的条件培养液、推断被病毒感染的细胞、重组细胞、和细胞组分)、和包含多核苷酸序列的重组库。
样本可为已知含有聚集物或其替代物的阳性对照样本。也可使用阴性对照样本，尽管预期其不含有聚集物，但怀疑其含有聚集物(经由一种或多种试剂的污染)或另一能够产生假阳性的组分，并且其检测是为了确认在特定试验中使用的试剂没有被靶标多核苷酸所污染，以及确定给定的一组试验条件是否产生假阳性(样本中即使没有多核苷酸也产生阳性信号)。
样本可被稀释、溶解、悬浮、提取或进行其他处理来溶解和/或纯化存在的任何靶标多核苷酸或使之能够接近扩增方案中使用的试剂或接近检测试剂。当样本含有细胞时，细胞可被裂解或通透化来释放细胞内的多核苷酸。一步通透化缓冲液可用来裂解细胞，在裂解后允许直接进行进一步的步骤，例如聚合酶链反应。
信号发色团 在一些实施方式中，可采用信号发色团或荧光团，例如来接收从激发态的光活性单元传递的能量，或与标记的探针交换能量，或用于多个能量传递方案中。此处描述的本发明可用的荧光团包括任何能吸收适当波长的能量和发射或传递能量的物质。对于多重试验，多种不同的荧光团可用于可检测地不同的发射光谱。典型的荧光团包括荧光染料、半导体纳米晶体、镧系金属螯合物和绿色荧光蛋白。
荧光染料的例子包括荧光素、6-FAM、罗丹明、德克萨斯红、四甲基罗丹明、羧基罗丹明、羧基罗丹明6G、羧基对甲氨基酚、羧基罗丹明110、Cascade Blue、Cascade Yellow、香豆素、


Cy-Chrome、藻红蛋白、PerCP(多甲藻素叶绿素-a蛋白)、PerCP-Cy5.5、JOE(6-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基荧光素)、NED、ROX(5-(和-6)-羧基-X-罗丹明)、HEX、Lucifer Yellow、Marina Blue、Oregon Green 488、Oregon Green 500、Oregon Green 514、AlexaFluor.RTM.350、Alexa

430、Alexa

488、Alexa

532、Alexa

546、Alexa

568、Alexa

594、Alexa

633、Alexa

647、Alexa

660、Alexa

680、7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸、BODIPY.RTM.FL、

FL-Br2、

530/550、

558/568、

564/570、

576/589、

581/591、

630/650、

650/665、

R6G、

TMR、

TR、其偶联物、和其组合。镧系金属螯合物的例子包括铕螯合物、铽螯合物和钐螯合物。
多种荧光半导体纳米材料(″SCNCs″)在本领域中众所周知；制造和使用半导体纳米材料的方法描述于PCT公开No.WO 99/26299，1999年5月27日公布，发明人为Bawendi等；1999年11月23日授予Weiss等人的USPN 5,990,479；和Bruchez et al.，Science 2812013，1998。半导体纳米材料可具有非常窄的发射谱带和非常明确的峰值发射波长，允许使用大量不同的SCNC在同一试验中作为信号发色团，任选地与其他非SCNC类型的信号发色团组合使用。
多核苷酸特异性染料的例子包括吖啶橙、吖啶同型二聚体、放线菌素D、7-氨基放线菌素D(7-AAD)、9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶(ACMA)、BOBOTM-1碘化物(462/481)、BOBOTM-3碘化物(570/602)、BO-PROTM-1碘化物(462/481)、BO-PROTM-3碘化物(575/599)、4′，6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI)、4′，6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI)、4′，6-二脒基-2-苯基吲哚二乳酸盐(DAPI，乳酸盐)、二氢乙锭(氢乙锭)、二氢乙锭(氢乙锭)、二氢乙锭(氢乙锭)、溴化乙锭、二叠氮氯化乙锭、乙锭同型二聚体-1(EthD-1)、乙锭同型二聚体-2(EthD-2)、一叠氮溴化乙锭(EMA)、碘化己锭(hexidium iodide)、Hoechst 33258、Hoechst33342、Hoechst 34580、Hoechst S769121、羟芪巴脒(hydroxystilbamidine)、甲磺酸酯、JOJOTM-1碘化物(529/545)、JO-PROTM-1碘化物(530/546)、LOLOTM-1碘化物(565/579)、LO-PROTM-1碘化物(567/580)、NeuroTraceTM 435/455、NeuroTraceTM 500/525、NeuroTraceTM 515/535、NeuroTraceTM 530/615、NeuroTraceTM 640/660、OliGreen、

ssDNA、

dsDNA、POPOTM-1碘化物(434/456)、POPOTM-3碘化物(534/570)、PO-PROTM-1碘化物(435/455)、PO-PROTM-3碘化物(539/567)、碘化丙锭、


Light、

Green I、

Green II、

Gold、

101、

102、

103、

DX、TO-

-1、TO-

-3、TO-

-5、

-1、

-3、YO-

-1(噁唑黄)、YO-

-3、

-1、

-3、TO、

Blue、

Green、

Orange、

9、

BC、

40、

41、

42、

43、

44、

45、

Blue、

11、

12、

13、

14、

15、

16、

20、

21、

22、

23、

24、

25、

Green、

80、

81、

82、

83、

84、

85、

Orange、

17、

59、

60、

61、

62、

63、

64、

Red、纺锤菌素、远霉素、吖啶橙、3，4-苯并芘、噻唑橙、TOMEHE、柔红霉素、吖啶、戊基-TOTAB、和丁基-TOTIN。不对称花青染料可作为多核苷酸特异性染料使用。其他感兴趣的染料包括那些描述于下述文献中染料Geierstanger，B.H.and Wemmer，D.E.，Annu.Rev.Vioshys.Biomol.Struct.1995，24，463-493，by Larson，C.J.and Verdine，G.L.，Bioorganic ChemistryNucleic Acids，Hecht，S.M.，Ed.，OxfordUniversity PressNew York，1996；pp 324-346，和Glumoff，T.andGoldman，A.Nucleic Acids in Chemistry and Biology，2nd ed.，Blackburn，G.M.and Gait，M.J.，Eds.，Oxford University PressOxford，1996，pp375-441。多核苷酸特异性染料可为嵌入式染料，且可以是对双链多核苷酸特异性的。其他染料和荧光团在www.probes.com(MolecularProbes，Inc.)中有描述。
术语“绿色荧光蛋白”指天然的多管水母(Aequorea)绿色荧光蛋白和突变形式，二者均被鉴定能呈现改变的荧光特征，包括改变的激发和发射最大值，以及不同形状的激发和发射光谱(Delagrave，S.et al.(1995)Bio/Technology 13151-154；Heim，R.et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9112501-12504；Heim，R.et al.(1995)Nature 373663-664)。Delgrave等人分离了克隆的维多利亚多管水母(Aequorea victoria)GFP突变体，其具有红移激发光谱。Bio/Technology 13151-154(1995)。Heim，R.等人报道了一个突变体(Tyr66突变为His)，其具有蓝色荧光(Proc.Natl.Acad.Sci.(1994)USA 9112501-12504)。
基质 在一些实施方式中，试验组分可置于基质上。基质可包括多种材料，不论是生物学的、非生物学的、有机的、无机的，或上述任一种的组合。例如，基质可为聚合的Langmuir Blodgett膜、功能化的玻璃、Si、Ge、GaAs、GaP、SiO2、SiN4，、改性硅、或多种凝胶或聚合物中的任一种，诸如(聚)四氟乙烯、聚偏二氟乙烯、聚苯乙烯、交联的聚苯乙烯、聚丙烯酸、聚乳酸、聚乙醇酸、丙交酯乙交酯共聚物、聚酐、聚(甲基丙烯酸甲酯)、乙烯乙酸乙烯酯共聚物、聚硅氧烷、聚二氧化硅、乳胶、葡聚糖聚合物、环氧树脂(epoxies)、聚碳酸酯、或其组合。可使用导电聚合物和光导材料。
基质可为平面结晶的基质，诸如基于二氧化硅的基质(例如玻璃、石英，或类似物)，或例如用于半导体和微处理器工业的结晶基质，诸如硅、砷化镓、掺杂铟的GaN和类似物，并且包括半导体纳米晶体。
基质可采用光电二极管、光电传感器诸如光电半导体芯片或光电薄膜半导体、或生物芯片的形式。基质上探针的定位可以寻址；这可以通过高度密集的形式完成，且位置可以微米寻址或纳米寻址。
二氧化硅气凝胶也可被用作基质，且可通过本领域已知的方法制备。气凝胶基质可用作自由直立基质或作为另一种基质材料的表面涂层。
基质可采用任何形式，并且典型地是板、薄片、珠、小球、盘、颗粒、微粒、纳米颗粒、链、沉淀、任选多孔的凝胶、薄层、管、球、容器、毛细管、垫、片、膜、小片、多孔板或皿、光纤等等。基质可为刚性或半刚性的任意形式。基质可含有凸起或凹陷的区域，试验组分定位于此。基质表面可使用众所周知的技术蚀刻，以提供理想的表面特征，例如沟槽、V-沟、阶式(mesa)结构等等。
基质表面可由与基质相同的材料构成或可由不同材料制成，并且可通过化学或物理方法偶联至基质表面。这些偶联的表面可由任何材料构成，例如聚合物、塑料、树脂、多糖、二氧化硅或基于二氧化硅的材料、碳、金属、无机玻璃、膜、或上述列出的任何基质材料。表面可以任选地为透明的并可具有Si-OH官能性，诸如二氧化硅表面上存在的那些。
可以选择基质和/或其任选的表面，来为所用的合成方法和/或检测方法提供适当的特性。基质和/或表面可以是透明的，以允许基质暴露于来自多个方向的光。基质和/或表面可以具有反射“镜”结构，以增加光的回收。
基质和/或其表面一般地对它在使用中暴露的条件有抗性，或被处理为具有抗性，并且能任选地被处理，以在暴露于这些条件后去除任何抗性材料。
可以使用任何适当的方法，将多核苷酸探针制造在基质上或附着在基质上，例如美国专利No.5,143,854，PCT公开No.WO 92/10092，1990年12月6日提交的美国专利申请No.07/624,120(现已放弃)，Fodoret al.，Science，251767-777(1991)，和PCT公开No.WO 90/15070)中描述的方法。使用机械合成策略合成这些阵列的技术在例如PCT公开No.WO 93/09668和美国专利No.5,384,261中均有描述。
另外的技术包括诸如那些在PCT公开No.PCT/US93/04145中描述的基于珠子的技术，和诸如那些在美国专利No.5,288,514中描述的基于针的方法。
适合将传感器多核苷酸附着在基质上的其它流动槽和点样方法在1992年11月20日提交的美国专利申请No.07/980,523和美国专利No.5,384,261中描述。试剂通过以下方法被传送至基质(1)在预定区域上设定的槽内流动，或(2)在预定区域上“点样”。在将要保护的基质的部分上可使用诸如亲水性或疏水性涂层的保护性涂层(取决于溶剂的性质)，有时与在其他区域有利于反应剂溶液湿润的其他材料组合。以此种方式，进一步防止了流动的溶液流出指定的流动路径之外。
典型的分配器包括任选机器控制的微量移液器、喷墨打印机、一套试管、多歧管、一套移液器，等等，以便于将多种试剂先后或同时被传送至反应区域。
基质或其区域可被编码，以便可以确定所查询的位于基质或区域中的传感器的身份。任何适当的编码方案都可采用，例如光学码、RFID标签、磁性码、物理码、荧光码、和组合码。
激发和检测 任何仪器，如果它能够提供能激发聚集传感器同时短于待检测发射波长的波长，都能用于激发。可商购的装置可提供适当的激发波长以及适当的检测元件。
激发源的例子包括宽带UV光源，诸如带有合适滤光片的氘灯，白光源输出，诸如经过单色光镜来提取出所需波长的氙灯或氘灯，连续波长(cw)气体激光器，固态二极管激光器，或任何脉冲激光器。发射光可通过任何适当装置或技术来检测；许多适当的方法在本领域内众所周知。例如，荧光计或分光光度计可被用于检测待测样本在多发色团被激发时是否发出信号发色团所特有的波长的光来。
物质的组合物 还提供了此处描述的任何分子的任何形式的物质组合物。此处描述的多发色团和包含多发色团的复合物可以以纯化和/或分离的形式提供。多发色团和包含多发色团的复合物可以以晶体形式提供。
多发色团和包含多发色团的复合物可以在溶液中提供，该溶液可以是主要为水的溶液，其可包含一种或多种此处描述的额外溶液组分，包括但不限于额外的溶剂、缓冲液、生物分子、多核苷酸、荧光团等。多发色团和包含多发色团的复合物在溶液中以一定浓度存在，在该浓度下来自于第一光活性单元的第一发射在不存在生物分子靶标或与其相关的生物分子的情况下可被检测到。溶液可包含如此处所述的额外的组分，包括标记的探针，诸如荧光标记的抗体或多核苷酸，它们对于一类生物分子靶标或其相关生物分子是特异性的，用于多发色团和包含多发色团的复合物。
多发色团和包含多发色团的复合物可以以膜的形式提供。物质的组合物可通过任何此处描述的性质来要求保护，包括根据提出的结构、通过合成方法、通过吸收和/或发射光谱、通过元素分析、通过NMR光谱、或通过任何其他性质或特征。
在一些实施方式中，可在样本中检测基因的表达。在一个进一步的实施方式中，检测生物分子靶标或与其相关的生物分子的测量结果可用于诊断患者的疾病状态。在另一个实施方式中，本发明的检测方法可进一步包括诊断疾病状态的方法。在一个相关的实施方式中，诊断疾病的方法可包括检查和分析关于生物分子靶标或与其相关的生物分子是否存在的数据，并对患者、医务人员或医疗卫生管理者提出结论，该结论是基于检查和分析关于疾病诊断的数据而作出的。检查和分析此类数据可通过使用此处描述的计算机或其他数字装置和网络来得到协助。可以预想关于此类数据的信息可通过网络来传递。
在实践本发明的方法的过程中，任选地使用许多分子生物学的常规技术。这些技术众所周知且在例如下述的出版物中阐述Ausubel et al.(Eds.)Current Protocols in Molecular Biology，Volumes I，II，and III，(1997)，Ausubel et al.(Eds.)，Short Protocols in Molecular BiologyA Compendiumof Methods from Current Protocols in Molecular Biology，5th Ed.，JohnWiley & Sons，Inc.(2002)，Sambrook et al.，Molecular CloningALaboratory Manual，3rd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press(2000)，and Innis et al.(Eds.)PCR ProtocolsA Guide to Methods and Applications，Elsevier Science & Technology Books(1990)，以上所有出版物均在此引入作为参考。
图22是一个流程图，显示了一个代表性逻辑装置实例，通过该装置可实现检查和分析关于本发明的数据。此类数据可与受试者的疾病、紊乱或状况相关。图22显示了一个连接至仪器820的计算机系统(或数字装置)800，它们与多发色团和多发色团复合物824一起使用，例如用来产生结果。可以把计算机系统800理解为一个可以读取来自介质811和/或网络接口805的指令的逻辑装置，网络接口805可以任选地连接至具有固定介质812的服务器809。图22显示的系统包括CPU801、磁盘驱动器803、光输出装置如键盘815和/或鼠标816和任选的监视器807。可通过示出的通讯介质与当地或远程的服务器809实现数据通讯。通讯介质可包括任何传输和/或接收数据的手段。例如通讯介质可以是网络连接、无线连接或因特网连接。可以预想关于本发明的数据可通过此类网络或连接来传输。
在一个实施方式中，计算机可读介质包括适合传输生物学样本分析结果的介质。该介质可包括关于患者的疾病状况或状态的结果，其中此结果是使用此处描述的方法获得的。
试剂盒 还提供了包含用于实施所述方法的试剂的试剂盒。
在一些实施方式中，试剂盒包含多种试剂，该试剂包括多发色团或多发色团复合物，生物偶联物，例如抗体，和其他此处描述的组分。
试剂盒可以任选地含有一种或多种下述物质一种或多种标记物，其可整合到多发色团或多发色团复合物中；和一个或多个基质，其可以含有或不含有阵列，等等。
试剂盒的组分可容纳在外包装中。关于使用试剂盒进行所述方法的说明可与外包装一起提供，并且可以任何固定介质来提供。说明可放在外包装内或外包装以外，并且可印在构成外包装的任何表面的内部或外部，使得说明清晰可见。试剂盒可以是多重形式，用于检测一种或多种不同靶标生物分子或与其相关的生物分子。
如此处所述并且如图23中所示，在一些实施方式中，试剂盒903可包括容器或外包装902用来容纳各种组分。如图23所示和此处所述，在一个实施方式中，试剂盒903包含一种或多种多发色团或多发色团复合物试剂905，并且任选地提供基质900。如图23所示和此处所述，试剂盒903可以任选地包括说明901。可以想到试剂盒903的其他实施方式，其中组分包括多种额外的此处描述的物质。
实施例 实施例1. 使用聚合物-染料偶联的抗体的夹心ELISA方法的总体方案 1.向96孔聚氯乙烯(PVC)微孔板的每孔中加入大约50μL抗体溶液(20μg/mL，在PBS中)，以此使未标记的抗体结合至每孔的底部。PVC将结合大约100ng/孔(300ng/cm2)。使用的抗体量取决于各个试验。
2.在4℃下过夜孵育微孔板来确保完全结合。
3.用PBS漂洗微孔两次。
4.微孔板上剩余的蛋白质结合位点必须通过用封闭缓冲液孵育而达到饱和。向孔中添加含0.02％叠氮化钠的3％BSA/PBS至顶部。在室温潮湿气氛下孵育2小时至过夜。
5.用PBS漂洗微孔两次。
6.向孔中加入50μL抗原(或样本)溶液(抗原溶液必须滴定)。所有稀释须在封闭缓冲液(3％BSA/PBS)中进行。在室温潮湿气氛下孵育至少2小时。
7.用PBS洗板四次。
8.加入过量的聚合物-染料-第二抗体偶联物(实例A或C)或生物素标记的抗体。
9.在室温潮湿气氛下孵育2小时或更长时间。
10.更换几次PBS漂洗。
11.当在步骤8中使用生物素标记的抗体时，加入链亲和素-聚合物-染料偶联物(实例B或D，在含有1M NaCl的PBS中)，并且在室温潮湿气氛下孵育2小时或更长时间。
12.用ELISA读板仪在目标波长下测量光密度。
对于定量结果，将未知样本的信号与标准曲线比较。每次试验都必须运行标准品以确保准确性。
在该ELISA试验中，第一抗体分子可结合于微孔板孔的侧面和底部。当含有靶标分子的样本加入到孔中时，固定的第一抗体将仅捕获这些靶标，而样本中其余的组分将被洗去。与常用的荧光标记抗体相比，由于它们更高的集光能力和它们能获得更好能量传递效率的同一分子内设计，所述的聚合物-染料-第二抗体偶联物可发出比常规方案更强的信号(10-100倍)。这些优点也可以转化为具有更高灵敏度的测定。当进一步把聚合物-染料-第二抗体偶联物与其他具有信号放大功能部分的第二抗体(例如辣根过氧化物酶标记的抗体)相比，聚合物-染料-第二抗体偶联物可提供一步过程(无需额外的酶底物)来达到信号放大的目的。也可以预期所述偶联物的成本效率(无论是时间还是材料)具有更好的市场接受性。
实施例2. 用聚合物-染料偶联的抗体标记的微阵列的总体方案 1.制备总RNA或mRNA。
2.使用T7-oligo(dT)引物来实现一步循环或两步循环cDNA合成。
3.清洗双链cDNA。
4.使用IVT(体外转录)扩增试剂盒将生物素标记的核糖核苷酸整合到cRNA中。
5.将cRNA片断化。
6.在芯片上杂交cRNA片断。
7.洗掉残余的cRNA，并且用链亲和素-聚合物-染料偶联物(实例B或D)对芯片染色。
8.洗掉芯片上残余的试剂。
9.扫描微阵列。
在微阵列方法学的常规实践中，将生物素标记的核苷酸整合至cRNA序列中是隔离链亲和素藻红蛋白偶联物和生物素化抗链亲和素抗体用于放大的信号报告的手段。由于链亲和素藻红蛋白偶联物生产的复杂性，批间差异是显著的。因此，链亲和素-聚合物-染料偶联物可为链亲和素藻红蛋白偶联物的一个非常好的替代物。况且，此前的出版物已经证明，通过它的集光和能量传递功能部分，多发色团可将荧光信号放大高达75倍。有理由预期，链亲和素-聚合物-染料偶联物可具有等同于或优于藻红蛋白的表现。
本发明优选的实施方式已经在此显示并描述，但是本领域技术人员应当明了这些实施方式只是作为例子提供。在不背离本发明的前提下本领域技术人员将会想到许多变动、变化和替代。应当理解在实施本发明中可采用此处描述的本发明实施方式的多种替代方案。可以预期下面的权利要求限定了本发明的范围，因此涵盖这些权利要求的范围内的方法和结构以及它们的等同物。
实施例3. 具有胺官能团的阳离子偶联聚合物CA001的合成
1-(4’-邻苯二甲酰亚氨基丁氧基)-3，5-二溴苯在己烷中再结晶3，5-二溴苯酚(970mg，3.85mmol)。去除溶剂后，加入N-(4-溴丁基)邻苯二甲酰亚胺(1.38g，4.89mmol)、K2CO3(1.88g，13.6mmol)、18-冠-6(53mg，0.20mmol)和丙酮(20mL)。回流1小时，然后倒入100mL水中。使用二氯甲烷(4×30mL)萃取水相。合并有机相，用水、饱和NaHCO3和盐水洗涤，然后用MgSO4干燥，过滤。溶剂的去除产生白色固体，通过柱层析(4∶1己烷∶CH2Cl2)纯化，接着在己烷中再结晶，产生无色针状物(650mg，87％)。1H NMR(CDCl3)7.860(m，2H)；7.733(m，2H)；7.220(t，J＝1.6Hz，1H)；6.964(d，J＝2.0Hz，2H)；3.962(t，J＝6.0Hz，2H)；3.770(t，J＝6.6Hz，2H)；1.846(m，4H)。

[(2，7-{9，9-二(4’-(磺酸钠)丁基)}芴-交替共聚-1，4-{2，5-二氟}亚苯基)-共聚-(2，7-{9，9-二(4’-(磺酸钠)丁基)}芴-交替共聚-3，5-1-{4’-邻苯二甲酰亚胺基丁氧基)亚苯基)]共聚物在一个100mL的装备有水套回流冷凝器的圆底烧瓶中，2，7-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-9，9-二(6′-溴己基)芴(1.001g，1.34mmol)、1，4-二溴-2，5-二氟苯(346.6mg，1.274mmol)、1-(4’-邻苯二甲酰亚胺基丁氧基)-3，5-二溴苯(30.8mg，0.068mmol)、碳酸钾(2.15g，15.5mmol)和四(三苯基膦)钯(0)(37.2mg，0.032mmol)在THF(45mL)和水(15mL)中的溶液经由四个冷冻-抽气-融解循环脱气，在第三和第四轮脱气后引入氩。然后将溶液在氩气氛下加热回流48小时。冷却后，将溶液滴加至40mL搅拌的甲醇中，以沉淀聚合物，离心收集。然后用甲醇滗析和洗涤(两次)以去除低分子量组分，产生浅黄色蓬松粉末(500mg，62％)。1H NMR(CD2Cl2)7.912-7.419(m，8H)；3.322(t，J＝7.4Hz，4H)；2.120(br s，4H)；1.693(t，J＝7.0Hz，4H)；1.237(br s，4H)；1.153(br s，4H)；0.788(br s，4H).Mn 17K，PDI 2.1。
[(2，7-{9，9-二(6’-(N，N，N-三甲基溴化铵)己基)}芴-交替共聚-1，4-{2，5-二氟}亚苯基)-共聚-(2，7-{9，9-二(6’-(N，N，N-三甲基溴化铵)己基)}芴-共聚-alt-3，5-1-{4’-邻苯二甲酰亚胺基丁氧基)亚苯基)]共聚物将三甲胺(1mL)减压浓缩至[(2，7-{9，9-二(6’-溴己基)}芴-交替共聚-1，4-{2，5-二氟}亚苯基)-共聚-(2，7-{9，9-二(6’-溴己基)}芴-共聚-alt-3，5-1-{4’-邻苯二甲酰亚胺基丁氧基)亚苯基)]共聚物(130mg，0.215mmol)在THF(10mL)中的溶液中。将溶液搅拌24h，此时聚合物从溶液中沉淀出来。加入甲醇(50mL)溶解聚合物，然后另外1mL的三甲胺减压浓缩至反应瓶中。再搅拌24小时，然后在减压状态下去除所有溶剂和多余的三甲胺，产生淡黄色膜(140mg，90％)。1H NMR(D2O)7.871-7.423(m，8H)；3.148(m，4H)；2.970(br s，18H)；2.116(br s，4H)；1.525(br s，4H)；1.119(br s，8H)；0.681(br s，4H)。
CA001，[(2，7-{9，9-二(6’-(N，N，N-三甲基溴化铵)己基)}芴-交替共聚-1，4-{2，5-二氟}亚苯基)-共聚-(2，7-{9，9-二(6’-(N，N，N-三甲基溴化铵)己基)}芴-交替共聚-3，5-1-{4’-氨基丁氧基)亚苯基)]共聚物将肼一水合物(73.1mg，1.46mmol)、[(2，7-{9，9-二(6’-(N，N，N-三甲基溴化铵)己基)}芴-交替共聚-1，4-{2，5-二氟}亚苯基)-共聚-(2，7-{9，9-二(6’-(N，N，N-三甲基溴化铵)己基)}芴-交替共聚-3，5-1-{4’-邻苯二甲酰亚胺基丁氧基)亚苯基)]共聚物(100mg，0.137mmol)在甲醇(10mL)中的溶液回流5小时。冷却至室温后，向溶液中加入0.9mL 1M HCl，然后再回流2小时。产生的溶液在50％甲醇水溶液中透析，然后蒸发至干。
确定了一种评估功能化单体整合至最终聚合物结构中的方法。在聚合反应过程中胺官能团作为邻苯二甲酰亚胺被保护以防止催化剂污染。该保护基在红外(IR)光谱中具有独特的特征，在图24中显示为实线。显示的峰对应于仅有邻苯二甲酰亚胺保护基才呈现的独特的C＝O峰。邻苯二甲酰亚胺基后续的脱保护(产生自由的胺)产生CA001 IR特征，缺少邻苯二甲酰亚胺的特征C＝O峰(虚线，图24)，显示可用于偶联的活性胺。
CA001的光谱显示于图25中，其中实线表示吸光度，虚线表示发射光谱。
实施例4. 阳离子偶联聚合物-FAM偶联物CA001-FAM的合成 脱保护的聚合物CA001(具有自由胺)与琥珀酰亚胺酯FAM，5(6)FAM-SE(Invitrogen，#C1311)反应，该反应采用www.invitrogen.com(最后一次浏览日期10/04/07)的方案的修改方案。作为阴性对照，相同聚合物与荧光素(无反应基团)在相同反应条件下孵育。这个步骤的方案如下。
NHS-FAM与CA001的偶联 目的 用NHS-FAM将CA001生物素化，并证明向共价偶联的染料的FRET。
材料 荧光计，具有UV可穿透的比色杯 UV-可见光仪器 纯化的CA001 NHS-FAM(Invitrogen#C-1311) 0.5M NEt3(母液(7.2M)NEt3的1∶14稀释液) MC30过滤器 步骤 1.用10倍XS的NH-FAM至胺-聚合物中建立反应。每10uL反应液使用50ug聚合物和8.0ug NHS-FAM 2.当除染料外的所有试剂都混合后，在DMSO中以130uL无水DMSO/mg染料溶解1-2毫克染料。溶解后立即使用NHS-试剂。
3.在热模块上25℃孵育30min。
4.在90M1T中稀释(10uL于400ul中) 5.用MC30脱盐两次 6.用UV/可见光分析浓度 产生的每个反应产物的荧光光谱显示于图26中。阳性对照产生的荧光显示为实线。当聚合物被激发时，发生向受体染料(现在已共价结合至聚合物)的FRET，导致强烈的荧光发射。阴性对照产生的荧光显示为虚线。因为阴性对照的荧光素无法结合聚合物，当聚合物被激发时，不发生FRET，只观测到聚合物发射。这些数据表明CA001上的胺可用于偶联。
实施例5. 生物素化偶联聚合物生物素基-CA001的合成
使用来自于Pierce的NHS-生物素连接体(#20217)，将CA001上的胺官能团转换为生物素官能团。这个步骤的方案根据可见于Pierce网站www.piercenet.com(最后一次访问日期09/23/2007)的Pierce方案改良。这个步骤的方案类似地沿用实施例12中所述的方案。
实施例6. 通过生物素基-CA001、亲和素DN和生物素基-荧光素放大信号的步骤 目的 使用生物素基-CA001、亲和素DN和生物素基-荧光素，证明经由FRET的荧光素信号放大。
材料 NanoDrop荧光计 Perkin-Elmer荧光计，型号PE-LS55 UV-可穿透的1-ml塑料比色杯 移液器+吸头 生物素基-CA001(BCA) CA001(CA) 生物素基-荧光素(BFL) 亲和素DN(ADN) TBS 步骤 1.在一个Eppendorf试管中，混合下表中列出的试剂。确保最后添加AND并且在添加DNA之前混匀其他试剂。在荧光计测量之前将混合物稀释100倍，对于Nanodrop是将1uL加至100uL，对于台式荧光计是将10uL加至1mL。
2.在488nm直接激发荧光以及通过在380nm激发聚合物经由FRET间接激发。
3.在相关波长下采集关于峰高度的数据。从峰高度中减除背景，包括这些来源。
3a)仅有缓冲液的对照。
3b)从FRET至荧光素峰的聚合物峰尾(～5％)。
实施例7. 对生物素基-CA001、亲和素DN和生物素基-荧光素放大信号的分析 图27A显示了CA001的生物素化。胺聚合物CA001(生物素基聚合物的前体)不结合亲和素，并且作为阴性对照聚合物。图27B示意性地描述了该试验。生物素化染料和聚合物通过生物素-亲和素结合被特异性地结合在一起。阴性对照聚合物(胺聚合物CA001，标注为CA)不结合亲和素。图27C显示了沿用上述方案(实施例6)进行的试验产生的荧光光谱。虚线显示了在含有亲和素DN(AvDN)和生物素化荧光素(B-F1)的溶液中非特异性聚合物(CA)在380nm激发时的荧光光谱。仅观测到聚合物的发射，以420nm为中心。实线显示的是在含有亲和素DN(AvDN)和生物素化荧光素(B-F1)的溶液中生物素化聚合物(BCA)在380nm激发时的荧光光谱。观测到强烈的能量传递，引起来自于荧光素的额外发射，以530nm为中心。仅生物素基-CA001发生FRET，意味着供体生物素基-CA 001和受体荧光素通过生物素-亲和素结合被拉近至较近的距离。这就证实了沿用Pierce步骤(实施例5)的CA001的生物素化。染料在488nm的直接激发显示为虚线。比较虚线和实线揭示出间接激发(经由FRET)比直接激发，染料信号放大了19倍。
实施例8. 具有羧酸酯官能团的阳离子偶联聚合物前体CC001的合成
[(2，7-{9，9-二(6’-溴己基)}芴-交替共聚-1，4-{2，5-二氟}亚苯基)-共聚-(2，7-{9，9-二(6’-溴己基)}芴-共聚-alt-3，5-1-{7’-乙酯庚氧基)亚苯基)]共聚物在一个装备有水套回流冷凝器的50mL圆底烧瓶中，2，7-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-9，9-二(6′-溴己基)芴(500mg，0.670mmol)、1，4-二溴-2，5-二氟苯(173.2mg，0.637mmol)、1-(7’-乙酯庚氧基)-3，5-二溴苯(13.6mg，0.033mmol)、碳酸钾(1.12g，8.12mmol)和四(三苯基膦)钯(0)(21mg，0.018mmol)在THF(15mL)和水(5mL)中的溶液经由四个冷冻-抽气-融解循环脱气，在第三和第四轮脱气后引入氩。然后将溶液在氩气氛下加热回流48小时。冷却后，将溶液滴加到40mL搅拌的甲醇中以沉淀聚合物，离心收集。然后用甲醇滗析和洗涤(两次)来去除低分子量组分，产生浅黄色、蓬松粉末。1H NMR(CD2Cl2)7.887-7.406(m，8H)；3.322(t，J＝6.6Hz，4H)；2.080(br s，4H)；1.710(t，J＝7.0Hz，4H)；1.269(br s，4H)；1.158(br s，4H)；0.799(br s，4H).Mn 39.5K，PDI 2.1。
IR光谱用于评估功能化单体向最终聚合物结构中的整合。在聚合反应过程中羧酸官能团作为酯被保护以防止催化剂污染。该保护基在红外(IR)光谱中具有独特的特征，如图28所示。显示的峰对应于仅有羧酸酯保护基才呈现的独特的C＝O峰。图28中的虚线对应于单体的IR光谱，而实线对应于聚合物的IR光谱。在两种情况中，都观测到羧酸酯的峰，表明功能性单体的整合。
实施例9. 具有胺官能团的阴离子偶联聚合物AA003的合成
[(2，7-{9，9-二(4’-(磺酸钠)丁基)}芴-共聚-alt-1，4-{2，5-二氟}亚苯基)-共聚-(2，7-{9，9-二(4’-(磺酸钠)丁基)}芴-共聚-alt-3，5-1-{4’-邻苯二甲酰亚胺基丁氧基)亚苯基)]共聚物在一个100mL的装备有水套回流冷凝器的圆底烧瓶中，2，7-二溴-9，9-二(4′-(磺酸钠)丁基)芴(129.5mg，0.202mmol)、1，4-二硼酸(37.4mg，0.225mmol)、1-(4’-邻苯二甲酰亚胺基丁氧基)-3，5-二溴苯(10.4mg，0.023mmol)、碳酸钾(366mg，2.65mmol)和四(三苯基膦)钯(0)(8.8mg，0.008mmol)在DMF(20mL)和水(20mL)中的溶液经由四个冷冻-抽气-融解循环脱气，在第三或第四轮脱气后引入氩。然后将溶液在氩气氛下加热回流48小时。在反应进程中，形成黑色沉淀。冷却后，去除溶液并用丙酮洗涤沉淀，产生棕色粉末。1H NMR(DMSO)7.910-7.597(m，10H)；2.206(br s，8H)；1.400(br s，4H)；0.668(brs，4H).IR1696cm-1，表明为被保护的胺(邻苯二甲酰亚胺)。
AA003，[(2，7-{9，9-二(4’-(磺酸钠)丁基)}芴-共聚-alt-1，4-{2，5-二氟}亚苯基)-共聚-(2，7-{9，9-二(4’-(磺酸钠)丁基)}芴-共聚-alt-3，5-1-{4’-氨基丁氧基)亚苯基)]共聚物将肼一水合物(29.9mg，0.598mmol)和[(2，7-{9，9-二(4’-(磺酸钠)丁基)}芴-交替共聚-1，4-{2，5-二氟}亚苯基)-共聚-(2，7-{9，9-二(4’-(磺酸钠)丁基)}芴-交替共聚-3，5-1-{4’-氨基丁氧基)亚苯基)]共聚物(45mg，0.081mmol)在50％甲醇/水(5mL)中的溶液回流5小时。冷却至室温后，用1M HCl调节溶液的pH至3，然后回流另外2小时。冷却并转移至15mL Falcon管中后，用下述方案纯化AA003。
纯化脱保护的AA003 目的 富集胺活化的阴离子聚合物 材料 UV-可穿透的1-mL塑料比色杯 离心机 UV-可见光分光光度计 移液器+吸头 NaOH，1.0M，0.1mL NaOH，10M 10uL H2O90uL 粗AA003 90％MeOH，1％T20(90M1T，50mL) MC30过滤器 步骤 1.分选组分 1a)如果有一层膜衬在试管内部(沉淀的聚合物)，把上清液倒入一个新试管中。用移液器吸头彻底去除所有上清液，置于一边。
1b)处理衬在试管内的膜(ppt) i.加入0.5mL水并用石蕊检测pH。如果需要，通过添加NaOH(开始用1-5uL 0.1M NaOH，然后更实际地，用1.0M NaOH)、混合、沉淀(pellet)、石蕊检测，中和至pH～7-8。重复几个添加-混合-沉淀-检测pH试验循环，直至pH保持于8。
ii.去除水萃取物，并放置在一个1.5mL离心管中。
iii.在14krcf下离心2’。保留上清和沉淀物。
iv.将沉淀物冻干。
1c)处理来自于步骤1a)的上清液 i.取0.5mL上清液(通常是悬浮液)并放在一个1.5mL离心管中。
ii.用石蕊测pH并记录pH。
iii.如上述步骤1b1一样中和至pH～7-8。
iv.在14krcf下离心2’。
v.从沉淀物中分离上清液，保留两者。
vi.将沉淀物冻干。
vii.在最小量的无水DMSO中重新悬浮沉淀物。
viii.在水中进行UV/可见光光谱测量，并记录吸光度，使用有效的消光系数计算所有组分的浓度。
2.用MC30脱盐。
AA003的光学光谱显示于图29中，其中实线表示吸光度，虚线表示发射光谱。脱保护的聚合物AA003(有一个自由胺)与一个琥珀酰亚胺酯FAM，5(6)FAM-SE(Invitrogen，#C1311)反应，反应方案由来自www.invitrogen.com(最后一次浏览日期10/04/07)的方案修改。作为阴性对照，相同聚合物与荧光素(无反应基团)在相同反应条件下孵育。这个步骤的方案类似地沿用实施例4的方案。
实施例10. 具有马来酰亚胺官能团的阴离子偶联聚合物AA003-M01的合成
多发色团上的胺官能团可使用双功能连接体如GMBS转化成其他官能团。采用此策略来将AA003转化成AA003-M01。这个步骤的方案是对可见于Pierce网站www.piercenet.com(最后一次访问日期09/23/2007)的Pierce方案的改良。使用的方案如下。
将GMBS偶联至AA003 目的 用GMBS将AA003功能化来产生马来酰亚胺部分 材料 离心机 UV-可见光分光光度计 UV-可穿透的1-mL比色杯 移液器+吸头 AA003 GMBS(Pierce#22309) 90％MeOH，1％T20(90M1T，50mL) DMSO NEt3 MC30过滤器 步骤 1.用马来酰亚胺使AA003功能化，下面是使用的量 1a)对于40X XS，使用0.3mM聚合物和12mM GMBS。这意味着3.0nmol聚合物/10uL反应液如下 2.当除连接体以外所有试剂都混合后 2a)在DMSO中溶解GMBS(在溶解后不要立刻使用GMBS) i.120mM GMBS＝3.4mg/0.1mL DMSO，或30uL/mg 2b)在热模块上25℃孵育30min。检查澄清度。
3.用MC30去除XS GMBS 3a)在加至MC杯之前，稀释DMSO到＜5％ 3b)分别合并每个反应w/400uL 90M1T 3c)加至杯中 3d)以14k rcf离心10min 3e)通过估计滞留物体积来确定是否需要离心更长的时间 3f)弃掉滤液 3g)再加入400uL 90M1T并且重复离心 3h)如果滞留物看上去近乎干燥，加入20uL 90M1T并在杯中稍许振荡 3i)颠倒并离心收集滞留物 3j)测量最终滞留物体积＝______uL 3k)通过UV-可见光来确定浓度，然后在0.5X 90M1T中调整最终浓度至25uM。
实施例11. 阴离子偶联聚合物-荧光素偶联物AA003-M01-F1的合成 采用来自www.invitrogen.com(最后一次访问日期10/04/07)的修改方案，通过与SAMSA-荧光素(Invitrogen)反应，来检测AA003-M01上的马来酰亚胺官能团的硫醇反应性。AA003用作阴性对照。修改的方案如下。
对马来酰亚胺的SAMSA试验 目的应用10X XS SAMSA-荧光素至AA003-M01，来确定AA003-M01具有活性马来酰亚胺部分 材料 离心机 UV-可穿透的1-mL比色杯 荧光计，型号PE-LS55 移液器+吸头 磷酸钾，0.5M，pH 7.0，0.2mL K2HPO4，1M62uL KH2PO4，1M39uL H2O 100uL HCl，6M，0.2mL H2O 0.1mL HCl，12M 0.1mL NaOH，0.1M，1mL NaOH，10M 10uL H2O990uL AA003 AA003-M01 SAMSA-荧光素(Invitrogen，产品A685) MC30过滤器 步骤 1.制备1.0mM脱保护的SAMSA 1a)溶解1.0mg SAMSA于95uL 0.1M NaOH中(20mM SAMSA) 1b)室温孵育15min来去除乙酰基保护基 1c)用6M HCl1.4uL/mg SAMSA中和(20mM SAMSA) 1d)用20uL 0.5M磷酸钠，pH 7/mg SAMSA缓冲(16mMSAMSA) 1e)用水稀释16倍至1.0mM SAMSA 2.加入以下物质建立反应 2a)对于AA003-M01添加10uL 1.0mM脱保护的SAMSA至10uL 25uM AA003+GMBS(3.k+G来自于实施例10中的方案)中 2b)对于AA003添加10uL 1.0mM脱保护的SAMSA至10uL25uM AA003-GMBS(3.k-G来自于实施例10中的方案)中 3.在热模块上25℃孵育30min 4.用MC30去除XS SAMSA 4a)在加至MC杯之前，稀释DMSO到＜5％ 4b)分别合并每个反应w/400uL 90M1T 4c)加至杯中 4d)以14k rcf离心10min 4e)通过估计滞留物体积来确定是否需要离心更长的时间 4f)弃掉滤液 4g)再加入400uL 90M1T并且重复离心 4h)如果滞留物看上去近乎干燥，加入20uL 90M1 T并在杯中稍许振荡 4i)颠倒并离心收集滞留物 5.在488和380下激发来自步骤4.i的AA003-M01和AA003，分析荧光。
图30C显示了该试验的结果。AA003-M01(图30B，标注为马来酰亚胺功能化聚合物)和阴性对照聚合物(无马来酰亚胺，AA003，图30A，标注为阴性对照聚合物)与硫醇化的荧光素(SAMSA-荧光素)按照上述步骤反应。马来酰亚胺功能化的聚合物AA003-M01与硫醇化荧光素反应，并且变成与该荧光素共价结合，确保了在供体聚合物和受体染料之间固定的距离。由此，聚合物的激发导致了向受体染料的FRET，并且观测到强烈的染料发射(图30C，实线)。阴性对照不与荧光素共价结合，并且当聚合物被激发时，仅观测到聚合物的发射(图30C，虚线)。
实施例12. 生物素化阴离子偶联聚合物生物素基-AA003的合成
使用可获自Pierce(#20217)的NHS-生物素连接体，将AA003上的胺官能团转换成生物素。该步骤的方案是对可见于Pierce网站www.piercenet.com(最后访问日期09/23/2007)的Pierce方案的改良。使用的方案如下。
将NHS-生物素偶联至AA003的步骤 目的 用NHS-生物素将AA003生物素化 材料 荧光计，具有UV可穿透的比色杯 UV-可见光分光光度计 纯化的AA003(AA3) NHS-生物素(Pierce#20217) 0.5M NEt3(母液(7.2M)NEt3的1∶14稀释液) DMSO MC30过滤器 步骤 1.建立反应，0.5mM聚合物和20mM NHS-生物素 2.当除生物素以外的所有组分都混合后，在DMSO中以15uL无水DMSO/mg NHS-生物素的量(或1.7mg/0.025mL；200mM)溶解1-2mg NHS-生物素。溶解后立即使用NHS-试剂。
3.在热模块上25℃孵育30min。
4.于90M1T中1∶100稀释(1uL加至100uL，或4uL加至400uL) 5.用MC30脱盐，两次 6.用UV/可见光分析浓度 实施例13. 由生物素基-AA003和亲和素D-荧光素放大信号的步骤 目的 证明使用生物素基-AA003和亲和素D-荧光素经由FRET产生的特异性荧光信号。
材料 荧光计(NanoDrop或Perkin-Elmer PE-LS55) UV-可穿透的塑料1-mL比色杯 移液器+吸头 生物素基-AA003(BAA) AA003(AA) 亲和素D-荧光素(A-F1) TBS 步骤 1.在一个eppendorf管中，混合列于下表中的试剂。孵育五分钟，然后在荧光计测量之前将该混合物稀释100倍，对于NanoDrop是将1uL加至100uL，对于台式荧光计是将10uL加至1mL。
2.在488nm处直接激发A-F1以及通过在380nm处激发聚合物经由FRET间接激发。
3.在相关波长下采集关于峰高度的数据。从峰高度中减除背景，包括这些来源。
3a)仅缓冲液的对照 3b)从FRET到荧光素峰的聚合物峰尾(～5％)。
实施例14. 由生物素基-AA003和荧光素标记的亲和素D引起的信号放大的分析 该试验的步骤在实施例13中描述。该试验的示意图显示于图31B中。生物素基-AA003(参见图31A，标注为生物素基聚合物)与荧光素标记的亲和素D孵育。作为阴性对照，胺聚合物AA003(参见图31A，标注为阴性对照聚合物)以同样方式与荧光素标记的亲和素D孵育。在每种情况下，聚合物被激发，并且观测到荧光素发射。对于阴性对照AA003，仅观测到聚合物的发射(以420nm为中心)，而对于生物素基-AA003，观测到强烈的染料发射。
该试验的结果显示于图32A-B中。用每个亲和素含4个染料的亲和素D检测生物素基-AA003。也记录来自于对照聚合物和单独的染料的信号，并且显示于图32A-B中。图32A显示了产生的荧光光谱。来自于该数据集的在523nm处的染料信号总结于图32B中。
这些数据表明，该荧光素信号(在523nm处)在聚合物存在的情况下被放大了(图32A，左侧，实线对比虚线光谱，和右侧，生物素基-AA003对比单独的染料)，并且观测到的信号是由于特异性的聚合物-亲和素D复合物(图32A，左侧，实线对比虚线光谱，和右侧，生物素基-聚合物对比对照)。胺聚合物对照(无生物素)不能结合亲和素，并且由此观测到最小的能量传递(88％特异性)。特异性定义为1-(对照信号/特异性染料信号)。右图显示了在有或无聚合物条件下以及阳性和阴性对照样本之间染料信号的不同。图32B显示的数据是对缓冲液和聚合物尾产生的信号校正后的。聚合物尾在523nm处的贡献是聚合物在419nm处峰高的5％。
实施例15. 不同染料亲和素D比的放大效果 测试了聚合物与染料的不同比例。这是用来自于VectorLaboratories的、每个亲和素平均含有0.8、1.5和4个荧光素染料的亲和素D偶联物来评估的。当染料数目增加时，聚合物和染料之间的消光系数(吸光度)比就减少。因此对于这套荧光素标记的亲和素D，预测在含有最少数目染料的亲和素偶联物上观测到最佳放大值。在每个亲和素D两当量聚合物时聚合物浓度保持恒定。
图33A-B显示的数据表明预计依赖于聚合物与染料的比例。在恒定的聚合物和亲和素浓度下，通过增加每亲和素D上染料的数目，该比例会发生变化。数据表明当染料亲和素比从0.8增加至4时，染料信号强度增加(图33A)，而观测到的放大作用下降(图33B)。当染料数目增加时，由于较高吸光度以及较高的荧光引起的直接染料信号也增加(灰色条，图33A)。
实施例16. 能在405nm激发的具有胺官能团的阴离子偶联聚合物AA002的合成
[2，7-{9，9-二(1-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙氧基)))}-交替共聚-(2，7-{9，9-二(4’-(磺酸钠)丁基)}芴-共聚-2，7-{9，9-二(1-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙氧基)))}-交替共聚-3，5-1-{4’-邻苯二甲酰亚胺基丁氧基)亚苯基)]共聚物在48mL Schlenck试管中，2，7-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-9，9-二(1-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙氧基)))氟(120.1mg，0.150mmol)、2，7-二溴{9，9-二(4’-(磺酸钠)丁基)}芴(91.3mg，0.143mmol)、1-(4’-邻苯二甲酰亚氨基丁氧基)-3，5-二溴苯(3.7mg，0.0082mmol)、碳酸钾(234mg，1.7mmol)和四(三苯基膦)钯(0)(6.2mg，0.0054mmol)在DMF(3.8mL)、THF(2.5mL)和水(2.5mL)中的溶液通过用氩喷射20分钟脱气。该溶液然后在氩气氛下加热至85℃，3天。将溶液滴加至搅拌的丙酮中，产生深褐色固体。该固体然后与甲醇一起搅拌，过滤收集，并且去除溶剂，产生亮黄色固体。1H NMR(DMSO)8.055-7.828(m，12H)；3.558-3.293(m，24H)；3.188(m，12H)；2.217-2.161(m，8H)；1.417(br s，4H)；0.664(br s，4H)。Bimodal，Mn 7.3K，PDI 1.02，和Mn 49K，PDI 1.2。
然后使用与实施例9所述类似的步骤，将该聚合物去保护并且纯化产生AA002。AA002的光学光谱显示于图34，其中实线表示吸收，虚线表示发射光谱。
实施例17. 生物素化偶联聚合物-生物素基-AA002的合成
生物素基-AA002 使用来自于Pierce(#20217)的NHS-生物素连接体，将AA002上的胺官能团转换成生物素官能团。这个步骤的方案由Pierce方案改进而成，可见于Pierce网站www.piercenet.com(最后一次访问日期09/23/2007)。这个步骤的方案类似地遵循实施例12所述。
实施例18. 不同聚合物亲和素D比的放大效果 荧光素标记的亲和素D，或亲和素D-F1(每个亲和素0.8个染料)，维持在一个恒定浓度，与一系列浓度增加的从0至8当量的生物素基-AA002孵育。图35A中示意性地显示了生物素基-AA002的头两个当量。对于每个比例，记录直接和间接激发(经由FRET)的染料荧光。当聚合物与染料的比例增加时，由直接激发产生的信号维持相当恒定，而由间接激发产生的信号增加，如图35B所示，该图是作为AA002与亲和素D-F1之比的函数的荧光素发射图。此种信号增加大致在生物素基-AA002的四个当量时达到平台期，这与亲和素D上所有生物素结合位点被占据相一致。
这些数据与生物素基-AA002与荧光素标记的亲和素D之间的特异性结合相一致。观测到了较高的信号放大，其平台期在聚合物的四个当量时，表示所有可用的生物素结合位点都被占据。
实施例19. 染料信号的静电放大 如图36B示意性显示，染料标记的蛋白质(Cy3-标记的IgG和荧光素标记的BSA)各自独立地与阳离子聚合物PFP-2F孵育(参见图36A)。在聚合物和每个染料标记的蛋白质之间发生了非特异性静电结合。每个溶液都在380nm处激发，并且收集发射光谱。将这些光谱与直接激发染料收集的发射光谱进行比较，如图36C所示，显示出Cy3标记的IgG有30倍的放大，荧光素标记的BSA有25倍的放大。使用的Cy3标记的IgG是一种抗洋地黄毒苷抗体，其用来靶向洋地黄毒苷标记的抗体。
本发明优选的实施方式已经在此显示并描述，但是本领域技术人员应当明白这些实施方式仅以实施例的方式提供。本领域技术人员将会想到在不偏离本发明的情况下进行多种变化、改变和替换。应当理解在实践本发明中可以采用此处描述的本发明实施方式的多种替代形式。可以预期下述的权利要求书限定了本发明的范围，并且因此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构和它们的等同物。
权利要求
1.一种测定方法，包括
提供怀疑含有靶标生物分子的样本；
提供与信号发色团偶联并且能够与靶标生物分子相互作用的传感器；
提供偶联的聚合物，该聚合物选自
其中该聚合物与该传感器静电相互作用并且在激发后能够传递能量至该传感器信号发色团；
在传感器能够与可能存在的靶标生物分子结合的条件下，在溶液中将样本与所述传感器和所述多发色团接触；
向样本施加能够激所述发多发色团的光源；和
检测是否从信号发色团发出光。
2.权利要求1的方法，其中所述R基团是磺酸基团。
3.权利要求1的方法，其中所述传感器是一种生物分子。
4.权利要求3的方法，其中所述生物分子是抗体。
5.权利要求1的方法，其中所述传感器包含与多个信号发色团偶联的多个传感器，其中在从多发色团能量传递后，所述多个发色团中的至少两个发射不同波长的光。
6.一种多发色团复合物，包含
偶联至至少一个生物分子上的多发色团，该生物分子选自传感器生物分子、生物偶联物和靶标生物分子，其中该多发色团进一步偶联至信号发色团上，并且其中该多发色团包含结构
其中CP1、CP2、CP3和CP4是任选取代的偶联的聚合物区段或寡聚结构，它们彼此相同或不同。
7.权利要求6的多发色团，其中偶联的聚合物是一种阳离子偶联聚合物。
8.权利要求6的多发色团，其中偶联的聚合物是一种阴离子偶联聚合物。
9.权利要求6的多发色团，其中偶联的聚合物是一种电荷中性的偶联聚合物。
10.权利要求6的多发色团，其中CP1、CP2、CP3和CP4是芳香族重复单元，选自苯、萘、蒽、芴、噻吩、呋喃、吡啶和噁二唑，每个任选地被取代，并且其中CP3和CP4可含有一个或多个通过连接体连接的独特生物偶联位点。
11.权利要求6的多发色团，进一步包含选自马来酰亚胺、硫醇、琥珀酰亚胺酯(NHS酯)、胺、叠氮化物化学、羧基/EDC(1-乙基-3-[3-二甲基氨丙基]碳二亚胺盐酸盐、磺基-SMCC(磺基琥珀酰亚胺基4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧酸酯)、胺/BMPH(N-[β-马来酰亚胺丙酸]酰肼·TFA)、以及磺基-SBED磺基琥珀酰亚胺基[2-6-(生物素酰氨基)-2-(对-叠氮基苯甲酰氨基)-己酰氨基]-乙基-1，3′-二硫代丙酸酯的生物偶联物位点。
12.权利要求6的多发色团，其中该多发色团包含结构
其中R1是加溶基，选自乙二醇寡聚物、乙二醇聚合物、ω-铵盐烷氧基和ω-磺酸盐烷氧基。
13.权利要求6的多发色团，其中该多发色团包含结构
其中R1是加溶基，选自乙二醇寡聚物、乙二醇聚合物、ω-铵盐烷氧基和ω-磺酸盐烷氧基。
14.权利要求12或13的多发色团，其中1和2选自具有下述结构的a-g连接基团
*＝用于共价连接至不饱和骨架的位点
3为具有如下结构的基团h
L＝连接体
A＝生物偶联位点
*＝用于共价连接至不饱和骨架的位点。
15.权利要求12或13的多发色团，进一步包含如下结构
其中R1是加溶基，选自乙二醇寡聚物、乙二醇聚合物、ω-铵盐烷氧基和ω-磺酸盐烷氧基。
16.权利要求12或13的多发色团，进一步包含如下结构
其中R1是加溶基，选自乙二醇寡聚物、乙二醇聚合物、ω-铵盐烷氧基和ω-磺酸盐烷氧基。
17.权利要求12或13的多发色团，进一步包含如下结构
其中R1是加溶基，选自乙二醇寡聚物、乙二醇聚合物、ω-铵盐烷氧基和ω-磺酸盐烷氧基。
18.一种用于鉴定靶标生物分子的多发色团复合物，包含
多发色团，
共价连接至该多发色团的传感器生物分子，
共价连接至该多发色团的信号发色团，其中该信号发色团能够接收在多发色团激发时来自多发色团的能量，并且该传感器生物分子能够与靶标生物分子相互作用。
19.权利要求18的多发色团复合物，其中所述信号发色团和所述传感器生物分子均通过多个连接体共价连接至该多发色团。
20.权利要求18的多发色团复合物，其中所述信号发色团和所述传感器生物分子均通过一个三官能化连接体共价连接至该多发色团，该三官能化连接体共价结合该多发色团、该信号发色团和该传感器生物分子。
21.权利要求18的多发色团复合物，其中所述连接体包含选自马来酰亚胺/硫醇、琥珀酰亚胺酯(NHS酯)/胺、叠氮化物化学、羧基/EDC(1-乙基-3-[3-二甲基氨丙基]碳二亚胺盐酸盐)/胺、胺/磺基-SMCC(磺基琥珀酰亚胺基4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧酸酯)/硫醇、和胺/BMPH(N-[β-马来酰亚胺基丙酸]酰肼·TFA)/硫醇的连接化学。
22.权利要求18的多发色团复合物，其中该多发色团是偶联的聚合物。
23.权利要求18的多发色团复合物，其中所述偶联的聚合物是聚阳离子偶联的聚合物。
24.一种测定方法，包括
提供怀疑含有靶标生物分子的样本；
提供包含多发色团、共价连接的信号发色团和共价连接的传感器生物分子的多发色团复合物，其中信号发色团能够接收在多发色团激发时来自于多发色团的能量，并且传感器生物分子能够与靶标生物分子相互作用；
在传感器生物分子能够结合至可能存在的靶标生物分子的条件下，在溶液中将样本与多发色团复合物接触；
向样本施加能够激发多发色团的光源；和
检测是否从信号发色团发出光。
25.权利要求24的方法，其中所述多发色团是偶联的聚合物。
26.权利要求25的方法，其中所述偶联的聚合物是聚阳离子偶联聚合物。
27.一种测定方法，包括
提供怀疑含有靶标生物分子的样本；
提供偶联至信号发色团并能够与靶标生物分子相互作用的第一生物偶联物；
提供偶联至多发色团的第二生物偶联物，其中该发色团包含结构
其中CP1、CP2、CP3和CP4是任选地取代的偶联的聚合物区段或寡聚结构，它们彼此相同或不同，其中该第二生物偶联物能结合该第一生物偶联物，并且在这种结合后，多发色团的激发能够传递能量至该信号发色团；
在第一生物偶联物能结合可能存在的靶标生物分子的条件下，在溶液中将样本与第一生物偶联物接触；
将溶液与第二生物偶联物接触；
向样本施加能够激发多发色团的光源；和
检测是否从信号发色团发出光。
28.权利要求27的多发色团，其中所述偶联的聚合物是阳离子偶联聚合物。
29.权利要求27的多发色团，其中所述偶联的聚合物是阴离子偶联聚合物。
30.权利要求27的多发色团，其中所述偶联的聚合物是电荷中性偶联聚合物。
31.权利要求27的多发色团，其中CP1、CP2、CP3和CP4是芳香族重复单元，选自苯、萘、蒽、芴、噻吩、呋喃、吡啶和噁二唑，每个任选地被取代，并且其中CP3和CP4可含有一个或多个独特生物偶联位点，由一个连接体连接。
32.权利要求27的多发色团，进一步包含选自马来酰亚胺、硫醇、琥珀酰亚胺酯(NHS酯)、胺、叠氮化物化学、羧基/EDC(1-乙基-3-[3-二甲基氨丙基]碳二亚胺盐酸盐、磺基-SMCC(磺基琥珀酰亚胺基4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷-1-羧酸酯)、胺/BMPH(N-[β-马来酰亚胺基丙酸]酰肼·TFA)、以及磺基-SBED磺基琥珀酰亚胺基[2-6-(生物素酰氨基)-2-(对-叠氮苯甲酰氨基)-己酰氨基]-乙基-1，3′-二硫代丙酸酯的生物偶联位点。
33.权利要求27的多发色团，其中该多发色团包含结构
其中R1是加溶基，选自乙二醇寡聚物、乙二醇聚合物、ω-铵盐烷氧基和ω-磺酸盐烷氧基。
34.权利要求27的多发色团，其中该发色团包含结构
其中R1是加溶基，选自乙二醇寡聚物、乙二醇聚合物、ω-铵盐烷氧基和ω-磺酸盐烷氧基。
35.权利要求33或34的多发色团，其中1和2选自具有下述结构的a-g连接基团
*＝用于共价连接至不饱和骨架的位点
3为具有如下结构的基团h
L＝连接体
A＝生物偶联位点
*＝用于共价连接至不饱和骨架的位点。
36.权利要求33或34的多发色团，进一步包含结构
其中R1是加溶基，选自乙二醇寡聚物、乙二醇聚合物、ω-铵盐烷氧基和ω-磺酸盐烷氧基。
37.权利要求33或34的多发色团，进一步包含结构
其中R1是加溶基，选自乙二醇寡聚物、乙二醇聚合物、ω-铵盐烷氧基和ω-磺酸盐烷氧基。
38.权利要求33或34的多发色团，进一步包含结构
其中R1是加溶基，选自乙二醇寡聚物、乙二醇聚合物、ω-铵盐烷氧基和ω-磺酸盐烷氧基。
39.权利要求27的方法，其中所述偶联的聚合物是聚阳离子偶联聚合物。
40.权利要求27的方法，其中所述偶联的聚合物是阴离子偶联聚合物。
41.权利要求27的方法，其中所述偶联的聚合物是电荷中性结合偶联聚合物。
42.权利要求27的方法，其中第一和第二生物偶联物中的至少一个是抗体。
43.权利要求27的方法，其中第一和第二生物偶联物均为抗体。
44.一种测定方法，包括
提供怀疑含有靶标生物分子的样本；
提供包含共价连接的第一生物偶联物的多发色团；
提供包含能够与靶标生物分子相互作用的传感器生物分子、信号发色团和能够与第一生物偶联物结合的共价连接的第二生物偶联物的传感器生物分子复合物，其中在这种结合后，多发色团的激发能够将能量传递至该信号发色团；
在传感器生物分子能结合可能存在的靶标生物分子的条件下，在溶液中将样本与传感器生物分子复合物接触；
将溶液与多发色团接触；
向样本施加能够激发多发色团的光源；和
检测是否从信号发色团发出光。
45.权利要求44的方法，其中所述多发色团是偶联的聚合物。
46.权利要求44的方法，其中所述偶联的聚合物是聚阳离子偶联聚合物。
47.权利要求44的方法，其中第一和第二生物偶联物选自蛋白质、抗体和核酸。
48.权利要求44的方法，其中所述第一生物偶联物是链亲和素或生物素，其中所述传感器生物分子是抗体，以及其中当第一生物偶联物是链亲和素时，所述第二生物偶联物是生物素，或当第一生物偶联物是链亲和素时，该第二生物偶联物为生物素。
49.权利要求44的方法，其中所述第一生物偶联物是链亲和素或生物素，其中所述传感器生物分子是核酸，以及其中当第一生物偶联物是链亲和素时，所述第二生物偶联物是生物素，或当第一生物偶联物是链亲和素时，该第二生物偶联物为生物素。
50.一种用于鉴定生物分子的生物识别复合物，包含
生物偶联物；
共价连接至该生物偶联物的信号发色团；
共价连接至该生物结合物的多发色团，其中该多发色团的激发能够将能量传递至该信号发色团。
51.权利要求50的生物识别复合物，其中所述生物偶联物是抗体。
52.权利要求50的生物识别复合物，其中所述生物偶联物是链亲和素。
53.权利要求50的方法，其中所述多发色团是偶联的聚合物。
54.权利要求53的方法，其中所述偶联的聚合物是聚阳离子偶联聚合物。
55.一种测定方法，包括
提供怀疑含有靶标生物分子的样本；
提供包含生物偶联物、共价连接至该生物偶联物的信号发色团和共价连接至该生物偶联物的多发色团的生物识别复合物，其中多发色团的激发能够将能量传递至该信号发色团；
在生物偶联物能结合可能存在的靶标生物分子或靶标相关生物分子的条件下，在溶液中将样本与生物识别复合物接触；
向该溶液施加能够激发多发色团的光源；和
检测是否从信号发色团发出光。
56.权利要求55的方法，其中所述多发色团是偶联的聚合物。
57.权利要求56的方法，其中所述偶联的聚合物是聚阳离子偶联的聚合物。
58.一种用于鉴定靶标生物分子的生物识别复合物，包含
生物偶联物；
共价连接至该生物偶联物的多发色团；和
共价连接至该多发色团的信号发色团，其中多发色团的激发能够将能量传递至该信号发色团。
59.权利要求58的生物识别复合物，其中所述生物偶联物是抗体。
60.权利要求58的生物识别复合物，其中所述生物偶联物是链亲和素。
61.权利要求58的方法，其中所述多发色团是偶联的聚合物。
62.权利要求61的方法，其中所述偶联的聚合物是聚阳离子偶联的聚合物。
63.一种测定方法，包括
提供怀疑含有靶标生物分子的样本；
提供包含生物偶联物复合物的生物识别复合物，该生物偶联物复合物包含生物偶联物、共价连接至该生物偶联物的多发色团、和共价连接至该多发色团的信号发色团，其中该多发色团的激发能够将能量传递至该信号发色团；
在生物偶联物能结合可能存在的靶标生物分子或靶标相关生物分子的条件下，在溶液中将样本与该生物识别复合物接触；
向该溶液施加能够激发多发色团的光源；和
检测是否从信号发色团发出光。
64.权利要求63的方法，其中所述多发色团是偶联的聚合物。
65.权利要求64的方法，其中所述偶联的聚合物是聚阳离子偶联的聚合物。
66.权利要求1、24、27、44、54和62中任一项的方法，其中基因的表达通过检测靶标生物分子来检测。
67.权利要求1、24、27、44、54和62中任一项的方法，其中靶标生物分子的检测提供可以用于诊断患者疾病状态的结果。
68.权利要求67的方法，其中诊断疾病的方法包括
检查或分析关于样本中是否存在靶标生物分子的数据；和
对患者、医务人员或医疗卫生管理者提供结论，该结论是基于检查或分析关于疾病诊断的数据而作出的。
69.权利要求68的方法，其中提供结论包括在网络上传输数据。
70.一种用于鉴定靶标生物分子的试剂盒，包括
多发色团，
共价连接至该多发色团的传感器生物分子，
共价连接至该多发色团的信号发色团，其中该信号发色团能够接收在多发色团激发时来自于该多发色团的能量，并且该传感器生物分子能够与靶标生物分子相互作用。
71.权利要求70的试剂盒，其中该试剂盒进一步包含一种基质。
全文摘要
提供了包括用于鉴定靶标生物分子的多发色团和/或多发色团复合物的方法和组合物。传感器生物分子，例如抗体，可与该多发色团共价连接。此外，信号发色团可与该多发色团共价连接。这种排列使得该信号发色团能够接收在多发色团激发时来自于该多发色团的能量。因为该传感器生物分子能够与靶标生物分子相互作用，该多发色团和/或多发色团复合物能够提供针对靶标生物分子的增强的检测信号。
文档编号C12Q1/68GK101553579SQ200780041763
公开日2009年10月7日 申请日期2007年10月8日 优先权日2006年10月6日
发明者B·S·盖洛德, J·W·霍格, T-j·付, 孙成军 申请人:赛里根有限公司