专利名称：使用固氮弓菌苯基乙醇脱氢酶制备(4s)-3，4-二羟基-2，6，6-三甲基-环己-2-烯酮及其衍 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及制备式(I)的旋光(4S)-4-羟基-2，6，6-三甲基环己-2-烯-l-酮衍 生物的方法及制备式(III)的(3S，3，S)-虾青素的方法，后面的方法包括前面的 方法。
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背景技术：
由于虾青素(3,3'-二羟基-(5，p'-胡萝卜素-4，4'-二酮)在位置3及3'有两个 手性中心，其可以以如下构型异构体形式存在(3S，3'S)、 (3R，3'R)、 (3S，3'R) 及(3R,3'S)。后面提及的两种构型异构体相同且表示内消旋型(Carotenoids Handbook, 2004， Main List第405号)。
所有三种形式可见于天然来源中(Carotenoids Handbook, 2004， Main List第404号、第405号、第406号)。以外消旋前体起始的总化学合成产生 (3S,3'S)-虾青素、内消旋-虾青素及(3R，3'R)-虾青素的1:2:1混合物(The EFSA Journal, 2005， 291， 12， Deutsche Lebensmittel-Rimdschau， 2004，100， 437， Helvetica Chimica Acta, 1981,64,2436)。
然而，(3S，3'S)构型异构体尤其重要。其由绿藻(雨生红球藻 (Haematococcus pluvialis))以对映纯性形式(enantiopure form )生物合成 (丄Applied Phycology， 1992， 4， 165; Phytochemistry， 1981， 20， 2561)。
来自绿藻的(S，S)-虾青素用作对于人类健康具有有益作用的膳食增补 物(J. Nat. Prod" 2006， 69， 443)。其还适合于完全阻断罗非昔布(rofecoxib; Vioxx)的有害助氧化效应(J. Cardiovasc. Pharmacol., 2006， 47增刊1， S. 7)。
然而，鉴于绿藻中(S，S)-坏青素的低浓度(J. Agric. Food Chem.， 1998， 46， 3371)，该活性物质的可用性极其有限。此外，该活性物质是以单脂肪 酸酯与二脂肪酸酯以及游离虾青素的混合物存在于海藻中，导致分离及纯 化相当复杂(尤其参见Phytochemistry， 20， 11， 2561 (1981); J.Applied Phycology, 4， 2， 165 (1992))。为能够以较大量及高纯度提供(S,S)-虾青素， 选用总化学合成技术(total chemical synthesis)。
(S，S)-虾青素的各种合成法已描述于文献中。 一种策略包括使用非对 映盐(Helvetica Chimica Acta, 1981， 64， 2447)或非对映酉旨(Helvetica Chimica Acta, 1981， 64， 2419)将外消旋前体拆分成光学对映体。亦已报导 外消旋前体的微生物外消旋体拆分。这些方法的特定缺陷在于生成(R，R)-虾青素的对映异构体无法利用，仅可用极为复杂的技术使其再循环。
另 一种合成策略包括由微生物或酶促方法获得对映纯性的合成结构 单元(Helvetica Chimica Acta, 1978, 61， 2609， Helvetica Chimica Acta, 1981,64,2405)。由于这些结构单元的氧化态过低，因此必需以多阶段合成 将其转化为(S，S)-坏青素前体。
WO 2006/039685首次在反应方案II中描述酮基异佛尔酮 (ketoisophorone)的两阶段对映选择性氬化以得到对映纯性C9二醇，基于 Helv.Chim.Acta，1978， 61， 2609中所述的方法，在将对映纯性C9二醇的幾基 再氧化后，以多阶段合成法从其获得(S，S)-蚱青素前体。WO 2006/039685 进一步描述式(IIa)的C9烯醇醚的对映选择性催化转移氢化作用以得到式 (Ia)的相应对映纯性醇。<formula>formula see original document page 6</formula>
所述氢化催化剂为具有手性配位体的金属，优选为具有旋光胺作为配
位体的钌催化剂。此方法的一种缺陷在于使用式(IIb)的工业级中间物的o-
保护衍生物，<formula>formula see original document page 6</formula>
因此需要额外的合成作用。此外，所需旋光催化剂成本极高，以致其在工 业方法中的使用因经济方面的考虑而受阻。
亦已描述用酵母生物催化还原式(IIb)的C9烯醇。然而，在此情况下，
获得仅超过65%的对映异构体，导致此方法不能用于工业方法 (Hclv.Chim.Acta, 1981， 64， 2447)。
原则上已知脱氢酶适用作制备旋光羟基化合物的生物催化剂。其为具 有优良特征的生物催化剂，已用于许多工业方法中(Angew. Chem. Int编 著，2004， 43， 788， Tetrahedron, 2004, 60， 633, Chiral catalysis-asymmetric hydrogenation supplement to Chemistry Today, 2004， 22， 26， Current Opinion in Chemical Biology, 2004， 8， 120, Organic Process Research & Development, 2002， 6, 558, Tetrahedron: Asymmetry, 2003, 14， 2659， Chiral catalysis-asymmetric hydrogenation supplement to Chemistry Today, 2004， 22， 43)。
WO 2005/1085卯描述通过酶促还原相应酮来制备某些力走光烷醇的方 法，这些烷醇诸如(lS)-:5-甲基胺基-l-G-噻吩基)丙-l-醇或(lS)-3-氯-l-(2-噢 吩基)丙-l-醇。所用酶可用于还原具有不同结构的酮的程度未作论述。
所述将两个手性中心引入一个用于合成S，S'-坏青素的前体中的方法是 复杂且多阶段的任务或不经济的任务，以致似乎这些方法几乎不适于以工业^!^莫实施。
发明内容
本发明的目的是开发以工业上可利用的起始物质起始，制备用于合成 (S，S')-虾青素的旋光中间物(若可能，对映纯性形式)的简单而经济有效的方 法，该方法可毫不困难地整合至"外消旋"坏青素的现有工业总合成法中 (Car()tenoids第2巻，1996， 259; Pure and Applied Chemistry, 2002， 74, 2213)。
该目的可通过制备式(I)的旋光(4S)-4-羟基-2，6,6-三曱基环己-2-烯-l-酮 衍生物的方法实现
其中R1为氢、C广C,o烷基、CVd4芳基烷基、碱金属Mi或碱土金属片 iM、2或(M2)+X-，其中M'为Li、 Na、 K、 Rb或Cs且M2为Mg、 Ca、 Sr或 Ba且X—为单价阴离子；
该方法包含以下反应步骤
其中在还原等效物(reducing叫uivalent)的存在下，将选自氧化还原 酶类的酶(E)孵育于包含式(II)的三甲基环己-2-烯-l，4-二酮衍生物的培养基 中
其中I^与R'相同或不同，且为氢、d-do烷基、C7-C,4芳基烷基、碱 金属M'或碱土金属片段M2^或(MYx-,其中M为Li、 Na、 K、 Rb或Cs且 M2为Mg、 Ca、 Sr或Ba，且X为单价阴离子；
其中式(II)化合物经酶促还原为式(I)化合物，且反应过程期间所消耗的还原等效物又通过酶(E)或另一种酶(E2)，使还原剂(reducing means, RM) 转化为相应氧化产物(OP)而再生，且任选将至少部分该氧化产物(OP)从反 应培养基或反应平衡中移除，且分离所形成的产物(I)。
本发明的方法为制备式(I)化合物，其中R'为氢、d-C,o烷基(诸如甲基、 乙基、正丙基、异丙基或正己基)、CVd4芳基烷基(诸如爷基)、碱金属M1 或碱土金属片段1\121/2或(1\12)1-，其中M'为Li、 Na、 K、 Rb或Cs,优选为 Na或K、尤其为Na,且M2为Mg、 Ca、 Sr或Ba,尤其为Mg，且X-为单价 阴离子，诸如卣离子、乙酸根或磷酸二氬根。R'优选为氢、甲基、Na或K, 尤其优选为氢、甲基或Na，尤其为氢或钠。
本发明的方法中进行反应的式(II)起始化合物中，基团I^与R'相同或 不同，且为氢、C,-do烷基(诸如甲基、乙基、正丙基、异丙基或正己基)、 C，C"芳基烷基(诸如苄基)、碱金属M'或碱土金属片段M、2或(M"+X-，其 中Mi为Li、 Na、 K、 Rb或Cs，优选为Na或K，尤其为Na，且M2为Mg、 Ca、 Sr或Ba，尤其为Mg，且X-为单价阴离子，诸如卣离子、乙酸根或磷 酸二氢根。R'优选为氢、曱基、Na或K，尤其优选为氢、曱基或Na，尤其 为氩或钠。
根据本发明合适的氧化还原酶类酶(E)(尤其意指具有脱氢酶活性的 酶)特别是醛-酮还原酶超家族的醛-酮还原酶家族的酶(K.M.Bohren， B.Bullot'k， B.Wermuth及K.H.Gabbay丄Biol. Chem. 1989， 264， 9547-9551) 及短链醇脱氢酶/还原酶(SDR)的酶。在例如H. J6rnval1， B. Persson， M. Kr()ok， S. Atrian， R. Gonzalez-Duarte， J， Jeffery和D. Ghosh, Biochemistry, 1995， 34，第6003-6013页，或U. Oppermann， C. Filling, M, Hult， N, Shafqat, X. Q. Wu, M. Lindh， J. Shafqat, E. Nordling, Y. Kallberg, B. Persson和H. Jornvall, Chemico-Biological Interactions, 2003， 143， 第 247-253页中详细描述了后一类酶。
在所述酶类中，醇脱氬酶，尤其是短链醇脱氢酶特别合适。醇脱氢酶 中优选的酶尤其是以NADH或NADPH作为还原等效物，将式(II)化合物还 原为式(I)化合物的那些酶。本发明方法的尤其合适实施例包含具有以下多肽序列的酶(E):
(i) SEQIDNO:2，或
(ii) 与SEQ ID NO:2相比，其中多达25%的氨基酸残基通过缺失、插 入、取代或其结合改变，且保持了SEQIDNO:2的至少50。/。酶活性的序列。
具有氧化还原酶活性(尤其脱氢酶活性)，包含如SEQ ID NO: 2所示的 氨基酸序列的合适酶(E)，以及具体公开的具有氧化还原酶活性(尤其脱氢 酶活性)的同样可用于本发明方法中的酶(E)的"功能等效物"或类似物详述 于WO 2005/108590第11至16页中，该专利引入本文作为参考。
优选在本发明的方法中使用具有氧化还原酶活性(尤其脱氢酶活性)的 酵(E), 其可由固氮弓菌属(Azoarcus)、 Azonexus、 Azospira、 Azovibrio、 脱氯单胞菌属(Dechloromonas)、高铁杆菌属(Ferribacterium)、嗜氢菌属 (Petrobacter)、 丙酸杆菌属(Propionivibrio)、四瓣藻属(Quadricoccus)、红 环菌属(Rhodocyclus)、 史特拉杆菌属(Sterolibacterium)、 陶厄氏菌属 (Thauera)及动胶菌属(Zoogloea)的微生物制备。
尤其优选在本发明的方法中使用具有氧化还原酶活性(尤其脱氢酶活 性)的酶(E)，其选自来自固氮弓菌属的微生物(尤其来自固氮弓菌属物种细 菌EbNl)的酶。
依据其氨基,歹'J，固氮弓菌属物种EbNl的苯基乙醇脱氢酶可以包括 在短链醇脱氢酶/还原酶[SDRl中。在例:^ H.J6rnva11, B.Persson, M.Krook， S.Atrian, R.Gonzalez-Duarte, J.Jeffery及D.Ghosh ， Biochemistry , 1995， 34第6003-6013页或U.Oppermann， C.Filling, M.Hult, N.Shafqat, X.Q.Wu， M丄indh，丄Shafqat， E.Nordling， Y.Kallberg， B.Persson及H.Jornvall ， Chemico-Biological Interactions, 2003， 143>第247-253页中详细描述了所述 类型的酶。在SDR类中，各个代表物的氨基酸序列可以互相差别很大。然 而，已知某些氨基酸或氨基酸区域在SDR类中高度保守。C.Filling， K.I).Berndt, ,J.Benach， S.Knapp， T，Prozorovski， E.Nordling, R.Ladenstein， H.J()rnvall及U.Oppermann， Journal of Biological Chemistry, 2002, 277,第 25677-25684页描述了重要的保守SDR区。固氮弓菌属物种的实例为厌氧固氮弓菌(Azoarcus anaerobius)、 Azoarcus buckelii 、 Azoarcus communis 、 Azoarcus evansii 、 Azoarcus indigens 、 Azoarcus toluclasticus 、 Azoarcus tolulyticus 、 Azoarcus toluvorans、固氮弓菌属、固氮弓菌属物种22Lin、固氮弓菌属物种BH72、 固氮弓菌属物种CC-ll、固氮弓菌属物种CIB、固氮弓菌属物种CR23、固 氮弓菌属物种EB1、固氮弓菌属物种EbNl、固氮弓菌属物种FL05、固氮 弓菌属物种HA、固氮弓菌属物种HxNl、固氮弓菌属物种mXyNl、固氮弓 菌属物种PbNl、固氮弓菌属物种PH002、固氮弓菌属物种T及固氮弓菌属 物种ToNl。
固氮弓菌属物种细菌EbNl的脱氢酶尤其优选用作本发明方法中的酶
(E)。
本发明的方法优选在酶(E)(其中该酶是由如SEQ ID NO: l所示的核酸 序列或其功能等效物编码)的存在下进行。
可用于编码可用于本发明方法中的具有脱氢酶活性的酶(E)的核酸序 列详述于WO 2005/108590中第16至22页中，该专利引入本文作为参考。
在该方法的尤其优选实施例中，该具有脱氢酶活性的酶是选自包含如 SEQ ID NO: 2所示的氨基餅列或其衍生出的下述序列的酶——其中最 多25%,优选最多20%，特别优选最多15%,特别是最多10、 9、 8、 7、 6、 5、 4、 3、 2、 1%的氨基酸残基已经通过缺失、取代、插入或缺失、取代和 插入的结合方式改变，其中与SEQIDNO:2相比，改变的多肽序列保持了 SEQ II) N():2的至少50。/0，优选65%，特别优选80%，特别是高于90%的 活性。就此而言，SEQ ID NO:2的酶活性是指以对映体选择性方式 (enantioselectively )使式(II)的酮、尤其其中R^H或Na的式(II)的酮还原 为具有通式(I)的(S)醇的能力。
在添加还原等效物，特别是NADH或NADPH的情况下进行本发明的方 法。由于NADH及NADPH为极其昂贵的化合物，因此这些还原等效物一般 仅以催化量使用。原则上可用于使反应中所消耗的还原等效物再生的还原 剂(RM)为无机或有机化合物(诸如亚磷酸盐或醇)，或为电化学方法，诸如在阴极处还原。优选用于本发明方法中的还原剂(RM)为包含至少 一个伯醇 或叔醇官能性(基团)CH(OH)的有机化合物，诸如异丙醇、2-丁醇、2-戊醇、2-已醇、3-已醇或还原糖，诸如葡萄糖，尤其为异丙醇或葡萄糖。 还原剂(RM)借助于酶(E)或另 一种酶(E2)而转化为氧化产物(OP)，至少部分 该氧化产物(OP)从反应培养基或反应平衡中移除。若还原剂(RM)包含叔 醇，则其亦常称为牺牲醇(sacrificial alcohol)且相应地形成如牺牲酮 (sacrificial ketone )的氧化产物(OP)。
在本发明的优选实施例中，所添加的牺牲醇不仅用于使所消耗的还原 等效物再生，而且用作助溶剂。可能在液体l-相、液体2-相或液体多相系 统中进行操作，单相通常由水^/或水可混溶性溶剂组成。
相对于所用的每摩尔式(II)的三甲基环己-2-烯-l，4-二酮衍生物，还原 等效物的用量优选为0.001至100毫摩尔，特别优选为0.01至1毫摩尔。
至少部分本发明的方法中所形成的氧化产物(OP)可从反应培养基或 反应平衡中移除。在叔醇(诸如异丙醇)作为还原剂(RM)的情况下，可能将 所形成的所谓牺牲酮(在异丙醇作为牺牲醇的情况下为丙酮)以各种方式(例 如经由选择性膜或通过萃取或蒸镏方法)移除。优选采用蒸馏法来移除酮， 诸如丙酮。在通过蒸馏去除酮的同时，通常同时还去除了部分牺牲醇，有 时还额外去除了部分水相。通常通过随后计量牺牲醇并且如果合适，随后 计量，以平衡这些蒸馏损耗。蒸馏率为反应体积的0.02%/分钟至2%/分钟， 优选0.05%/分钟至1 %/分钟。反应器护套温度优选在反应器内部温度以上 5-70开，优选10-40开。
在不挥发性氧化产物(OP)的情况下，如在将葡萄糖氧化为葡萄糖酸的 情况下，后者通过环化为葡糖酸内酯而从还原剂(RM)与氧化剂(OM)之间 的反应平衡中移除。尽管可能通过亦催化式(H)化合物还原为式(I)化合物的 相同酶(E)进行多种牺牲醇的氧化作用，但仍必需添加第二种酶(E、(例如葡 萄糖脱氢酶)用以葡萄糖的氧化作用。
在挥发性氧化产物的情况下，蒸馏在l-500毫巴(mbar)、优选10-200毫 巴的压力范围下进行尤其适宜。为式(I)化合物，该微生物是选自以下科的细菌肠杆菌科 (Enterobacteriaceae)、 假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、 根瘤菌科 (Rhizobiaceae)、 乳酸杆菌科(Lactobacillaceae)、 链霉菌科 (Streptomycetaceae)、 红球菌科(Rhodococcaceae)、 红环菌科 (Rhodocyclaceae)及诺卡氏菌科(Nocardiaceae)。该-錄生物尤其可为经核酸 构建体转化的重组微生物，该核酸构建体编码具有氧化还原酶活性、优选 脱氢酶活性、尤其如上定义的醇脱氢酶活性的酶。
(亦即酶(E))的核酸序列的表达构建体及包含这些表达构建体中的至少 一者 的相应栽体详述于WO 2005/1085卯第22至25页中，该专利引入本文作为参考。
经合适载体或构建体转化且可用于产生可用于本发明方法中的多肽 (即，酶(E))的重组微生物详述于WO2005/108590第25至27页，该专利引入 本文作为参考。
与本发明方法中的酶(E)功能一致的多肽或具有其生物学活性的功能 片段的重组制备方法(其中培养产生多肽的微生物，合适时诱导多肽的表达 且将其自培养物中分离)详述于WO 2005/1085卯第27至29页中，该专利引 入本文作为参考。该多肽亦可通过所述方法以工业规模生产。
根据本发明使用的具有氧化还原酶活性、尤其具有脱氢酶活性的酶(E) 可作为游离酶或固定化酶(E)而用于本发明的方法中。
本发明方法的优选实施方案至少包括如下所述的步骤a)、 b)及d):
a) 从天然来源分离或重组制备产生具有脱氢活性的酶的^:生物，
b) 繁殖该樣t生物；
c) 合适时，从所述微生物中分离所述具有脱氢酶活性的酶，或从所述 微生物制备包含所述酶的蛋白质级分，及
d)
培养基中本发明的方法有利地在0。C与95'C的间，优选在10。C与85'C的间，尤其 优选在15 。C与75 'C的间的温度下进行。
本发明方法中的pH值有利地保持在pH 4与pH 12的间，优选保持在pH 4.5与pH9的间，尤其优选保持在pH5与pH8的间。
在本发明的方法中，对映纯性或手性产物或旋光醇是指表现出对映异 构体富集性(enrichment)的对映异构体。优选在本发明方法中实现至少 70%ee，优选至少80。/。ee，特别优选至少90。/。ee，非常特别优选至少98。/。ee 的对映本发明体纯度。
可以为本发明的方法4吏用含有本发明的核苷酸、核苷酸构建物或载体 的生长细胞。也可以使用静息的或破碎的细胞。破碎的细胞是指例如通过 如溶剂处理为可渗透的细胞，或通过酶处理、通过机械处理(如弗氏压碎 器或超声)或通过其他方法破碎的细胞。通过这种方法获得的粗提取物有 利地适用于本发明的方法。纯化的或部分纯化的酶也可以用于该方法。可 在反应中有利使用的固定微生物或酶同样适用。
若本发明的方法使用游离生物体或酶，则其在萃取之前例如通过过滤 或离心去除。
由本发明的方法制备的式(I)化合物(例如(3S)-3，4-二羟基-2，6，6-三甲基 环己-2-烯酮)可以有利地从水性反应溶液通过萃取或蒸馏获得。开始有利 地将产物溶液过滤以移除不溶解的生物物质，优选通过添加诸如C盐的助滤剂。
随后将产物(其中R尸烷基)通过用与水不溶混的有机溶剂萃取而移除。 合适溶剂的实例为甲苯或其它环烃或开链烃、氯化烃(诸如二氯甲烷)、乙 酸乙酯或乙酸丁酯及醚(诸如MTBE或二异丙醚)。
式I化合物(其中R'=H或碱金属或碱土金属)原则上可如 Helv.Chim.Acta 64， 2436， 1981中所述自反应混合物中分离。开始时将产物 溶液pH值调整为l至3，优选为pHl。优选以诸如盐酸或石克酸的无机酸进行 酸化，尤其优选以石克酸进行酸化。在此情况下，可移除产物沉淀物。然而， 酸性产物溶液优选经有机溶剂萃取数次。适用于此的溶剂为氯化烃(尤其为二氯甲烷)、醚(诸如MTBE或二异丙醚)及乙酸乙酯。此萃取可分批进行或 连续进行。产物萃取可借助于酸化前浓缩水相或"盐析"；然而这些操作对 于从反应溶液中移除产物而言并非必需的。
以用于该反应的式(II)的底物(诸如，其中R、Na)为基础，在这些处理 方法中可能以60%至>95%的产率、优选80%至95%的产率分离本发明方 法的式(I)产物。该产物具有〉98。/。ee的高对映纯度。如果期望，可如Helv. Chim. Acta 64， 2436， 1981中所公开的通过结晶来纯化，但优选如Helv. Chim. Acta 64， 2447， 1981中所公开的无需进一步纯化操作即用于S，S-蚱青 素的进一步合成。
以用于该反应的底物为基础，上述加工类型能够以60%至100%,优选 80%至100%，特别优选90%至100%的收率分离本发明方法的产物，例如 3-甲氨基-l-(2-噻吩基)丙-l-酮。分离的产物以大于90%，优选大于95%， 特别优选大于98。/。的高化学纯度为特征。此外，如果需要，可以有利地通 过结晶进一步提高产物具有高对映体纯度。
本发明的方法可以分批、半分批或连续进行。
该方法可以有利地在例如Biotechnology,巻3，第二版，Rehm等人编 著，(1993 )，特别是第II章中所述的生物反应器中进行。
本发明进一步涉及制备式(IH)的(3S，3'S)-虾青素的方法，该方法包含上 述制备式(I)的旋光(4S)-4-幾基-2,6,6-三曱基环己-2-烯-1 -酮衍生物作为 (3S,3'S)-虾青素的总合成中的一个反应步骤。制备式(n)的起始化合物的合
虾青素的合成步骤原则上可从文献获知。式(I)的旋光纯的化合物(其中R1 为氢且通过(R"的对映选择性还原作用(其中I^优选为Na)所获得)转化为 (3S,3'S)-坏青素可如文献(WO 2006/039685; Helv.Chim.Acta, 1981， 64， 2447;如上，1981，64，2405)中的多种描述进行，而不发生外消旋化。
这些方法对应于工业坏青素的合成(Carotenoids,第2巻，1996， 259; Pure and Appl. Chem., 2002， 74， 2213)且提供工业上及经济上有利的 (3S，3'S)-虾青素合成途径。用途
(i) SEQIDNO:2;或
(ii) 与SEQIDNO:2相比，其中多达25%的#^酸残基通过缺失、插
入、取代或其结合改变，且保持了SEQIDNO:2的至少50。/。酶活性。
上述酶优选在用于制备(3S，3'S)-虾青素的方法中用于制备式(I)化合
物，其中式(I)化合物是在其他反应步骤中转化为式(III)的(3S，3'S)-虾青素。 本发明方法的优点是式(I)化合物是以高收率和高对映纯度获得。
实施方式
本发明通过以下实施例阐明，但这些实施例不限制本发明。
实施例
定义
化合物l: 2-羟基-3，5，5-三甲基环己-2-烯-l，4-二酮(其中I^等于氬的式
化合物1 a: 3,5,5-三甲基-1 ，4-二氧代环己-2-烯-2-醇钠(其中W等于钠的 式(H))
化合物1 b: 2-曱氧基-3，5，5-三曱基环己-2-烯-l ,4-二酮(其中W等于甲基 的式(II))
化合物2: 0S)-3，4-二羟基-2，6，6-三甲基环己-2-烯酮(其中R'等于氢的式
(I))
化合物化(化)-4-羟基-3-甲氧基-2，6，6-三甲基环己-2-烯酮(其中R，等于 甲基的式(I))
实施例1: 制备重组苯基乙醇脱氩酶
在100ml锥形瓶(档板)中，将如WO2005/1085卯实施例l及2中所述制 备的大肠杆菌(E. coli) LU11558在20 ml的LB-Amp/Spec/Cm (100 ^g/l氨 苄青霉素、100 ng/l壮观霉素、20pg/l氯霉素)、0.1 mM的IPTG、 0.5 g/L 的鼠李糖中37。C培养18小时，以500(^g离心10分钟，用10 mM TRIS *HCl(pH 7.0)洗涤一次，且再悬浮于2 ml相同的緩冲液中。
通过在振动球磨机(3 x5 min, 间隔于冰上冷却)中用0.7 ml玻璃小珠 (d=0.5 mm)将大肠杆菌LU11558细胞糊状物破碎来制备无细胞粗蛋白提取物。
实施例2: 测定获自大肠杆菌LU11558的重组脱氩酶的活性 将10^1无细胞粗提物(实施例1;约10mg/ml总蛋白质)震荡孵育于770 pl的50 mM砩酸钾緩冲液(具有l mM MgCl2, pH 6.5)、 100 pl异丙醇、100 jtl 的NADH溶液(0.5M)及20nl的化合物1(1 M,于DMSO中)的混合物中。类 似于实施例3分析混合物。平均形成0.13 mM的3,4-二羟基-2，6，6-三曱基环己 -2-烯酮。在培养过程中不添加鼠李糖的对照实验中没有可检测的转化。
实施例3: 分析化合物1及化合物2
可通过HPLC来测定前体浓度及产物浓度。除浓度外，还可以根据静 止相和流动相的选择测定ee 。
静止相 Chiralpak AS-RH， 150*4.6毫米，Daicel，在40。C下平衡 流动相 洗脱剂A: 10mMKH2PO4 洗脱剂B: CH3CN 梯度时间l分钟j A％j B[%j 0 90 10
10 90 10
11 60 40 20 60 40
0.5毫升/分钟
于260纳米下进4于UV检测
流速〖毫升/分钟l 0.5 0.5 0.5 0.5
流速 侦测 停留时间
(+)-3，4-二羟基-2,6，6-三甲基环己-2-烯酮: (-)-3，4-二羟基-2，6，6-三甲基环己-2-烯酮:
约9.3分钟 约9.8分钟2-羟基-3，5，5-三甲基环己-2-烯-l，4-二酮约17.6分钟 使用可靠材料，制备校准系列，根据其可以测定未知样品的浓度，及 进行可能对映异构体的排布(assignment)。
实施例4:制备用于辅因子再生的葡萄糖脱氢酶
葡萄糖脱氢酶可用于辅因子再生。该酶可获自商业来源(例如Jiilich Fine Chemicals,订购号第22.10号或第19.10号)或获自内部来源。后者包含 大肠杆菌XLIO Gold克隆，该克隆在质体pUC19(此构建体称为大肠杆菌 LU11293)中包含来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(Genbank登录号 M12276)的葡萄糖脱氢酶基因。
配制以下培养基用于大肠杆菌LU11293的发酵
560 g 酵母萃取物(65。/。)
448 g 胰蛋白胨(Difco)
42 g KH2P04
84 g Na2HP04
644 g 甘油(99%)
l()()mL SL4溶液(5x)
1 g Tegosipon 3062
用水将培养基配至13.51，将pH值调整至7.0，移出约300 ml用于预培养 物(preculture)，然后在122。C下灭菌30分钟。 添加无菌盐溶液*
*盐溶液2.1 g CaCl2 * 2 H20 3.5 g MgS04 * 7 H20 14 g NH4C1
14 ml 氨千青霉素溶液(IOO mg/ml) 溶解于500 ml水中且通过过滤灭菌。
将150 ml部分培养基在两个l l锥形并瓦中灭菌且补充5 ml无菌盐溶液。 从LB-氨千青霉素琼脂板接种后，将预培养物在37。C及200转/分钟下培育12小时，并加至发酵培养基中。在37。C、 O.l巴内部压力、pH7.0(用20。/。磷 酸及25% NaOH控制)下，以7.5 1/分钟的通气速率(gasification rate ) A300 转/分钟(以10-20 1/分钟供风已将pO2控制在20。/。至50Y。之间，且500-1500 转/分钟)开始发酵。2小时后，添加O.l mM IPTG用于诱导，且总计13小 时后，发酵终止。收获细胞(1.3 kg)并洗涤且接着在-20匸下储存直至使用 (2-20 g/1，于混合物中)。
实施例5: 辅因子再生
辅因子的再生亦可通过苯基乙醇脱氢酶来进行。在此情况下，不必要 添加单独的再生酶。苯基乙醇脱氢酶接受多种简单醇(simple alcohol)作为 还原剂。其经氧化为相应羰基化合物。适合于以苯基乙醇脱氩酶再生NADH 的简单醇为异丙醇。如果在反应混合物中使用10%的异丙醇代替葡萄糖脱 氢酶及葡萄糖，则可如实施例2中所示测定苯基乙醇脱氢酶的活性。
实施例6: 使用获自固氮弓菌属物种EbNl的重组苯基乙醇脱氢酶制 备(4S)-3,4-二羟基-2，6，6-三甲基环己-2-烯酮(化合物2)
如实施例l，将大肠杆菌LU11558培养、收获且转化为无细胞粗提物。 将该提取物与0.2 mM NAD+及5.4 ml的1.68 M 3，5，5-三甲基-l,4-二氧代环 己-2-烯-2-醇钠溶液(化合物la)混合且在30"C下孵育48小时。
获自LU11558的无细胞粗提物(《 250 mg总蛋白质)
19.8 g 葡萄糖
0,072 g NAD， Na盐
GI)H粗提物("180 mg总蛋白质)
450 ml緩冲溶液(50 mM磷酸钾、1 mM MgCl2, pH 6.5)
5.4 ml 2-羟基-3，5，5-三曱基-4-侧氧基环己-2-烯醇钠溶液(1.68 M)
在4.75小时的后，添加5.4ml底物溶液，且在6小时的后，添加16.2 ml
底物溶液。通过用5MNaOH及l MHCl滴定^^应物保持pH 6.0-7.0，且
随后进行HPLC分析。实施例7: 使用获自固氮弓菌属物种EbNl的重组脱氢酶制备(4S)-4-羟基-3- 甲氧基-2，6,6-三甲基环己-2-烯酮
如实施例l，将大肠杆菌LU11558培养、收获且转化为无细胞粗提物。 将该萃取物与0.2 mM NAD+及5.4 ml的1.68 M 3，5，5-三甲基-1，4-二氧代环 己-2-烯-2-醇钠溶液混合且在30'C下孵育48小时。
获自大肠杆菌LIJ11SSS的无细胞粗提物(《 20 mg总蛋白质)
19.8 g 葡萄糖
0.014 g NAD， Na盐
10 ml 异丙醇
450 ml 緩冲溶液(50mM磷酸钾、1 mM MgCl2， pH 6.5)
1.822 g 2-甲氧基-3，5，5-三曱基环己-2-烯-1，4-二酮(化合物113)
反应之后进4亍HPLC分析。7小时后，通过添加3.6g2-甲氧基-3，5，5-三 甲基环己-2-烯-l，4-二酮补足前体的量。75小时后，消耗60。/。以上的前体。
图I描绘SEQ ID NO:l，其为来自固氮弓菌属物种EbNl的苯基乙醇脱 氢酶的核,列(Genbank ID 25956124,区域25073至25822)。
图II描绘SEQ ID NO: 2，其为来自固氮弓菌属物种EbNl的苯基乙醇脱 氢酶的氨基餅歹ll(Genbank蛋白ID CAD58337)。
权利要求
1. 制备式(I)的旋光(4S)-4-羟基-2，6，6-三甲基环己-2-烯-1-酮衍生物的方法其中R1为氢、C1-C10烷基、C7-C14芳基烷基、碱金属M1或碱土金属片段M21/2或(M2)+X-，其中M1为Li、Na、K、Rb或Cs，且M2为Mg、Ca、Sr或Ba，且X-为单价阴离子；所述方法包含以下反应步骤，其中在还原等效物的存在下，将选自氧化还原酶类的酶(E)孵育于包含式(II)的三甲基环己-2-烯-1，4-二酮衍生物的培养基中其中R2与R1相同或不同，且为氢、C1-C10烷基、C7-C14芳基烷基、碱金属M1或碱土金属片段M21/2或(M2)+X-，其中M1为Li、Na、K、Rb或Cs，且M2为Mg、Ca、Sr或Ba，且X-为单价阴离子；其中所述式(II)化合物经酶促还原为所述式(I)化合物，且所述反应过程中消耗的还原等效物又通过所述酶(E)或另一种酶(E2)，使还原剂(RM)转化为相应氧化产物(OP)而再生，且任选将至少部分所述氧化产物(OP)从该反应培养基或反应平衡中移除，且分离所形成的所述产物(I)。
2. 权利要求l的方法，其中所述酶(E)为醇脱氢酶。
3. 权利要求2的方法，其中所述醇脱氢酶以NADH或NADPH作为还原 等效物，将所述式(II)化合物还原为所述式(I)化合物。
4. 权利要求1至3中任一项的方法，其中所述酶(E)具有以下多肽序列(i) SEQIDNO:2;或(ii) 与SEQIDNO:2相比，其中多达25%的#^酸残基通过缺失、插 入、取代或其结合改变，且保持了SEQIDNO:2的至少50。/。酶活性的序歹寸。
5. 权利要求1至4中任一项的方法，其中所述酶(E)是选自来自固氮弓 菌属的微生物的酶，尤其是来自固氮弓菌属物种细菌EbNl的酶。
6. 前述权利要求中任一项的方法，其中所述酶由SEQIDNO: l所示的 核酸序列或其功能等效物编码。
7. 前述权利要求中任一项的方法，其中将包含至少一个伯醇或叔醇官 能团CH(OH)的有机化合物用作还原剂(RM),尤其是异丙醇或葡萄糖用作 还原剂(RM)。
8. 前述权利要求中任一项的方法，其中所述式(II)化合物的转化是在 选自以下科细菌的微生物存在下进行肠杆菌科、假单胞菌科、根瘤菌科、 乳酸杆菌科、链霉菌科、红球菌科、红环菌科及诺卡氏菌科。
9. 前述权利要求中任一项的方法，其中所述微生物为核酸构建体转化 的重组微生物，所述核酸构建体编码权利要求l至4中任一项所定义的酶。
10. 前述权利要求中任一项的方法，其中式(I)中的R'为氢、甲基或钠， 尤其为氢或钠。
11. 制备(3S，3'S)-虾青素的方法，其包含前述权利要求中任一项的方法 作为(3s，3'S)-虾青素的总合成中的一个反应步骤。
12. 具有以下多肽序列的酶(E)用于制备式(l)化合物的用途 i"SEQIDNO:2;或ii与SEQIDNO:2相比，其中多达25。/。的氨基酸残基通过缺失、插入、 取代或其结合改变，且保持了SEQ 1D NO:2的至少50。/。酶活性的序列。
13. 权利要求12的用途，其中该式(I)化合物是在其他反应步骤转化为 式(III)的(3S，3'S)-虾青素。
全文摘要
本发明涉及制备式(I)的旋光(4S)-4-羟基-2，6，6-三甲基-环己-2-烯-1-酮衍生物的方法及制备式(III)的(3S，3′S)-虾青素的方法，后面的方法包括前面的方法。
文档编号C12P23/00GK101535495SQ200780041612
公开日2009年9月16日 申请日期2007年11月9日 优先权日2006年11月10日
发明者B·豪尔, H·恩斯特, M·布罗伊尔 申请人:巴斯夫欧洲公司