用于乳制品发酵的具有适当酸化及织构特性的嗜热链球菌菌株的遗传聚类的制作方法

专利名称：：用于乳制品发酵的具有适当酸化及织构特性的嗜热链球菌菌株的遗传聚类的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种用于乳制品发酵的具有适当酸化及织构(texturizing)特性的嗜热链球菌Aemw//n7w^菌4朱(strains)的遗传聚类(cluster)。
背景技术：
：噬菌体是能攻击细菌的病毒。病毒在攻击时，噬菌体感染细菌培养物并繁殖，以最终杀死这种培养物。这些噬菌体对牛奶加工工业(奶酪、酸奶酪及发酵乳的生产)产生非常显著的技术影响，因为它们能导致完全停止发酵并因此阻止这些牛奶的衍生产品的生产。一种对抗关于由噬菌体引起的发酵的感染的问题的方法，是使用对噬菌体具有适当敏感镨的菌林。特别的是，发酵乳的生产者已开发了策略，通过构建由数个具有不同溶菌型的菌林组成的发酵物，且轮流利用数种这些发酵物以对抗噬菌体D明确的是，为了能采取这种策略，拥有具有相同功能(例如酸化、增稠及调味等MS不同溶菌型的多种菌林是非常重要的。嗜热链球菌广泛地以单独或结合其它细菌的方式，用于生产发酵食品。特别的是，它们用于生产酸奶酪的发酵制品中。嗜热链球菌菌林预期通过酸化牛奶参与凝乳形成，以及发酵产品织构的发展过程。嗜热链球菌基于这些功能特性差异，通常可区分为4类(l)非织构及非酸化的菌抹，(2)非织构及酸化的菌抹，(3)织构及非酸化的菌林，以及(4)织构及酸化的菌抹。织构菌林是可以获得发酵乳制品的菌林，其胶体(gel)可根据它们的流变性质描述。至今，在文献中仅描述过四种对应于酸化及织构菌林标准的嗜热链球菌菌林描述于专利申请WO2004/085607中的Sfi39,CNCM1-2423,CNCM1-2426以及菌林CNCM1-2980。这种菌抹的罕见(快速酸化及织构)使其难以对抗乳品发酵期间的噬菌体。事实上，理想地，对抗噬菌体将涉及到具有相似技术特性但不同溶菌型菌抹的相同发酵物的组合，然后轮流利用此形式的发酵物。在轮流中所利用的发酵物亦应具有不同溶菌型但相似的技术特性。在织构及快速酸化发酵物的情况下，这种方法是困难的，因为具有这些功能特性菌林数很少。
发明内容因此，本发明要解决的一个问题是提供新的嗜热链球菌菌林，其具有不同于目前所用菌抹，特别是酸化及织构菌林的溶菌型。针对此目的，本发明涉及遗传聚类中的嗜热链球菌菌林，其具有不同于目前所用嗜热链球菌的酸化及织构菌林的溶菌型。在此聚类中确定了新的酸化及织构菌林。本发明还描述一种可以预测菌林家族中具有相同或相关溶菌型的菌抹成员的方法。此方法分析嗜热链球菌基因组的epsA-B-C-D区域的限制性多态性(polymorphism)。所述epsA-B-C-D区域意指嗜热者连球菌染色体重叠eps位点的epsA至epsD基因的区域。对应此区域、称之为epsAD片段的DNA片段，可利用SEQIDN°l及SEQIDN°2的寡核酸作为探针，藉由嗜热链球菌的DNA染色体上的PCR反应获得。本发明的主题是嗜热链球菌菌林，其epsAD片段在经过限制酶(restrictionenzymes)MnlI，Fokl及Hindlll的消化作用后，具有以344±2碱基对(bp)、341士2bp、305±2bp、299士2bp、277±2bp、210±2bp、160±2bp、142士2bp、100士2bp、79士2bp、75±2bp、66±2bp、42土2bp、23士2bp及9士2bp的DNA片段为特征的限制性谱图。上述epsAD片段的限制性谱图是由epsAD片段的标准测序，接着该限制性谱图经计算机(Insilico)测定而确定。通常，所述序列可在CEQ8000装置(Beckman)上进行，以及限制性谱图的计算机测定可以利用在因特网上经由网站http:〃tools.neb.com/上可得到的NEBcutterV2.0工具，从epsAD片段的序列开始进行。根据本发明的菌林通常包含与SEQIDN°4的核苷酸序列具有至少80%、较佳至少90%、至少95%或至少97%以及更好的是100%的同一性的核苷酸序列。根据本发明的菌抹通常包含与SEQIDN°5的核苷酸序列具有至少80%、较佳至少90%、至少95。/。或至少97%以及更好的是100%的同一性的核苷酸序列。为计算同一性的比例，例如，本领域技术人员将利用"BLAST2Sequences"工具(Tatusova&Madden,1999;http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)和"blastn"程序(针对核苦酸序列的队列)的缺省(default)参数或"blastp"程序(针对蛋白质序列的序列)的缺省参数。利用BLOSUM62矩阵计算两蛋白质序列间的相似性比例。根据本发明的优选菌林是织构的。根据本发明的优选菌林是快速酸化的。根据本发明的优选菌抹是织构的且快速酸化的。关于嗜热链球菌的织构菌抹是指在实施例所描述的情况下，产生发酵乳的菌林具有大于大约35Pa.的黏度、低于大约2000Pa/s的触变(Thixotropic)面积和/或低于大约14Pa的屈服点(yieldpoint)。关于快速酸化菌林是指在实施例所描述的情况下的菌抹，具有低于-0.0100upH/min的Vm。根据本发明的优选菌林是于2006年6月14日保藏于国家微生物菌种保藏中心(CollectionNationaledeCulturesdeMicroorganismes)中编号CNCM1-3617的嗜热链球菌菌林或可从该菌林获得的突变(mutant)菌抹。通常为了得到这样的突变菌林，本领域技术人员可利用惯用的诱变技术例如紫外光照射或暴露于使诱变的化学产品(乙基甲烷磺酸盐、亚硝基胍、亚硝酸等)。优选地，本发明的主题是以法国巴黎市75017布鲁纳尔街20号丹尼斯牙牛法国月殳^分有卩艮7〉司(DaniscoFranceSAS,20ruedeBrunei,75017Paris)的名义在2006年6月14日保藏于国家微生物菌种保藏中心(CollectionNationaledeCulturesdeMicroorganismes)中编号为CNCM1-3617的嗜热链球菌菌抹。从前面所描述的限制性谱图和/或从SEQIDN。4和/或SEQIDN°5的序列开始，本领域技术人员可以确认属于与菌林CNCM1-3617同样的遗传聚类的菌林。通常为了做到这点，本领域技术人员可以利用PCR和/或杂交和/或DNA测序技术。本发明的主题亦是包含至少一种根据本发明的菌林的细菌组合物。关于细菌组合物是指不同菌林，特别是发酵剂或酵母的混合物。根据本发明的较佳菌抹混合物是嗜热链球菌与其它嗜热链球菌的混合物，或嗜热《连球菌与保加利亚乳酸杆菌(Lactobacillusdelbrueckiisubsp.Bulgaricus)的混合物，或嗜热链球菌与其它乳酸杆菌和/或双歧杆菌(Bifidobacterium)的混合物，或嗜热链球菌与乳酸球菌(Lactococcus)的混合物，或嗜热链球菌与其它乳酸菌(lacticbacteria)菌林和/或酵母的混合物。本发明的主题也是具有益生菌(probiotic)特性的食物制品、食品补充剂、膳食补充剂或产品的制造方法，该方法包括利用根据本发明菌抹的步骤。通常具有益生菌特性的食物制品、食品补充剂、膳食补充剂或产品是乳制品、肉类产品、谷类产品、饮品、泡沫或粉末。优选地，具有益生菌特性的食物制品、食品补充剂、膳食补充剂或产品是乳制品。例如发酵乳、酸奶酪、成熟奶油、奶酪、鲜奶酪(fromagefrais)、乳々欠品、乳制品阻留物(retentate)、加工奶酪、奶油甜品、卡迪吉奶酪(cottageCheese)或婴儿奶粉(infantmilk)。通常乳制品包含动物和/或植物来源的乳。本发明的主题也是具有益生菌特性的食物制品、食品补充剂、膳食补充剂或产品，其包含至少一种根据本发明的菌林或前面所描述的细菌组合物。本发明亦描述了从分析其基因组epsA-B-C-D区域的限制性多态性开始预测嗜热链球菌菌林的溶菌型的方法，该方法包括下列步骤(a)利用SEQIDN。1及SEQIDN。2的寡核苦酸作为引物，藉由嗜热链球菌的染色体DNA上的PCR反应扩增epsAD片段；(b)测序epsAD片段；(c)在经过限制酶Mnll、Fokl及HindIII的消化作用后，计算机测定epsAD片段的限制性谱图；以及(d)比较步骤(c)中获得的限制性谱图和溶菌型为已知的嗜热链球菌菌株的epsAD区域的限制性语图。溶菌型为已知的嗜热链球菌菌林的例子列举于表3中。利用以下实施例将更好地说明本发明。给出这些实施例仅为说明本发明主题，其绝不构成限制。图1:具有相似组织及相似的包含epsA、epsB、epsC与epsD基因的5，区域序列的各种嗜热链球菌eps位点的示意图。核苷酸序列的基因序列数据库(GENBANK)编号在括号中给出。。图2:由SEQIDN。l(epsA基因内)及SEQIDN。2(epsD基因内)的引物对准的区域水平的epsA(A)与epsD(B)基因的部分序列的排列。图3:根据各种种种嗜热链球菌菌抹的epsAD法获得的谱图的计算机测定，所述菌抹的eps位点的序列在文献中描述。限制性谱图的影像利用NEBcutter工具(http:〃tools.neb.com/)和以下列参数产生:胶体(gel)类型二2。/0琼脂糖(agarose);标记(marker"100bpDNA梯(Ladder);DNA类型二未曱基化的(Unmethylated);L=102mm。这些菌林的GENBANK编号为AF454496(TypeV),Y17900(NCFB2393),AJ272341(FI9186)，AF454497(TypeVI)，NZ一AAGS01000017(LMD-9),AF454501(TypeXI),AF454498(TypeVII)，AF454495(TypeIV),AF454500(TypeX)，AF454499(TypeIX)，AY057915(TypeIII),CP000023(LMG18311)，CP000024(CNRZ1066),AF434993(MTC360),AF430847(MTC330),AY061649(MR-2C),U40830(Sfi6),Z98171(CNRZ368)，AF448249(MR-1C)。菌林CNCM1-2980的eps序列于WO2004/085607专利申请中叙述。图4:对应序列SEQIDN°3的菌林CNCM1-3617的eps位点的组织示意图。以垂直影线(区域l)表示的开放阅读框(ORF)与位于相对多数的嗜热链球菌菌抹内的eps位点的起始部分的epsA-epsB-epsC-epsD基因具有显著的相似性。以水平影线(区域2)表示的开放阅读框(0RF)与类型XI菌林的epsllE、epsllF、epsl1G及epsl1H基因具有显著的相似性。以棋格图案(区域4)表示的开放阅读框(0RF)与类型IV菌林的eps4F基因具有显著的相似性。介于区域2及3间的灰色长方形表示与类型IV菌林的eps位点具有序列同源性的非编码区域。以对角影线(区域6)表示的开放阅读框(0RF)与CNRZ368菌林中的epsP、epsQ、epsS、epsR及epsT基因具有显著的相似性。无阴影开放阅读框(ORF)(区域3及5)与其它嗜热链球菌描述的eps基因没有显著的相似性。示意图底部的两条黑带表示序列SEQIDN°4及SEQIDN°5的位置。具体实施例方式生物材料表1及表3显示用于于研究的若干菌林。这些菌林中的若干菌林从菌林与噬菌体(phage)的丹尼斯科收藏处(丹尼斯科全球培养菌收藏处(DGCC:DaniscoGlobalCultureCollection))获得。根据标准的微生物学方法完成这些菌4朱培养菌的配制。表l:用于研究的若干菌抹的描述<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>a:基于产业使用及本研究。b:基于eps位点的公开序列结果和/或多糖结构与丹尼斯科公司内部数据。c:基于所研究的菌抹和/或相关菌抹。CNCM1-3617菌林属于新遗传聚类两种嗜热链球菌菌林CNRZ1066及LMG18311的染色体完整序列的最近测定显示此物种中遗传内容与基因组织的高水平保存(BolotinWa/.，2004)。呈现这两种菌林之间的主要遗传差异的其中一个罕见区域对应于eps位点，所述位点编码涉及胞外多糖(exopolysaccharides)的生物合成(biosynthesis)的基因。此外，由于数个eps序列已被确定是各种嗜热链球菌菌林(见期刊论文Broadbent"a/.,2003)，故在该遗传位点水平上(参见第1图)已描述了巨大差异。侧面与deoZ)(编码噪呤核苷磷酸化酶(PurineNucleosidePhosphorylase))以及pgw(编码磷酸葡萄糖变位酶(phospho-glucomutase))基因相接，嗜热链球菌内的eps基因的所有聚类是由保守的近端区域(来自epsA基因至epsD基因)以及非常多变的远端区域所组成。不管epsA-B-C-D基因的保守组织，在此区域内存在显著的序列多态性。该区域的多态性已被用于开发用于嗜热链球菌菌抹遗传分型的工具epsAD法。epsAD法开发的工具是基于epsA-B-C-D区域的特异性扩增(PCR)，接着分析其限制性多态性(RFLP)。针对此目的，已确定了引物，其允许用于大多数的嗜热链球菌菌林的该区域的PCR扩增。它们由epsAD区域(参见图2)的序列的排列确定，并允许DNA片段扩增约2480碱基对(bp)。利用"DNeasyTissueKit"(Qiagen)纯化嗜热链球菌的基因组DNA(genomicDNA)，然后根据以下参数经由PCR扩增epsAD区域反应混合物的组成(50pL):DNA聚合酶緩沖液xl，MgCl22mM,每一dNTP200pM,基因组DNA100至500ng,引物EPSA632(5，-AAATgAATTCAgAgCAAgCACTTg-3,(SEQIDN。l))200nM,引物EPSD1064(5，-gTCATgTCAACTTTATTAAggACg-3，(SEQIDN。2))200nM，DNA聚合酶1.25单位，水加至50)iL。扩增参数-在94'C预变性1分钟；-在94。C循环35次交替变性30秒，在56。C杂交30秒，在72。C延伸3分钟；-在72。C后延伸(post-elongation)6分钟。在扩增之后，PCR产物通过在1.5%的琼脂糖凝胶上电泳来检验。扩增产物的尺寸大约为2480bp。用CEQ8000装置(Beckman)测定PCR段的序列(根据从Sangerea/.，l977参考文献中所衍生的方法)。用NEBcutter工具(例如http:〃tools.neb.com/)通过选择限制酶Mnll，Fokl及HindIII从而建立其以计算机测定的限制性谱图，特别是从而定义该限制性片段的尺寸来处理序列。针对嗜热链球菌菌林，公开的数据库(例如基因序列数据库(GENBANK))中部分或全部可用的eps位点的序列，约为2480bp的PCR片段的理论限制性产物和限制酶Mnll，Fokl及HindIII的计算机分析产生了如图3所示的限制性谱图。这些限制性傳图由计算机在NEBcutter工具(参见表2)提供的限制性片段尺寸的基础上建立。表2:对于可用的epsA-B-C-D基因序列的嗜热链球菌菌抹，通过限制酶MnlI、FokI及HindIII由epsAD片段的计算机消化测定的DNA片段的大小。_<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>或者，PCR产物经由限制酶Mnll，Fokl及HindIII可以在下述的条件下被消化PCR产物15至30pL，2号緩沖液(新英格兰生物科技公司(NewEnglandBiolabs))xl，牛血清白蛋白(新英格兰生物科技公司)xl,酶MnlI(新英格兰生物科技公司)l单位，酶Fokl(新英格兰生物科技公司)l单位，酶HindIII(新英格兰生物科技公司)l单位，水加至50|liL。在37。C孵育1小时。然后通过电泳分析该限制性片段。可以使用琼脂糖凝胶上的电泳。然而，为了补救此类型电泳(精密度+/-10%)的低分辨率以及肉眼观察小于100bp的片段的困难，具有较高分辨率(+/-0.1至1%)的方法，例如微流电泳(Agilent(安捷伦科技))或毛细管电泳可能是优选。这些方法(限制性谱图的计算机分析或限制性片段的电泳分析)应用于嗜热链球菌菌林的来自之丹尼斯科收藏处(Daniscocollection)的数百种菌林以及文献中所描述的参考菌林。具有相同限制性谱图的菌林与CL-1至CL-12代表的遗传聚类(或基因群)合并。藉由Bionumerics软件3.5版进行限制性谱图的比较。表3总结了若干所获得的结果。表3:基因型及溶菌型的结果概要<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>测定菌林对噬菌体的敏感度的方法菌抹对噬菌体的敏感度由溶菌噬斑(lysisplaque)法建立。使用100|ul待测的菌林培养菌以及100^1适当稀释的、包含待研究的噬菌体的血清(serum),以在过冷条件下接种于5ml琼脂培养基(0.6。/。琼脂重量/体积)M17+10mM的补充有CaCl2的葡萄糖中。该混合物被灌注于一固化的琼脂培养基(1.5%琼脂重量/体积)]^117+lOmM的补充有CaCl2的葡萄糖的表面上。在42。C下將化过夜之后，由溶菌噬斑的存在评估菌林对噬菌体的敏感度。缺乏溶菌噬斑表示此菌抹抗噬菌体测试。菌林对噬菌体的敏感度的光谱，亦称为溶菌型，是由对所研究的噬菌体的所有敏感度及抗性所构成。执行具有约60种噬菌体的参考系统，以建立丹尼斯科收藏处(Daniscocollection)的嗜热链球菌菌抹的溶菌型。具有相同溶菌型的菌林聚集在标记为LT-n的不同组中。若干结果列于表3内。它特别证明了实际上相同遗传聚类的菌林总有相同的溶菌型。菌林CNCM1-3617属于称为CL-1的新遗传群组，其具有非常特别的、抵抗所有测试的噬菌体的溶菌型。eps位点的序列关于嗜热链球菌获得的遗传学知识显示eps位点为菌林之间的异质性(heterogeneity)的其中一个主要位点。此项特性已^皮部分4吏用以开发上述的遗传型方法，所述方法利用了为eps位点的近端区域的epsA-B-C-D区域内的差异。更大的差异出现在eps位点的远端区域(编码糖基转移酶的区域，参见图1)。此区域给出了胞外多糖的特异性，并因此诱导至少部分菌林增厚能力的特异性。因此，这是用于明确描述菌林CNCM1-3617以及与其相关菌抹而特别指出的染色体区域。菌林CNCM1-3617(从epsA基因开始)的eps位点的核苷酸序列是由合成的DNA片段获得。利用通常形成文献中所描述的嗜热链球菌的eps位点的保守基因的两种特定引物(编码嘌呤核甘磷酸化酶的flfeoD以及功能未知的or/W.9)，在菌抹CNCM1-3617的纯化的染色体组DNA基质(matrix)上经由PCR合成此片段。来自该菌4朱CNCM1-3617的16037bp的序列对应于SEQIDN。3。序列SEQIDN°4及SEQIDN。5(参见图4)各自对应SEQIDN°3中位置6592至9391以及位置10331至11373。eps位点的遗传组织图4显示藉由其核苷酸的分析建立的菌林CNCMI-3617eps位点的遗传结构的示意图。epsA开放阅读框(ORF)的上游部分，epsAORF的起始序列以及epsTORF的下游部分为未知。序列的分析确认20个ORF，其皆导向相同方向。由于其与其它已知基因的序列相似性和/或藉由产品内存在的由这些ORF编码的特定蛋白质单位，可将推定的(putative)功能加于它们。菌林CNCMI-3617eps位点的结构分析显示其具有与已知的eps位点相似的整体组织(参见图1)。从CNCM1-3617的eps位点的ORF编码的潜在蛋白和那些可从公开数据库(GENBANK)中得到的蛋白的序列对比结果总结于表4中。菌林CNCM1-3617的eps位点编码可能涉及多糖合成的蛋白质，例如糖基转移酶。在这些数据的基础上，可区分出6种区域(区域1至区域6，从eps位点的5'端至3'端；参见图4):区域1:此区域由4种ORF(epsA，epsB，epsC,epsD)形成，由上述ORF编码的蛋白与由位于嗜热链球菌菌林的eps位点内的ORF编码的蛋白具有相当大的相似性(介于95.7%至99.6%间)区域2:此区域由5种ORF(epsE,epsF，epsG,epsG，以及epsH)形成，由上述ORF编码的蛋白与由位于类型XI菌4朱(GENBANK编号AF454501)的eps位点内的ORF编码的蛋白具有相当大的相似性(介于96.6%至99.3%间)。区域3:此区域由3种ORF(epsJ,K以及epsL)形成，由上述ORF编码的蛋白与文献中描述的蛋白具有足够的相似性(少于81%),以分配给它们可能的功能。然而这些ORF显然是有别于已在文献中描述过的ORF。区域4:此区域由1种ORF(epsM)形成，由上述ORF编码的蛋白与由位于类型IV菌林的eps位点的eps4FORF编码的蛋白具有相当大的相似性(95.4%)。区域5:此区域由2种ORF(epsN以及epsO)形成，由上述ORF编码的蛋白与文献中描述的lactobacillae蛋白具有足够的相似性(少于91%),以分配给它们可能的功能。然而这些ORF显然是有别于已在文献中描述过的嗜热链球菌内的ORF。区域6:此区域由5种ORF(epsP，epsQ,epsS，epsR以及epsT)形成，由上述ORF编码的蛋白与由位于CNRZ368菌抹(GENBANK编号Z98171)的eps位点的ORF编码的蛋白具有相当大的相似性(介于98.9%至100%间)。大体说来，eps的远端部分类似基因的杂种集合，某些基因以前未曾描述过。表4:菌林CNCM1-3617的eps位点的ORF分析。其位置相应于序列SEQIDN°3中ORF的开始及结束的核苦酸。可能的功能为由ORF序列编码的蛋白质的功能。最佳相似性为蛋白质或编码蛋白质(蛋白质序列的GENBANK编号标示于括号内)与由ORF编码的蛋白质具有最大相似性。分数为使用"blastp"工具(Protein-proteinBLAST,http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)所获4寻的最佳相似性的相似性百分比。<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>酸化特性通过将100ml半脱脂的(semi-skimmed)UHT牛乳(LePetitVend6en⑧)补充至3y。(重量/体积)的脱脂奶粉(SUP，RTOP,EurialPoitouraine)中获得发酵载体。通过在卯。C(于中心)力。热杀菌IO分钟获得无菌溶液。将要检测的菌林以106cfu/ml的速率接种于由此得到的发酵载体中，接着在43。C(在水浴中)孵育。利用CINAC装置(Ysebaert)连续地监测PH值。嗜热链球菌菌林的酸化特性能藉由其最大酸化速率Vm(pH单位/分钟(pHu/min))描述，所述Vm藉由pH曲线一次微分后的最大值作为时间的函数计算。根据这些操作条件，据估计其变量为菌林的特征。无论微生物接种于牛乳以及接种水平的生理状态，其值为常数。区分了两类菌抹所谓的慢酸化菌林(其Vm大于-0.0100pHu/min)和所谓快酸化菌林(其Vm小于一0.0100pHu/min)。菌林CNCM1-3617明显属于所谓的快酸化菌林类(表5)。此特性通常与基因组中编码壁蛋白酶PrtS的基因菌林的存在有关，所述PrtS能在CNCM1-3617的基因组中被检测。表5:在所描述操作条件下评估的嗜热链球菌不同菌抹的最大酸化速率。<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>织构特性通过将100ml半脱脂的(semi-skimmed)UHT牛乳(LePetitVend6en⑧)补充至3。/。(重量/体积)的脱脂奶粉(SUP，RTOP,EurialPoitoumine)中获得发酵载体。通过在9(TC(于中心)力。热杀菌IO分钟获得无菌溶液。将要检测的菌株以10、fu/ml的速率接种于由此得到的发酵载体中，接着在43。C(在水浴中)孵育直到pH为4.6。利用CINAC装置(Ysebaert)连续地监测pH值。由此得到的发酵乳置于6"C的通风烤箱内直到它们被分析。进行两种类型的流变测量黏度与流动。针对在6。Cl&藏1、7、14以及28天后的发酵乳，在温度8。C进行縣度测量。所利用的设备为一架设于升降支架(Helipathstand)(BrookfieldEngineeringLaboratories,Inc.)上的RVF型Brookfield⑧翻度计(BrookfieldEngineeringLaboratories,Inc.)。该l占度计配备有C型针且适用于该针的振荡速度为10rpm。针对在6。C贮藏14天后已预先搅拌的发酵乳，在温度8。C进行流动测量。所利用的设备为配备有同轴圆柱(半径l=15mm，半径2二13.83mm，高32mm，空气间隙二2mm)的AR1000-N流变仪(rheometer)(TA仪器公司)。对于上升线段，应用于连续扫描的应力根据线性模式在1分钟内从0到60Pa变化。对于下降线段，应用于连续扫描的应力根据线性模式在1分钟内从60到0Pa变化。考虑到的数值有触变面积及屈服点；后者根据Casson模式计算。在第一阶段中，藉由在以上所描述的操作条件下取得的凝乳的黏度测量，可计算出菌林的织构能力。当织构菌林超过40Pa.s时，认可的非织构菌抹提供接近30Pa.s的黏度数值。织构能力会更明显或更不明显(表6)。例如菌林CNCM1-2979产生黏度达到42Pa.s的凝乳，而菌林DGCC7966可以获得70Pa.s的明显更高的黏度。菌抹CNCM1-3617提供翻度等于54Pa.s的凝乳(表6)。此数值将此菌抹定位在具有与目前用于设计乳发酵的工业菌林有足够可比性的织构能力的菌抹群内，所述乳发酵用于制备酸奶酪及发酵乳制品。表6:在6。C下储存14天后，用测试的不同菌林获得的发酵乳的黏度<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>Nd:未测定利用AR1000-N流变仪的流变分析可以测量到与-睑证发酵乳相关的两种流变描述符产品的屈服点(Pa)以及触变面积(Pa/s)。针对每一菌林，这些测量报告列于表7中。针对具有菌林CNCM1-3617的发酵乳，其平均值分别为11.25Pa及352Pa/s。这些数值明显不同于由被认为是非织构菌林(DGCC7766或DGCC7919)获得的凝乳上测得的数值。表7:以Casson模式、AR1000-N流变仪测量用不同菌抹在6。C下储存14天后的发酵乳制品的屈服点及触变面积的值<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>Nd:未测定结论针对酵素结构特别是针对在生产酸奶酪及发酵乳期间所利用到的酵素结构，菌林CNCM1-3617具有数种值得关注的特质。其显现出罕见的功能特性的组合(酸化及增稠菌林)以及其溶菌型有别于用于这些应用的标准方法的其它菌抹。参考文献BolotinA,QuinquisB,RenaultP,SorokinA,EhrlichSD，KulakauskasS，LapidusA,GoltsmanE,MazurM,PuschGD,FonsteinM,OverbeekR,KypridesN,PumelleB，ProzziD,NguiK，MasuyD,HancyF,BurteauS,BoutryM,DelcourJ,GoffeauA,HolsP(2004).Completesequenceandcomparativegenomeanalysisofthedairybacterium淑肠tec/z"o/.22(12),1554-1558.BourgoinF，PluvinetA,GintzB，DecarisB，GuedonG(1999).Arehorizontaltransfersinvolvedintheevolutionofthe》一ococcws/zermo//n7t^exopolysaccharidesynthesislociGe"e.233(1-2),151-161.B腦dbentJR，McMahonDJ,WelkerDL,ObergCJ,MoineauS(2003).Biochemistry,genetics,andapplicationsofexopolysaccharideproductionin//zermop緒ws:areview.JD勿86(2),407-423.DocoT，WiemszeskiJM,FoumetB,CarcanoD,RamosP,LoonesA(1990).Structureofanexocellularpolysaccharideproducedby5Vre77,ococcwsC"o—士to.198(2),313-321.Ge誦ndJE，DelleyM，D，AmicoN，VincentSJ(2001).Heterologousexpressionandcharacterizationoftheexopolysaccharidefrom6Vr，ococc"51//zemo//n7wsSfi39.五wrJ^/oc/ew.268(19),5149-5156.LemoineJ,ChiratF,WiemszeskiJM，StreckerG，FavreN,NeeserJR(1997).StructuralcharacterizationoftheexocellularpolysaccharidesproducedbytSVr一ococcws^zerwop/^7tASSFi39andSFi12.^;//五"v/rowA/z'croWo/.63(9),3512-3518.LowD,AhlgrenJA,HomeD,McMahonDJ,ObergCJ,BroadbentJR(1998).RoleofiSVr一oc(ccwsZ/zer歸//n7wsMR-ICcapsularexopolysaccharideincheesemoistureretention.如/五謂簡M/c油o/.64(6)，2147-2151.MarshallVM,LawsAP,GuY，LevanderF,RadstromP,DeVuystL,DegeestB,VaningelgemF，D觀H,ElvinM(2001).Exopolysaccharide-producingstrainsofthermophiliclacticacidbacteriaclusterintogroupsaccordingtotheirEPSstructure.丄e"如/滅c油W.32(6),433-437.RalluF，TaillezP,EhrlichD,RenaultP(2002).Commonschemeofevolutionbetweenclustersofthefoodbacteria^SVrep/ococcwsAe/7no;/n7j^andc/wclustersofthepathogenicstreptococci.Proc.6thAm.Soc.Microbiol.Conf.onStreptoeoccalGenetics,Asheville,NC.Page112.SangerF，NicklenS,CoulsonAR(1977).DNAsequencingwithchain-terminatinginhibitors.尸匿淑"ca"cit/SA74(12),5463-5467.StingeleF,NeeserJR，MolletB(1996).Identificationandcharacterizationofthee/w(Exopolysaccharide)geneclusterfrom》e/Zococci^Z/zerwop/n7wsSfi6.J5a"enW.178(6)，1680-1690.TatusovaTA,MaddenTL(1999).BLAST2Sequences,anewtoolforcomparingproteinandnucleotidesequences.FEMSMicrobiolLett.174(2),247-250.权利要求1、嗜热链球菌菌株，其epsAD片段在经过限制酶MnlI、FokI及HindIII的消化后，具有以344±2bp、341±2bp、305±2bp、299±2bp、277±2bp、210±2bp、160±2bp、142±2bp、100±2bp、79±2bp、75±2bp、66±2bp、42±2bp、23±2bp及9±2bp的DNA片段为特征的限制性谱图。2、如权利要求l所述的菌林，包含与SEQIDN。4的核苷酸序列具有至少80%同一性的核苷酸序列。3、如权利要求1至2中任一项所述的菌抹，包含与SEQIDN。5的核普酸序列具有至少80%同一性的核苷酸序列。4、如前述任一项权利要求所述的菌林，其特征在于该菌林是织构的。5、如前述任一项权利要求所述的菌林，其特征在于该菌林快速酸化。6、如前述任一项权利要求所述的菌林，其特征在于该菌林为于2006年6月14日保藏于国家微生物菌种保藏中心、编号为CNCM1-3617的嗜热链球菌菌林或可从该菌抹获得的突变菌林。7、嗜热链球菌菌林，其于2006年6月14日保藏于国家微生物菌种保藏中心、编号为CNCM1-3617。8、细菌组合物，包含至少一种前述任一权利要求所述的菌林。9、具有益生菌特性的食物制品、食品补充剂、膳食补充剂或产品的制造方法，该方法包括至少一个利用权利要求1至7中任一所述的菌林的步骤。10、如权利要求9所述的方法，其中具有益生菌特性的食物制品、食品补充剂、膳食补充剂或产品是乳制品、肉类产品、谷类产品、饮品、泡沫或4分末。11、具有益生菌特性的食物制品、食品补充剂、膳食补充剂或产品，其包含权利要求1至7中任一项所述的至少一种菌抹或权利要求8所述的细菌组合物。12、乳制品，其包含权利要求1至7中任一项所述的至少一种菌林或权利要求8所述的细菌组合物。13、如权利要求12所述的乳制品，其特征在于该乳制品是发酵乳、酸奶酪、成熟奶油、奶酪、鲜奶酪、乳4t品、乳制品阻留物、加工奶酪、奶油甜品、卡迪吉奶酪或婴儿奶粉。14、如权利要求12或13所述的乳制品，其特征在于该乳制品包含动物和/或植物来源的乳。全文摘要本发明涉及嗜热链球菌菌株的遗传聚类，其具有异于目前所使用菌株的溶菌型。在此聚类中已确定新的酸化及织构菌株。文档编号C12N1/20GK101595210SQ200780041774公开日2009年12月2日申请日期2007年10月2日优先权日2006年10月3日发明者克里斯托夫·弗雷莫,埃莉斯·马努里,帕斯卡尔·富尔卡谢,菲利普·霍瓦特申请人:丹尼斯科公司