生成具有至少一种改变特性的淀粉的方法和工具的制作方法

专利名称：：生成具有至少一种改变特性的淀粉的方法和工具的制作方法生成具有至少一种改变特性的淀粉的方法和工具本发明涉及淀粉的生成和应用领域。本发明尤其涉及生成具有至少一种改变特性的淀粉的方法和工具，其包含将淀粉蔗糖酶编码序列导入产淀粉的植物中。淀粉是植物中最丰富的储备碳水化合物。淀粉以晶体颗粒状贮存，通常包括两种多糖，直链淀粉和支链淀粉。在植物存储器官中，淀粉生物合成发生在淀粉形成体中。蔗糖是淀粉生物合成的起点。已知许多不同的反应和酶进一步参与淀粉生物合成。尽管近年来已对淀粉结构进行了深入研究，但是一些淀粉生物合成的机制仍然令人困惑。还未十分清楚的机制之一是确定淀粉颗粒大小的机制。淀粉是不同食品和工业应用的重要原料。工业应用的一些例子是用作食品增稠剂，用于造纸表面上胶，以及用于生成其中分散治疗化合物的緩释基质。淀粉是否适合特定应用是由其特性，如例如其颗粒大小、理化性质和非淀粉成分如蛋白质和脂肪的存在决定的。淀粉的特性例如影响淀粉的选择和加工，因此对于淀粉加工企业有重要意义。因此该行业对具有不同特性的淀粉表现出相当大的兴趣。由于淀粉行业对具有不同特性的淀粉感兴趣，因而对生成具有改变特性的淀粉的方法和工具有需求。本发明现在提供生成具有至少一种改变特性的淀粉的方法和工具。本文提供的发明一方面是根据将淀粉蔗糖酶编码序列导入产淀粉植物的淀粉生成体，使所述植物生成的淀粉至少一种特性改变的研究结果。本发明在一个实施方案中提供改良产淀粉植物的方法，其包含将包含与颗粒靶向序列功能性连接，并与所述植物淀粉贮存器官中活性启动子序列功能性连接的淀粉蔗糖酶编码序列的核酸导入所述植物的合适植物材料中。在另一实施方案中，本发明提供生成具有至少一种改变特性的淀粉的方法，其包含将包含与颗粒耙向序列功能性连接，并与植物淀粉贮存器官中活性启动子序列功能性连接的淀粉蔗糖酶编码序列的核酸导入所述植物的合适植物材料中，并从所述材料生成植物，还包含使所述植物生长，并从所述植物收集淀粉。当与其中还未导入淀粉蔗糖酶编码序列的相同种植物的淀粉相比，淀粉特性改变时，应理解淀粉具有改变的特性。特性指淀粉的任何参数，因此所述特性例如指结构和/或物理性质和/或化学性质。对于本发明而言，植物和/或产淀粉植物被定义为其中生成淀粉，优选所述淀粉在专门质体，即淀粉生成体中生成的任何植物。产淀粉植物的非限制性例子为根用作物，如木薯、马铃薯、红薯、芋头、山药、甜菜或萝卜；谷物如玉米、小麦、水稻、高梁、大麦；产水果的物种，如香蕉、苹果、番茄或梨；膳食作物，如大豆或豌豆；油籽作物，如油菜籽、油菜、向日葵、油椋、椰子、亚麻籽或落花生。优选产淀粉的植物为马铃薯植物，更优选含直链淀粉的马铃薯植物，如Kardal品种。对于本发明而言，适合的植物材料指其中可导入淀粉蔗糖酶编码序列和进一步的序列的任何植物材料。适合的植物材料或是天然产生的物质或是人工合成的物质。自然产生的植物材料例如非常早期的植物材料，如种子或小芽的材料。优选的合适植物材料是原生质体。对本发明而言，原生质体指-使用机械的或化学的，如酶的方法完全或部分去除细胞壁的植物细胞。原生质体可以例如使用微组织增殖法再生整个植林。使植林生长应理解为使所述植物保持/或置于其能生长的的环境中。对本发明而言，淀粉蔗糖酶指包括生物体，优选细菌生成的任何淀粉蔗糖酶，和/或任何天然、合成或重组的具有淀粉蔗糖酶活性的化合物。具有淀粉蔗糖酶活性的化合物例如已被截短的淀粉蔗糖酶。这样截短的淀粉蔗糖酶例如由提供带有编码所述淀粉蔗糖酶的截短基因的生物体生成。所述截短的基因编码至少一种功能性淀粉蔗糖酶和任选的另外序列。淀粉蔗糖酶是葡糖苷水解酶GH13家族的成员。更具体地说，它是例如由不同细菌，如奈瑟氏菌、趋磁球菌和聚球蓝细菌的非致病菌生成的己糖基转移酶。根据本发明的淀粉蔗糖酶编码序列优选编码与奈瑟氏菌产生的淀粉蔗糖酶优选至少70%，更优选至少80%,更优选至少90%，更优选至少95%,最优选95%以上同源或一致性的淀粉蔗糖酶，其中所述奈瑟氏菌优选多糖奈瑟球菌(DeMontalketal.1999)。优选地，根据本发明的淀粉蔗糖酶编码序列编码与图12中所示的淀粉蔗糖酶序列至少70%,更优选至少80%，更优选至少90%，更优选至少95%,最优选95%以上同源或一致性的淀粉蔗糖酶。在本发明的一个实施方案中，所述淀粉蔗糖酶编码序列中的一个或多个核酸被保守取代。淀粉蔗糖酶编码序列通常是核酸序列。对本发明而言，核酸一般包括但不一定包括DNA或RNA。核酸优选包含核苷酸A、C、G、T和/或U。这些核普酸或者是核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸和/或其他核苷酸类似物，如合成的核苷酸类似物。对本发明而言，其中核芬酸类似物指包括肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA),或者骨架或糖修饰的核糖核苷酸或脱氧核糖核酸。此外，本发明核酸序列中的核苷酸任选被相应的能与互补核酸序列形成类似氢键的核苷酸取代。这种取代的例子是U被T取代。产淀粉植物中导入淀粉蔗糖酶编码序列是指向所述植物提供淀粉蔗糖酶编码序列，这样所述序列在所述植物的细胞中内化。本文包括其中所述植物在导入淀粉蔗糖酶编码序列前最初不包含淀粉蔗糖酶编码序列，以及其中所述植物最初包含淀粉蔗糖酶编码序列的情况。功能性连接于其他序列，例如颗粒靶向序列和启动子序列的淀粉蔗糖酶编码序列的导入，可通过将核酸导入本领域技术人员可获得的细胞中的任何方法实现。将核酸导入细胞的方法包括基因转移和转化方法。基因转移和转化方法的例子是通过4丐、聚乙二醇(PEG)或电穿孔介导的DNA摄入、植物组织电穿孔、微注射、碳化硅介导的DNA摄入和微粒轰击的原生质体转化。优选转化方法是载体介导的转化和/或农杆菌介导的转化方法。非常优选的转化方法是根癌农杆菌介导的转化方法。导入的序列优选在所述植物中稳定表达的。因此，本发明的方法优选包含所述序列整合到所述植物细胞的基因组中。整合确保长期、可再现和确定的基因表达。下面更详细讨论的是，没有与颗粒靶向序列连接的淀粉蔗糖酶编码序列对一些淀粉特性也有影响。在优选实施方案中，根据本发明的淀粉蔗糖酶编码序列功能性地连接颗粒靶向序列。颗粒靶向序列是靶向淀粉颗粒，即选择性针对和/或结合淀粉颗粒的任何序列。所述颗粒耙向序列优选的例子包含马铃薯颗粒结合淀粉合酶(GBSSI)和淀粉结合域(SBD)。可以使用的颗粒靶向序列进一步的例子为生物条件下连接淀粉的酶的那些部分，和/或已知降解淀粉的酶的结合域。在本发明的优选实施方案中，所述颗粒靶向序列包含SBD编码序列。SBD属于碳水化合物结合组件(CBMs)家族。CBM通常指带有具有碳水化合物结合活性的恰当折叠的碳水化合物活性酶中的连续氨基酸序列。此定义的个别例外为纤维素体支架蛋白中的CBMs和独立的推定CBMs。CBMs作为更大酶中组件存在的要求使此类碳水化合物结合蛋白有别于其他非催化糖结合蛋白，如凝集素和糖转运蛋白。对本发明而言，SBD优选阿尔法葡聚糖结合域家族的成员，更优选阿尔法葡聚糖结合域家族20、21、25、26、34或41的成员。SBD编码序列通常是核酸序列。由于SBD性质上一般与降解酶结合，所以SBD实际上主要涉及淀粉降解的情形。但是本发明的方法在不同情形即在淀粉生物合成中使用SBD。SBD通常约IOO个氨基酸长度。虽然由于其折叠和推定的3D结构，SBD的氨基酸序列在不同酶和不同种中不是非常保守，但仍被归为相似的(Machovic，2005)。对本发明而言，SBD例如来自a-淀粉酶、P-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶或CGT酶。生成包含SBD的酶的种例如黑曲霉、环状芽孢杆菌、淤泥链霉菌、热产硫磺梭菌、施氏假单胞菌或肺炎克氏杆菌。根据本发明的SBD编码序列编码与芽孢杆菌生成的SBD优选至少70。/。，更优选至少80%,更优选至少90%，更优选至少95%,最优选95%以上同源或一致的SBD,其中所述芽孢杆菌优选环状芽孢杆菌，其中所述SBD编码序列优选环糊精葡萄糖基转移酶(Lawsoneta1.1994)。优选地，根据本发明的SBD编码序列编码与图11所示SBD至少70%、更优选至少80%、更优选至少90%、更优选至少95%、最优选95%以上同源或一致的SBD。本发明的一个实施方案中，所述SBD编码序列中一个或多个核酸被保守取代。在优选实施方案中，SBD是环糊精葡萄糖基转移酶的SBD和/或来自环状芽孢杆菌的SBD。在另一优选实施方案中，根据本发明的SBD或其他颗粒靶向序列与环状芽孢杆菌环糊精葡萄糖基转移酶的SBD的大小近似或完全相同，即IO-14kDa,优选12kDa。在本发明的一个实施方案中核酸包含超过一个颗粒耙向序列，例如两个、三个、四个或五个。文中定义为使基因转录的序列，优选核酸序列，其中所述转录将至少发生在所述淀粉储存器官中和/或毗邻所述淀粉储存器官。所述启动子在本发明的一个实施方案中是所述淀粉储存器官特异性的。所述启动子的所述特异性是仅对所述淀粉储存具特异性，或对于所述淀粉储存器官和所述植物的其他组成部分而言是特异性的。或者所述启动子是一般性启动子(即优选植物所有部分中活性的和/或优选所有条件下活性的启动子)。在本发明一个实施方案中，所述启动子是诱导启动子。对本发明而言，淀粉储存器官指其中积累淀粉的植物的一部分。这样的部分的例子包括块茎、茎、根、种子或种子胚乳。优选的部分是块茎，优选的块茎是马铃薯。组织特异性启动子的例子列于表2，优选的启动子是马铃薯的马铃薯块茎蛋白启动子。在优选实施方案中，本发明提供根据本发明的方法，其中所述核酸进一步功能性连接于淀粉形成体靶向序列。在本发明的另一优选实施方案中，提供根据本发明的方法，其中所述淀粉形成体耙向序列包含转运肽编码序列。对本发明而言，包含转运肽编码序列的淀粉形成体靶向序列指至少对淀粉形成体具特异性的序列，其中所述转运肽编码序列将所述序列特异性地导向淀粉形成体。淀粉形成体靶向序列的优选例子是铁氧还蛋白转运肽编码序列。转运肽的进一步例子是马铃薯GBSSI转运肽、分支酶(BEI和/或BEII)的转运肽、R-酶(水二激酶)和可溶性淀粉合酶I、11和/或III，和/或异淀粉酶的不同同工型(Stisal、Stisa2和Stisa3)。对本发明而言，功能性连接的序列指包括连接的序列，这样所有涉及的序列导入生成淀粉的植物时定向同样的位置，这样所有涉及的序列能互相配合发挥其特有功能。所述功能性连接可通过不同类型的结合实现。进一步地，所述序列可直接互相连接，或间接连接。直接连接的序列的例子为一个核酸构建物中临近相互连接的序列。或者序列是间接连接的，例如所述序列在相同的核酸构建物中，但一个或多个其他序列(例如框内接头序歹'j(inframelinkersequence))在功能性连接的序列之间，或者例如所述序列在不同的核酸构建物中，并功能性连接。在本发明方法的一个实施方案中，另外的序列被导入生成淀粉的植物中。所述另外的序列或者功能性连接前述核酸序列，或者没有功能性连接但在导入所述前述序列的同时和/或之前和/或之后被导入。所述另外的序列例如编码在所述淀粉和/或植物中形成进一步修饰的化合物。所述化合物例如酶，如淀粉分支酶、乙酰转移酶、曱基化酶和R-酶。所述R-酶是参与淀粉磷酸化的葡聚糖酶水二激酶GWD。由于细胞的淀粉储存器官可有利地用于生成蛋白质，所以在本发明的一个实施方案中所述化合物是蛋白。其他另外的序列是导入序列的表达中必须和/或有帮助的序列，所述另外的序列优选功能性连接所述导入序列。这样的另外的序列的例子为启动子或终止子序列。在优选实施方案中，本发明提供改良生成淀粉的植物的方法，其包含将包含淀粉蔗糖酶编码序列的核酸导入本发明所述植物的合适植物材料中，该淀4分蔗糖酶编码序列功能性连接于颗粒輩巴向序列，并功能性连接于所述植物的淀粉储存器官中的活性启动子序列，或本发明提供了生成具有至少一种改变特性的淀粉的方法，其包含将包含淀粉蔗糖酶编码序列的核酸导入所述植物的合适植物材料中，并从所述材料生成植物，所述淀粉嚴糖酶编码序列功能性连接于颗粒靶向序列，并功能性连接于植物淀粉储存器官中活性启动子序列，其进一步包含使所述植物生长，并从所述植物收集淀粉，其中假如所述另外的序列不是分支酶和/或假如之前尚未向所述合适植物材料提供编码分支酶序列，则任一所述方法进一步包含导入另外的序列。本发明的方法优选包含筛选步骤。所述筛选步骤在导入根据本发明的序列后进行，并包含植物的筛选，其中所述导入的序列被表达，优选稳定表达。篩选其中序列被导入和/或表达的植物和/或细胞的各种体系对本领技术人员而言是可获得的。为了便于所述筛选，在本发明的方法中核酸优选功能性连接筛选标记。或者筛选标记没有功能性连接所述核酸，但与所述核酸同时导入，例如在第二共同转染的载体上共同表达。筛选标记包含有助于确定是否序列已导入和/或在植物和/或细胞中稳定表达的序列。筛选标记优选包含赋予抗性的序列，例如赋予抗生素抗性的序列。这样的赋予抗性的序列的例子是编码新霉素磷酸转移酶、二氢叶酸还原酶(DHFR)，或谷氨酰胺合成酶的序列。在一个实施方案中，所述赋予抗性的序列作为筛选盒导入，即包含至少对诱导所述赋予抗性的序列的表达具特异性的启动子序列，并进一步包含至少终止所述导入的赋予抗性的序列的终止子序列而导入。在本发明方法的优选实施方案中，载体用于将序列导入产淀粉的植物中。在此实施方案中，所述赋予抗生素抗性的序列优选包含在所述载体中。所述载体进一步优选包含其他序列，其中所述其他序列优选用于噬菌体克隆，例如多接头序列。载体优选的例子为商业上可获得的载体pBlueScript。在本发明的另一实施方案中，本发明的方法无需《吏用篩选标记即可进行。在此实施方案中，优选使用无标记转化的方法，例如在WO03/010319中有描述。在优选实施方案中，本发明提供根据本发明的方法，其中包含功能性连接于颗粒靶向序列并功能性连接启动子序列的所述核酸编码融合蛋白。对本发明而言，融合蛋白指通过基因工程从两个或多个蛋白/肽创造的。这是通过创造融合序列实现的。为创造融合序列，优选除去第一蛋白核酸序列的终止密码子，随后第二蛋白的核酸序列框内附接。当两个序列为蛋白和/或肽编码序列时，优选加入接头或间隔肽编码序列，以促进得到的融合蛋白中所述序列编码的蛋白和/或肽部分的独立折叠。因此在一个实施方案中，本发明提供包含淀粉蔗糖酶编码序列、淀粉结合域(SBD)编码序列和启动子序列的核酸。优选地，所述核酸不包含另外的编码分支酶的另外的核酸序列。在本发明的一个实施方案中，所述核酸中包含的所述启动子为块茎专一性启动子。在另一实施方案中，本发明提供包含淀粉蔗糖酶和淀粉结合域(SBD)的融合蛋白。优选地，所述融合蛋白不包含分支酶。所述核酸或所述融合蛋白的淀粉结合域优选与图ll中所示SBD序列至少70。/。，更优选至少80%,更优选至少90%，更优选至少95%,最优选超过95%同源或一致。本发明进一步提供根据本发明的融合蛋白，其进一步包含淀粉形成体转运肽。在优选实施方案中，本发明提供根据本发明的融合蛋白，其中所述淀粉结合域包含环糊精葡萄糖基转移酶的淀粉结合域。在优选实施方案中，本发明提供融合蛋白，其中颗粒靶向序列编码的序列位于淀粉蔗糖酶的N或C端侧。所述颗粒靶向序列优选淀粉结合域。在本发明的优选实施方案中，所述颗粒靶向序列位于淀粉蔗糖酶的N端侧，即顺序为N-(颗粒靶向序列)-(淀粉蔗糖酶)-C。因此在本发明的优选实施方案中，纟艮据本发明的方法包含将核酸导入产淀粉的植物中，该核酸包含功能性连接于颗粒靶向序列，并功能其中所述功能性连接的颗粒靶向序列导入比所述淀粉蔗糖酶编码序列更靠近启动子的位置。在本发明一个实施方案的例子中阐明，此例子中为SBD的颗粒靶向序列的位置对得到的融合蛋白的特性有显著影响。本发明此实施方案中所述位置例如影响植物中融合蛋白的积累水平。此实施方案中所述积累水平进一步与改变的淀粉颗粒百分比有关。在本发明的此实施方案中，更高水平的积累产生更高百分比的改变的淀粉颗粒。被本发明提供的方法和工具改变的重要特性是淀粉颗粒大小。颗粒大小对淀粉应用而言是重要因素。取决于生物来源，淀粉颗粒大小变化可从小于lpm至大于100fxm。以马铃薯为例，淀粉颗粒大小变化范围5至10(im。由于颗粒大小在许多工业应用中是如此重要的因素，因而工业界对改变淀粉颗粒大小感兴趣。通过分离技术得到具有特定所需大小的淀粉颗粒是可能的，例如作为淀粉加工过程一部分的气流筛分(windshifting)、千或湿筛或通过旋液分离器分离。但是这样的分离需要加工中额外的步骤，导致效率损失。因此，如果能通过改变植物中淀粉的生成控制淀粉颗粒大小，这样植物生成的淀粉颗粒大小被改变，则是有利的。本发明提供通过提供生成具有至少一种改变特性的淀粉的方法来提供这样的控制方法，其包含向产淀粉的植物导入淀粉蔗糖酶编码序列。淀粉蔗糖酶的生物学功能是来自蔗糖的直链淀粉样聚合物的合成。本领域技术人员应预期，产淀粉植物中导入淀粉蔗糖酶编码序列会对淀粉颗粒的直链淀粉含量有影响。然而本发明公开了其中产淀粉植物中导入淀粉蔗糖酶编码序列后，未导致直链淀粉含量的明显变化的试验。另一方面，颗粒大小没有明显变化。因此，本发明在一个实施方案中提供生成具有至少一种改变特性的淀粉的方法，其包含将包含功能性连接于颗粒靶向序列，并功能性连接于植物淀粉储存器官中活性启动子序列的淀粉蔗糖酶编码序列的核酸导入所述植物的合适植物材料中，并从所述材料生成植物，其进一步包含使所述植物生长，并从所述植物收集淀粉，其中所述改变包含淀粉颗粒大小的增加。在另一实施方案中，本发明提供改良产淀粉植物的方法，其包含将包含功能性连接于颗粒靶向序列，并功能性连接于所述植物淀粉储存器官中活性启动子序列的淀粉蔗糖酶编码序列的核酸导入所述植物的合适植物材料中，其中所述改变包含淀粉颗粒大小的增加。淀粉颗粒大小的所述增加指与未导入淀粉蔗糖酶编码序列的同种和/或类似种的植物，即与对照植物的淀粉颗粒大小相比的增加。所述增加可以是绝对增加，即所述对照植物没有或一般没有生成具有所述增加的颗粒大小淀粉的淀粉颗粒，和/或所述增加可以是平均颗粒大小的增加。本发明的方法优选淀粉颗粒大小增加1.5，更优选增加1.6，更优选增加1.7，更优选增加1.8，更优选增加1.9，最优选增加2.0或更多。本发明的实施例表明淀粉蔗糖酶融合蛋白表达的颗粒大小增加。马铃薯植物中包含淀粉蔗糖酶和淀粉结合域的融合蛋白的表达导致淀粉颗粒大小增加大约两倍。因为淀粉颗粒大小的增加例如改善湿磨效率，并因此改善淀粉得率，所以淀粉颗粒大小的增加例如对于更小的淀粉，如玉米、芋头和木薯淀粉通常是所需的。除绝对增加外，所述增加为相对增加，例如颗粒大小分布的改变，其中所述分布向更大颗粒移动。因此，本发明在一个实施方案中提供了根据本发明的方法，其中所述改变和/或变化包含所述植物生成的淀粉颗粒大小分布向更大颗粒移动。产淀粉的植物生成不同大小的淀粉颗粒。植物生成的每种淀粉类型有其特有的大小分布。因此淀粉颗粒大小被有利地表示为大小的分布。所述大小的分布例如表明淀粉颗粒大小的一致性。本发明的方法在一个实施方案中增加淀粉颗粒大小的所述一致性，例如实施例的图9表示的。工业应用中使用的淀粉例如优选淀粉颗粒大小一致。例如包含具有更一致大'J、颗粒的淀粉有更一致的凝胶化作用特性，这在许多加工过程中是有利的。在另一实施方案中，本发明提供根据本发明的生成具有至少一种改变特性的淀粉的方法，其中所述改良和/或改变进一步包含淀粉颗粒形态学的改变。所述淀粉颗粒形态学指所述淀粉颗粒的形状或形式。所述形状或形式的外在方面例如通过光学和/或扫描电镜(SEM)可见。淀粉颗粒形态学的所述改良例如包含淀粉颗粒表面加上多糖。所述淀粉颗粒形态学的所述改良优选使淀粉颗粒与对照植物的淀粉颗粒相比外形粗糙的改良。所述粗糙的外形例如包括所述淀粉颗粒表面突出和压痕都更多。进一步地，淀粉形态学的所述改变包括相对于对照植物生成的淀粉颗粒有更多的孔隙。所述更多孔隙的淀;盼颗粒至少外层孔隙更多。由于更多孔隙的特性改善例如工业应用的衍生化过程，所以更多孔隙的淀粉颗粒是有利的。所述衍生化过程包括所有衍生化过程，但优选化学衍生化过程。本发明公开了淀粉蔗糖酶的表达，甚至没有导入颗粒靶向序列即可影响淀粉颗粒形态学。因此，本发明在一个实施方案中提供了制备具有至少一种根据本发明的改变特性的淀粉的方法，其中所述改变包含淀粉颗粒形态学的改变。在另一实施方案中，本发明提供改良根据本发明的产淀粉的植物的方法，其中所述改良包含淀粉颗粒形态学的改变。但是优选地，本发明提供改良生成淀粉的植物和/或生成具有至少一种根据本发明的改变特性的淀粉的方法，其包含向生成淀粉的植物导入核酸，该核酸包含功能性连接于颗粒靶向序列，并进一步糖酶编码序列。基于没有颗粒靶向序列的淀粉蔗糖酶也影响颗粒形态学的事实，本发明在另一实施方案中提供改良产淀粉的植物的方法，其包含将核酸导入所述植物的合适植物材料中，该核酸包含功能性连接"蔗糖酶编码序列，或生成具有至少一种改变特性的淀粉的方法，其包含将核酸导入所述植物的合适植物材料中，该核酸包含功能性连接于所述植物淀粉储存器官中活性启动子序列的淀粉蔗糖酶编码序列，并从所述材料生成植物，进一步包含使所述植物生长，并从所述植物收集淀粉。正如试验部分中本文所述的，与淀粉蔗糖酶的N端偶联的颗粒靶向序列以及仅淀粉蔗糖酶得到可消化性增加，尤其是被Ot-淀粉酶消化的可消化性增加的淀粉。一般a-淀粉酶对马铃薯淀粉消化得不是非常好，因此改善淀粉可接近性必需的oc-淀粉酶量多。本发明现在提供具有提高的可消化性的淀粉，这意味着释放了更多的糖，因此可得到更高的热量值。因此，本发明还提供改良产淀粉植物的方法，其包含将核酸导入所述植物的合适植物材料中，该核酸包含功能性连接于所述植物淀粉储存器官中活性的启动子序列，并任选地N端功能性连接于颗粒耙向序列的淀粉蔗糖酶编码序列，或提供生成具有至少一种改变特性的淀粉的方法，其包含将核酸导入所述植物的合适植物材料中，并从所述材料生成植物，所述核酸包含功能性连接于所述植物淀粉储存器官中活性的启动子序列，并任选地N端功能性连接于颗粒耙向序列的淀粉蔗糖酶编码序列，进一步包含使所述植物生长并从所述植物收集淀粉。优选地，所述改良或改变包含可消化性增加，甚至更优选a-淀粉酶可消化性增加。优选改变的淀粉和/或淀粉颗粒的特性是淀粉黏性。所述淀粉黏性例如通过淀粉黏性分布作图测量。改变的淀粉黏性参数的例子是峰黏度、糊化起始温度和淀粉糊黏度。本发明因此在一个实施方案中提供根据本发明的生成具有至少一种改变特性的淀粉的方法，其中所述改变的特性是淀粉韵度。本发明在另一实施方案中提供根据本发明的淀粉，其中与对照植物的淀粉颗粒相比至少改变了一种淀粉颗粒的一种特性，其中所述特性为淀粉都度。在优选实施方案中，淀粉黏度降低。这意味着当应用于工业体系或加工时，此淀粉不必用氢氧化钠大规模降解。因而可降低使用的NaOH的量。本发明在一个实施方案中提供包含根据本发明的核酸和/或融合蛋白的细胞。进一步地，本发明提供包含根据本发明细胞的植物或其部分，或根据本发明的方法制备的植物或其部分。植物的所述部分可以是植物的任何部分，但优选淀粉储存器官。因此，本发明在优选实施方案中提供根据本发明的植物的部分，其中所述部分为淀粉储存器官。在本发明的优选实施方案中，所述植物为马铃薯植物。本发明因此在优选实施方案中提供根据本发明的植物或其部分，其中所述植物是马铃薯植物。在另一优选实施方案中，本发明提供根据本发明的植物或其部分，其中所述部分是块茎。在本发明的优选实施方案中，所述块茎是马铃薯。尽管本发明适合任何产淀粉的植物，但所述植物优选含直链淀粉的植物。因此本发明在优选实施方案中提供根据本发明的植物或其部分，其中所述植物为含直链淀粉的马铃薯植物。本发明提供生成淀粉的新方法和工具。本发明因此提供通过根据本发明的方法可获得和/或获得，和/或从根据本发明的植物和/或其部分可获得和/或获得的淀粉。在本发明的一个实施方案中，相对于未导入淀粉蔗糖酶编码序列的相同种植物，即对照植物生成的淀粉颗粒，淀粉颗粒的特性改变。本发明因此提供根据本发明的淀粉，其中与对照植物的淀粉颗粒相比，一种淀粉颗粒的至少一种特性改变。优选改变的特性为淀粉颗粒大小。本发明因此提供根据本发明的淀粉，其中所述特性为淀粉颗粒大小。与对照植物相比，所述颗粒大小优选增加的。本发明因此在优选实施方案中提供根据本发明的淀粉，其中所述淀粉颗粒大小是增加的。优选改变的另一特性为淀粉颗粒形态学。本发明因此在一个实施方案中提供根据本发明的淀粉，其中进一步地淀粉颗粒形态学改变。本发明还提供根据本发明的淀粉和/或淀粉颗粒的衍生物。这样的衍生物的例子为加工的淀粉，淀粉的支链淀粉组分和衍自淀粉颗粒的蛋白组分，其中编码蛋白的至少一种另外的序列被导入产淀粉的植物。优选地，当与不包含淀粉蔗糖酶的植物生成的淀粉相比，平均淀粉颗粒大小更大。而且大小分布更小。此外，本发明提供包含根据本发明的植物或其部分，和/或根据本发明的淀粉和/或淀粉颗粒的任何产物。根据本发明的产物例如为食品和/或工业产品。工业品的例子为纸产品、织物经纱添加剂和粘合剂化合物。食品的例子例如炸马铃薯片、面包或谷类食物。本发明因此在一个实施方案中提供食品和/或工业品，其包含根据本发明的植物或其部分，和/或根据本发明的淀粉。本发明进一步在一个实施方案中提供细菌，优选农杆菌，更优选根癌农杆菌，其包含功能性连接于颗粒靶向序列，并功能性连接淀粉储存器官中活性启动子序列的淀粉蔗糖酶编码序列，和/或包含根据本发明的融合蛋白。本发明进一步提供本发明提供的所有工具的用途。本发明因此例如提供用功能性连接于颗粒靶向序列，并功能性连接淀粉储存器官中活性启动子序列的淀粉蔗糖酶编码序列，生成具有至少一种改变特性的淀粉的用途。本发明还提供根据本发明的融合蛋白、细胞、植物或其部分、淀粉和/或产物的用途。本发明将在下面的非限制性实施例中更详细地解释。实施例材料和方法种建辆餅在此研究中制备了三个不同的构建物，pBIN20/AS-SBD和pBIN20/SBD-AS质粒用于在含有直链淀粉的马铃薯植物(Kardal)中分别表达AS-SBD和SBD-AS融合蛋白。pBIN20/AS质粒用作对照，其中淀粉蔗糖酶在没有颗粒(SBD)靶向序列的情况下导向淀粉形成体。pBIN20/AS-SBD质粒如下构建AS-SBD基因的表达盒首先在pBlueScript载体中由三个DNA片段装配(1)块茎特异性马铃薯块茎蛋白启动子和铁氧还蛋白信号序列(XhoI-BamHI)，(2)AS-SBD片段(Bamffl-Pstl)，以及(3)NOS终止子序列(EcoRV-KpnI)。AS-SBD片段(BamHI-PstI)由pTrcHisB/AS-SBD质粒，通过PCR,使用下列引物扩增5'-CGAAAAGGATCCCCCGAAT-3'和5'-TCTCTGCAGCGCCAAAACA-3',所述引物分别含有BamHI和Pstl位点。pBlueScript/AS-SBD用Xhol和Kpnl消化，片段(XhoI-Kpnl)插入pBIN20载体的相应位点，得到质粒pBIN20/AS-SBD(图1)。马铃薯块茎中累积的期望AS-SBD融合蛋白的大小预计分子量为86,468Da,不包括转运肽。为制备pBIN20/SBD-AS质粒，SBD-AS片段(Bamffl-Pstl)由pTrcHisB/SBD-AS质粒，通过PCR,用引物5'-TGACGAAAAGGATCCATTGTC-3'和5'-TACTGCAGGCATTTGGGAA-3'扩增，所述引物分别含有BamHI和Pstl位点。扩增的SBD-AS片段(BamHI-Pstl)用于取代pBlueScript/AS-SBD质粒中的AS-SBD片段，生成质粒pBlueScript/SBD-AS。其余过程与pBIN20/AS-SBD所述的同样进行。得到的质粒称为pBIN20/SBD-AS(图1)。马铃薯块茎中累积的SBD-AS融合蛋白预期分子量为86,110Da，不包括转运肽。为制备pBIN20/AS质粒，通过PCR扩增，使用pGSTAS质粒为模板，用引物5'-CGAAAAGGATCCCCCGAAT-3'和5'-TACTGCAGGCATTTGGGAA-3'得到淀粉蔗糖酶编码片段，所述引物分别含有BamHI和Pstl位点。植物表达的AS预期分子量为72,466Da,不包括转运肽。所有构建物由DNA测序证实。一i參/一^，存^根据Visseretal(1991)所述的三元杂交方案，pBIN20/AS、pBIN20/AS-SBD和pBIN20/SBD-AS质粒转化到根癌农杆菌中。含有直链淀粉(Kardal)的马铃薯节间茎部分用于含所述质粒的农杆菌介导的转化(Visseretal,1991)。收集每种构建物的超过50个独立的苗。检测苗在含有卡那霉素(IOOmg/L)的MS30培养基中的根部生长(MurashigeandSkoog，1962)。繁殖每种构建物的三十林转基因形成根的苗，转移到温室进行块茎发育。此外10林未转化的对照在温室中生长。此研究中得到的转化体系列称作KDAxx、KDAS:o:和KDSA，其中A、AS和SA分别代表淀粉蔗糖酶、淀粉蔗糖酶-SBD和SBD-淀粉蔗糖酶融合蛋白，xx代表克隆号。此研究中KD-UT表示未转化的对照植林。AS差^脊z夷參^"fW确定总RNA根据Kuipers"fl/.(1994)使用5g(鲜重)马铃薯块茎材料，从水冻植物材料制备。电泳(1.5%(w/v)琼脂糖、15%曱醛(w/v))后,RNA转移到尼龙膜Hybond-N(Amersham,Amersham，UK)上过夜。膜在pH-7.2，含7%(w/v)SDS、0.5。/。磷酸钠(w/v)緩冲液和lmMEDTA的改良church緩沖液中65。C杂交过夜。膜用["P]标记的淀粉蔗糖酶DNA片段(BamHI-Pstl)为探针进行杂交；用ra^primeTMlI试剂盒(Amersham，Amersham,England)根据制造商操作指南进行标记。膜于65。C用2xSSC洗涤一次5分钟，用lxSSC洗涤30分钟，每种都含0.1%(w/v)SDS。块叙婦为、庠合并来自每种温室生长克隆的五棵植抹的所有块茎，用/MC尸^/er去皮器(Spangenberg，TheNetherlands)除去植抹的皮去皮的块茎用S朋am^Aotor(Spangenberg)匀浆，经筛过滤去掉颗粒物质。得到的匀浆4。C使其沉降至少20分钟至过夜，收集块茎汁备用，-20。C保存。淀粉沉淀物水洗三次，最后室温风干(JiW"/.,2003)。蛋^#,《伊遂々#确;€餘差^/定粉的^^^1)^S5D-AS蛋^含#12.5。/。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶(50x50x3mm)，带9个等间距的孔(0=9mm)，与类似大小HybondECL硝酸纤维素膜(AmershamPharmaciaBiotech,UK)接触。20mg(转基因)淀粉力。200iliL2xSDS样品緩沖液(MurashigeandSkoog,1962)加热煮沸5分钟。冷却至室温，淀粉凝胶转入其中一个孔中。转基因淀并分凝胶的蛋白用PhastSystem(Pharmacia,Uppsala,Sweden;20V，25mA,15。C,45min)(JiWfl/.，2003)印迹到膜上。AS-SBD和SBD-AS融合蛋白根据Ji"a/.(2003)所述的方法，用抗SBD抗体鉴别。蛋^,乂伊遂为V/f确定块JV/^AS-幼"和幼Z)"S蛋冷舍量可溶组分中的AS-SBD和SBD-AS融合蛋白如下确定。500^L块茎汁冷冻干燥。干燥的材料溶解在200pL2xSDS样品緩沖液中，在有20mg对照样品的淀粉存在下煮沸5分钟。现有的淀^f分凝胶加到SDS-PAGE凝胶的其中一个孔里。其余过程与颗粒结合蛋白质中所述的同样方式进行。鹏潜合凝合蛋《伊遂》Vf淀粉颗粒结合蛋白的免疫印迹如Nazarian"(2006b)所述，用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行。50毫克的KDAS2和KDSA2干淀粉样品溶解在1mLSDS样品緩冲液(终浓度1MTris-HCL，pH6.8,2%SDS(w/v),10。/。甘油(w/v),3%卩陽巯基乙醇(w/v))中煮沸2分钟，然后进行凝胶分析。25微升上样到12%聚丙烯酰胺凝胶凝胶的泳道上(145mmx95mmx3mm,BioRad,UK)。蛋白转移到HybondECL硝酸纤维素膜(AmershamPharmaciaBiotech,Amersham，UK)上，如之前部分所述用抗SBD进行免疫印迹。淀為、微辦/緒#》、#淀粉平均颗粒大小和颗粒大小分布用配有IOO]um孔管(Beckman-Coulter，HighWycombe,UK)的CoulterMuldsizerII确定。大约10mg淀粉分散在160mL的IsotonII中。颗粒大小分布通过计数记录为约50,500(±500)个颗粒。重合(两个颗粒同时进入管的频率，因此被计为一个)设为10%。淀粉颗粒形态学用光学显微镜(LM,Axiophot,Oberkochen，Germany)和扫描电镜(SEM,JEOL6300F,Tokyo,Japan)研究。使用LM时，淀粉颗粒用20x稀释的Lugol，s溶液(1。/。12/KI)染色。使用SEM时，干燥淀粉颗粒用双面的粘性碳月交带(EMS,Washington,U.S.A.)封固在黄铜架上，溅射包被金(EdwardsS150B,Crawley,England),随后转移到FESEM(JEOLJSM-6300F，Tokyo,Japan)。用SE^r测分析样品并记录，于5kV、工作距离15mm。所有图{象以扫描速率100秒(全帧)、2855x2154，8比特大小，数字记录(Orion，6E丄丄sprl,Belgium)。表观直链淀粉含量根据Hovenkamp-Hermelink"(1989)所述的方法确定。淀粉颗粒开始胶凝的温度用差示扫描量热法(DSC)，使用配有NeslabRTE-140glyco-冷却器的Perkin-ElmerPyris1(Perkin-Elmer,Vlaardingen，TheNetherlands)确定(Ji"a/"2003)。淀粉凌占度参数使用ThermoHaakerheoscope(ThermoHaake，Karlsruhe,Germany),由5%(w/v)和2。/。(w/v)淀粉混悬液测量。该机器配有平行板机构(类型C70/1Ti),缝隙大小0.1mm。记录振荡剪切应变，频率为lHz。将淀粉混悬液(5%和2%)每分钟2°C，由40。C升至90。C，90。C保持15分钟，以2。C/分钟冷却至20。C，恒定温度20。C保持15min,得到所述淀粉混悬液的糊化分布图。测量淀粉特性，如Tg(开始胶凝温度)、Tp(峰值温度)和相应温度。随后为检查线性粘弹性区域的测量线性，将样品置于振幅扫描区域，其中应力和应变振幅互成比例。/定為、含f^确定大约50mg马铃薯块茎材料于60。C溶解在0.5mL25%HC1和2mL二曱亚砜(DMSO)中1小时。孵育后混合物用5MNaOH中和，并用O.lM柠檬酸盐緩冲液(pH4.6)稀释至终体积10mL。20pL的水解淀4分才羊品用测试试剂盒(Boehringer-Mannheim，Mannheim,Germany),根据制造商的说明酶解测定。脊J:^/定粉链长为、有为测试链长分布，5mg转基因马铃薯淀粉混悬在250^DMSO中，沸腾温度下胶凝化10分钟。冷却至环境温度，加入PH4.0的700^150mMNaAc緩冲液。往混合物加入足量的使淀粉聚合物完全去分支的月夷淀净分酶(HayashibaraBiochemicallaboratories,Okayama,Japan;59,000U/mg蛋白)，混合物40。C培养2小时。沸腾温度下酶失活10分钟后，加入lml25%DMSO。照这样使用样品，进行高效尺寸排阻色谱(HPSEC)。HPSEC在配有串联的三个TSKgdSWXL柱(一个G3000,两个G2000:300mmx7.5mm;Montgomeryville,USA)和TSKgelSWX1保护柱(40mmx6mm)的p680HPLC泵系统(Dionex，Sunnyvale,Cal.USA)上，于35。C下进行。使用戴安ASI-IOO自动进样器进样IOOfxl等分，随后用IOmMNaAc緩冲液(ph5.0),流速0.35ml/min洗脱(3h运行)。流出物用RID-6A折射计(Shimadzu,theNetherlands)监测。系统用葡聚糖标准(10,40,70,500kDa;Pharmacia)校准。用Dionexchromelon软件版本6.50SP4BuildIOOO控制HPLC系统并进行数据处理。HPAEC用来更好地分离更小的支链淀粉侧链(245个葡萄糖残疾范围内)。HPAEC在配有carboPacPA100柱(4mmx250mm;Dionex)的GP40梯度泵系统(Dionex)上，于35。C进行。流速为1.0mL/min,用DionexAS3500自动进样器进样20pl。使用两种洗脱液，洗脱液A(100mmNaOH)和洗脱液B(1MNaAc的100mmNaOH溶液)，混合以下梯度0—5分钟，100%洗脱液B(淋洗阶段)；5—20分钟，100%洗脱液A(调节阶段)；20—25分钟，线性梯度0—20%洗脱液B(100—80。/。洗脱液A);25—50分钟，线性梯度20—35。/。洗脱液B(80—65。/。洗脱液A);50—55分钟，线性梯度35—50。/。洗脱液B(65—50。/。洗脱液A);55—60分钟，50。/。洗脱液B(50。/。洗脱液A)。样品在20分钟时进样。洗脱液用脉冲安培计模式的ED40电化学检测器(Dionex)监测。,r絲鰣為、絲潜10mg部分(转基因)块茎淀粉在含有10mM蔗糖的1mL50mMTris-HCl(pH7.0)中，于40。C持续混合下孵育48和96(小时)。孵育后，样品离心(7，500x&10min)，收集上清,根据Nazarian"(2006a)所述，通过HPAEC测量蔗糖、葡萄糖和果糖浓度。淀粉沉淀用水洗三次，室温风干。用异淀粉酶去分支后，淀粉用HPAEC和GPC检测不同链长分布。絲棘经a-淀為、麟赠20mg(转基因)淀粉混悬在lmL50mMNaOAc緩沖液(pH6.9)中，用10uoc-淀粉酶(猪胰脏，Sigma,TheNetherlands),于37°C处理4小时。未加入a-淀粉酶的样品用作对照。孵育后，样品离心(13000xg，2min)。根据Dubois通过酚-硫酸分析法分析总的糖含量，包括上清的葡萄糖和麦芽低聚糖(MOS)。结果淀為、^"潜雜^脊差^/定粉覆粒^v,濕邀分農积在此研究中，由多糖奈瑟球菌的成熟淀粉蔗糖酶和环状芽孢杆菌环糊精葡萄糖基转移酶的淀粉结合域(SBD)编码区组成的三个不同的开放阅读框(ORFs)在pBIN20双载体中制备。马铃薯的马铃薯块茎蛋白启动子的950个碱基对片段(Wenzler"a/.,1989)以及叶绿体铁氧还蛋白信号肽(PilonWa/.,1995)置于ORFs的5'端，分别诱导其块茎特异性表达和淀粉形成体进入(图l)。经温室生长，与对照植物比较，就形态学和表现型而言，植物看上去正常。使用蛋白质点印迹分析，用抗SBD血清，考察A&x和SAxx系列转基因马铃薯植物中融合蛋白的表达(Ji"a/.，2003)。根据突变体flw/系列中SBD2的表达，用从0+至6+的数字，使用打分方法(Jie,a/.,2004)。转基因马铃薯植物分成6个不同的类别，用0+表示无蛋白，用6+表示融合蛋白累积的最高水平(图2A)。基于蛋白质点印记分析的融合蛋白转化体的筛选表明，具有更高量融合蛋白累积的转化体比具有较少融合蛋白累积的转化体多(图2B)。从AS-SBD转化体的30个中的n个(56.70/。)和SBD-AS转(X2=12.56,PO.OOl)。此外，颗粒靶向序列(SBD)的位置似乎影响融合蛋白的累积水平，即SBD-AS融合蛋白的累积量显著大于(乂2=9.36,PO.001)AS-SBD融合蛋白，因为差不多所有SBD-AS转化体(除了0+类中的3个)显示的强度与4+相当或更高(图2B),而未冲企测到具有更低蛋白累积的转化体。对选定转化体的马铃薯汁液可溶性组分部分进行一些蛋白质点印迹分析。选定转化体的淀粉颗粒及其相应汁液组分中蛋白检测结果总结于图3。从图中可看出，汁液中发现融合蛋白从l+类别起。在这种情况下，颗粒及其相应汁液组分中融合蛋白累积水平有一些相关(图3)。为确定马铃薯块茎中仅导入的淀粉蔗糖酶的表达水平和转化体筛选，用从块茎材料提取的总RNA进行Northem印迹分析(因为缺乏淀粉蔗糖酶抗体)。基于mRNA转录物水平(图4.上方的图)，使用28rRNA核糖体4笨针为内对照，确认三种不同分类(无、低和高)(图4.下方的图)。百分之16、12、16和56的转化体净皮分类为高(H)、中(M)、低(L)和无(N)表达体系。脊差弱發郝參叙微封淀為、激凝为测定马铃薯植物的淀粉颗粒中累积的融合蛋白的存在，通过SDS-PAGE及随后的免疫印迹检测，使用抗SBD分析每种融合蛋白的一种代表的性质不同的淀粉颗粒结合蛋白(图5)。识别其中与预期86.1kDa的SBD-AS和86.5kDa分子量的AS-SBD分别很好地对应的约85kDa的蛋白。未发现对照植物的淀粉条带(图5)。这些结果清楚地显示，淀粉生物合成过程中，淀粉蔗糖酶已被成功定向淀粉颗粒。淀痴^^^^在这炎淀為、教在攻f转基因马铃薯淀粉的光学显微镜和扫描电镜(SEM)成像显示，淀粉颗粒形态学受到很明显的影响。融合蛋白的表达导致不同颗粒形态学改变。C-和N-末端同源的SBD融合蛋白的改变颗粒的外观是不同的(图6,比较C和D)。令人惊讶的是，仅淀粉蔗糖酶表达即影响淀粉颗粒形态学。但是改变的淀粉颗粒的外观与融合蛋白表达系统不同(图6,将B与C和D比较)。所有三种不同系列转化体的淀粉颗粒表面是不同的，与其他两种相比，SA转化体的额外多糖层更厚。就额外多糖层而言，AS和仅淀粉蔗糖酶表达体系的表面似乎是相同的，但是淀粉蔗糖酶表达体系有小的突出(图6,比较F和H)。为定量不同种类融合蛋白(图7)和不同淀粉蔗糖酶表达体系中改变的淀粉颗粒的数量，计数不同转化体的两百个颗粒。图7强调了两条主要信息。第一、蛋白水平和改变的淀粉颗粒百分比间似乎有相关性，第二、N末端SBD(SBD-AS)似乎对淀粉颗粒作用稍大些。在淀粉蔗糖酶转化体中发现高(H)和中等(M)淀粉蔗糖酶表达体系的改变的颗粒分别为15%(±1.2)和6%(±2.1)。^"S万Z)^US射衷i^炎jr在义小增>淀粉颗粒大小通常以大小分布表示，大小分布是特定淀粉类型特有的。虽然仅淀粉蔗糖酶的表达改变了淀粉形态学(图6F)，但未使颗粒大小改变(表l)。相反地，AS和SA融合蛋白的表达使颗粒大小显著增加了两倍，从平均20.8pm增加到47.4(图9)。在AS和SA系列中，83%(30个中的25个)和70%(23个中的16个)显示颗粒大小比对照植物大(20.8pm)。就SBD位置而言，两个系列中最好的转化体显示颗粒大小增加相同倍数(图9)。为比较AS和SA系列的平均颗粒大小，进行单向ANOVA(方差分析)(表l)。就SBD位置而言，AS和SA转化体系列的淀粉颗粒大小没有明显差异(F=1.09，P=0.343)。相关分析显示，两个系列的SBD水平(种类)和颗粒大小之间有正相关。但是此相关在AS转化体中(pO.001)比SA转化体(p-0.078)更强。^^"《义覆在^#差&孩參^/定#^"不^^參！#V4迄今为止已阐明融合蛋白形式的淀粉蔗糖酶对淀粉颗粒大小的影响。我们的试验还指出颗粒大小的确与颗粒中累积的蛋白量有关。下一个问题是有更大的颗粒会给淀粉性质带来什么影响？淀粉黏度测定分析表明，具有更大颗粒的转基因淀粉与对照淀粉和小颗粒淀粉的特性不同。如表1所示，具有更大颗粒淀粉的起始温度(Tonset)稍高。但是，这不像在蛋白质水平中那样反映相关性。随其在恒定搅拌方式下加热并冷却到初始温度(20°C)形成的淀粉黏度分布图在转化体中各不相同。淀粉峰值黏度(淀粉胶凝过程中达到的最高黏度，通常与所有颗粒膨胀至其最大水平的点相应)在转基因植物中各不相同。在AS和SA系列中，当颗粒大小增加到约30pm时，峰值熟度降低，但随后增加(图IO)。冷却过程中淀粉浆的黏度也受颗粒大小的影响。进一步黏度试验的结果在表3中提供。使用3%的最佳淀粉浓度，这样淀粉颗粒高温下爆裂开前，可最大程度膨胀。每个值独立地测定三次。使用的温度为55至85。C，升幅每分钟1。C。这些结果显示，wtKardal马铃薯和根据本发明的方法得到的植物之间黏度大不不同。SBD-淀粉蔗糖酶和淀粉蔗糖酶-SBD使淀粉的峰值黏度明显地下降以及使淀粉颗粒大'J、明显地提高。一些/定為Vf/^发^"效i^:^还分析了淀粉性质如表观直链淀粉含量(。/。AM)和起始温度。未观察到显著变化。转化体的淀粉产率与对照植物相同。异淀粉酶完全去分支后，链长分布概况图与未转化的植物相当(数据未显示)。为得到不同蔗糖浓度存在下激活的颗粒结合淀粉蔗糖酶，用转基因淀粉进行的收集后试验未显示任何直链淀粉样聚合物合成，或未显示HPAEC分布图的任何改变，表明蔗糖分解和葡萄糖消耗(数据未显示)。"-/定為、凝义^^/定為、>^在W^T^必^W确定还确定了生成的淀粉的可消化性。图13显示结果。由此图明显可见，淀粉蔗糖酶植物的可消化性增加。表l.显示了不同淀粉性质的概述。<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>德=蛋白质印迹，d50=颗粒大小中值，AM-表观直链淀粉含量，NcN未检测到，*、"分别表示a-0.05和a-0.01时显著，ns-不显著。表2.组织特异性启动子(种子和块茎)<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>DSC=示差扫描量热法PSD=颗粒大小分布WT=cvKardalPV=以帕秒(Pascalsecond)为单位的峰值黏度d50=以毫米为单位的直径中值ND=未确定的参考文献1.BaiimleinH,WobusU,PustdlJ,KafatosF(1986)Thelegumingenefamily:structureofaB-typegeneofViciafabaandapossiblelegumingenespecificregulatoryelement(豆J求蛋白基因家族蚕豆B型基因的结构和可能的豆球蛋白基因特异性调控元件).NucleicAcidsRes14:2707-2720.2.BaiimleinH,BoerjanW,NagyI,BassunerR,VanMontaguM,InzeD,WobusU(1991)AnovelseedproteingenefromViciafabaisdevelopmentallyregulatedintransgenictobaccoandArabidopsisplants(转基因烟草和拟南芥植物中调节蚕豆新型种子蛋白基因的发育).MolGenGenet225:459-67.3.DeMontalkGP,Remaud-SimeonM,Willemot腿，PlanchotV，MonsanP(1999)SequenceanalysisofthegeneencodingamylosucrasefromNeisseriapolysacchareaandcharacterizationoftherecombinantenzyme(多糖奈瑟球菌的编码淀粉蔗糖酶的基因的序列分析和重组体酶的表征).JBacteriol181:375-81.4.GatehouseJA,BownD，Evan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同源的淀粉蔗糖酶。8.根据权利要求l-7中任一项的方法，其中所述SBD编码序列编码与图11的序列至少70%同源的SBD。9.根据权利要求l-8中任一项的方法，其中所述改良或改变包含淀粉颗粒大小的增加。10.根据权利要求l-9中任一项的方法，其中所述改良或改变包含所述植物生成的淀粉颗粒大小分布向更大颗粒的移动。11.权利要求9或10中任一项的方法，其中所述改良或改变进一步包含淀粉颗粒形态学的改变。12.核酸，其包含淀粉蔗糖酶编码序列、淀粉结合域(SBD)编码序列和启动子序列。13.根据权利要求12的核酸，其中所述启动子是块茎特异性启动子。14.融合蛋白，其包含淀粉蔗糖酶和淀粉结合域(SBD)。15.根据权利要求14的融合蛋白，其进一步包含淀;除形成体转运肽。16.根据权利要求14-15中任一项所述的融合蛋白，其中所述淀粉结合域包含环糊精葡萄糖基转移酶的淀粉结合域。17.根据权利要求14-16中任一项的融合蛋白，其中所述淀粉结合域与图11的SBD序列至少70%同源。18.细胞，其包含权利要求12或13中任一项的核酸，和/或包含根据权利要求14-17中任一项的融合蛋白。19.植物或其部分，其包含根据权利要求18的细胞，或根据权利要求l的方法生成。20.权利要求19的植物的部分，其中所述部分为淀粉储存器官。21.根据权利要求20的植物或其部分，其中所述植物为马铃薯植物。22.根据权利要求19-21中任一项的植物或其部分，其中所述部分是块茎。23.权利要求19-22中任一项的植物或其部分，其中所述植物为含直链淀粉的马铃薯植物。24.淀粉，可通过根据权利要求2-ll中任一项的方法获得，和/或可从根据权利要求19-23中任一项的植物和/或其部分获得。25.根据权利要求24的淀粉，其中与来自对照植物的淀粉颗粒相比，至少改变了一种淀粉颗粒的一种特性。26.权利要求25的淀粉，其中所述特性为淀粉颗粒大小。27.根据权利26的淀粉，其中所述淀粉颗粒大小是增加的。28.根据权利要求26或27的淀粉，其中改变了进一步的淀粉颗粒形态学。29.食品和/或工业品，其包含根据权利要求19-23中任一项的植物或其部分，和/或才艮据权利要求24-28中任一项的淀粉。全文摘要本发明提供改良产淀粉的植物的方法，以及生成具有至少一种改变特性的淀粉的方法。本发明尤其提供生成淀粉的方法，其包含将包含功能性连接于颗粒靶向序列，并功能性连接于所述植物的淀粉储存器官中活性启动子序列的淀粉蔗糖酶编码序列的核酸导入所述植物的合适植物材料中，并从所述材料生成植物，进一步包含使所述植物生长，并从所述植物收集淀粉。本发明还提供具有改变特性的淀粉，和包含这种淀粉的植物及其部分和产品。此外，本发明提供融合蛋白，以及包含这种融合蛋白的细胞。文档编号C12N15/82GK101595221SQ200780041799公开日2009年12月2日申请日期2007年8月28日优先权日2006年9月11日发明者F·纳扎里安菲劳扎巴迪,J·-P·文克肯,R·G·F·维瑟申请人:瓦赫宁恩大学