专利名称：一种妊娠相关血浆蛋白a的检测方法
技术领域：
本发明涉及一种免疫检测方法，尤其涉及一种妊娠相关血浆蛋白A的检测 方法。
技术背景唐氏综合征(Down syndrome, DS)是常见的严重危害胎儿的染色体病。目 前，世界各国均在开展产前筛査唐氏综合征方面的研究工作。由于产前血清标 志物筛査具有无创伤性，能最大限度减少羊膜腔穿刺或取绒毛所造成的创伤。近年来，最受到关注的标志物之一，就是妊娠相关血浆蛋白A (pregnancy-associated plasma protein, PAPP-A) ， PAPP-A为一种灵敏度 高、特异性强的血清标志物。PAPP-A是由2个PAPP-A分子与2个嗜伊红主要碱性蛋白前体(proform of eosinphil major basic protein, proMBP)组成的异构聚合体。PAPP-A是早 孕时筛査唐氏综合征的敏感指标，单项筛査唐氏综合征的检出率可达66%，若 与其他指标结合，检出率可更高。此外，PAPP-A在心血管疾病的诊断和预后方 面也具有一定价值，可作为急性冠脉综合征的血清标记物，并可作为怀疑心肌 梗死而肌钙蛋白阴性患者发生心肌缺血事件及血运重建的预测标记物。大分子蛋白抗原的酶联免疫检测方法，常选择针对同一抗原上.不同抗原定 簇的两株单抗， 一株用于捕获标本中的抗原成分， 一株用作标记抗体，通过双 抗体夹心法的原理检测抗原成分。在检测PAPP-A的方法中，此种检测方法作为 抗体反应的两个抗原位点空间距离较近，而针对给两个抗原位点的两珠抗体均 为大分子蛋白，在抗原抗体反应时，会产生空间位阻效应，不同程度地影响检 测方法特异性及灵敏性。发明内容本发明所要解决的技术问题在于提供一种妊剩目关血浆蛋白A的检测方 法，在抗原抗体反应时，由于产生的空间位阻效应小，可提高检测方法的特异 性及灵敏性。为解决上述技术问题，本发明提供一种妊糾目关血浆蛋白A的检测方法， 检测标本中妊糾目关血浆蛋白A以PAPP-A/proMBP复合物的形式存在，通过 针对不同抗原的两抹抗体检测PAPP-A抗原分子， 一抹为作为捕获抗体的 PAPP-A特异性抗体，所述PAPP-A特异性抗体包被固相载，结合标本中的 PAPP-A抗原分子； 一抹为使用抗嗜伊红主要碱性蛋白前体抗体作为检测抗体， 用于结合标记物，经底物显色进行定量测定。与现有技术相比较，本发明to^目关血浆蛋白A的检测方法采用配对抗体 的方法，以PAPP-A作为抗原分子，釆用抗PAPP-A特异性抗体作为捕获抗体， 釆用抗嗜伊红主要碱性蛋白前体作为检测体。由于与该配对抗体反应的两个抗 原位点空间距离较远，可以最大程度地减少空间位阻效应，进而提高检测方法 的特异性及灵敏性。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下通过实施例对 本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解 释本发明，并不用于限定本发明。下面为本发明^^目关血浆蛋白A的检测方法的一较佳实施例，已知人体 血液中，PAPP-A以PAPP-A/proMBP复合物的形式存在。才艮据PAPP-A的这种 生物特性，针对不同抗原的两林抗体检测PAPP-A抗原分子， 一抹是PAPP-A 特异性抗体，作为捕获抗体，用于包被固相载，结合标本中的抗原成分；另一 株使用抗嗜伊红主要碱性蛋白前体(ProMBP)抗体作为检测抗体，检测抗体可以 标记酶、荧光素、放射性核素、化学发光物等，根据不同的标记物，使用其配套仪器定量检测标本中的PAPP-A含量。上述妊糾目关血浆蛋白A的检测方法引入了抗嗜伊红主要碱性蛋白前体， proMBP抗体与一抹抗PAPP-A特异抗体配对以检测血液标本中的妊斜目关血 浆蛋白A。标本中的妊斜目关血浆蛋白A以PAPP-A/proMBP复合物的形式存 在，通过针对该复合物两个不同抗原的两抹抗体检测PAPP-A抗原分子， 一抹 抗PAPP-A特异性抗体作为捕获抗体，所述抗PAPP-A特异性抗体用于包被固 相载体，结合标本中的PAPP-A抗原分子； 一抹使用抗嗜伊红主要碱性蛋白前 体抗体作为检测抗体，所述检测抗体才示j己上标i己物。上述采用配对抗体的方法，由于与该配对抗体反应的两个抗原位点空间距 离较远，可以最大程度地减少空间位阻效应，进而提高检测方法的特异性及灵 敏性。下面以ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay )双抗体夹心、法检测 血清(或血浆)中PAPP-A浓度为例，其检测原理为将抗PAPP-A特异性抗体 吸附于固相载体，加入含PAPP-A的待检标本与之结合，温育后洗涤，加入辣 根过氧化酶(HRP)标记的抗ProMBP酶标抗体，经底物显色进行测定。具体步 骤为1. 包被用包被液将抗PAPP-A抗体稀释至包被浓度，按100ul/孔(lml=1000ul)加入酶标板孔，保持4。C的温度包被过夜。2. 洗板弃去孔内液体，加入使用0.05%Tween-20 (也称Polyethylene glycol sorbitan monolaurate，中文名为吐温-20)的磷酸盐洗涤液(约280-300ul/ 孑U ,漂洗2-3次，每次0.5画lmin;3. 封闭按200-250ui/孔加入0.5。/o小牛血清白蛋白封闭液，室温时封闭2-3 小时或3"C时封闭1-2小时，也可在4。C时封闭过夜，然后弃去孔内封 闭液；4. 样品处理将待检样品l: 20稀释；5. 标准液准备标准液，并将标准液稀释至所需浓度；6. 加样在上述制备的酶标板孔中按排列顺序依次加入50-100ul/孔稀IW 的标准液、处理过的待检样品、质控品，3"C孵育60分钟；7. 洗板与上述步骤2相同；8. 加抗ProMBP酶标抗体，按50-100ul/孔加入最佳稀释浓度的酶标抗体， 室温或3"C下孵育1小时；9. 洗板与上述步骤2相同；10. 加底物液显色，3。C下放20分钟。11. 加2 mol/L H2S04(硫酸)终止液200ul。 使用酶标仪于450nm处测，根据标准曲线，计算标本PAPP-A的浓度。 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明 的保护范围之内。
权利要求
1、一种妊娠相关血浆蛋白A的检测方法，检测标本中妊娠相关血浆蛋白A以PAPP-A/proMBP复合物的形式存在，通过针对不同抗原的两株抗体检测PAPP-A抗原分子，一株为作为捕获抗体的PAPP-A特异性抗体，所述PAPP-A特异性抗体包被固相载，结合标本中的PAPP-A抗原分子；一株为使用抗嗜伊红主要碱性蛋白前体抗体作为检测抗体，用于结合标记物，经底物显色进行定量测定。
2、 如权利要求1所述的妊剩目关血浆蛋白A的检测方法，其特征在于， 所述标记物为酶、荧光素、放射性核素、化学发光物，通过不同的标记物使用 配套仪器，进而定量检测标本中的PAPP-A含量。
3、 如权利要求1或2所述的 #^目关血浆蛋白A的检测方法，其特征在 于，所述检测方法为双抗体夹心法检测血清或血浆中PAPP-A浓度的方法，将 抗PAPP-A特异性抗体吸附于固相载，加入含PAPP-A的待检标本与之结合， 温育后洗涤，加入辣根过氧化酶或其他标记物标记的抗ProMBP标记抗体，经 底物显色进4亍定量测定。
4、 如权利要求3所述的妊糾目关血浆蛋白A的检测方法，其特征在于， 用包被液将抗PAPP-A抗体进行稀释处理；冲洗并弃去孔内液体，加入磷酸盐 洗涤液，漂洗；加入小牛血清白蛋白封闭液，制备抗体结合的酶标板孔；将样 品及标准液进行处理；在酶标板孔中加入标准液、待检样品，进行孵育；冲洗 并弃去孔内液体，加入磷酸盐洗涤液，漂洗；加抗ProMBP酶标抗体，进行孵 育；沖洗并弃去孔内液体，加入磷酸盐洗涤液，漂洗；加底物液显色。
5、 如权利要求4所述的妊糾目关血浆蛋白A的检测方法，其特征在于， 用包被液将抗PAPP-A抗体进行稀释处理后，按100ul/孔加入酶标板孔，并保 持4。C的温度包被过夜。
6、 如权利要求4所述的妊糾目关血浆蛋白A的检测方法，其特征在于，所述磷酸盐洗涤液为使用0.05%Tween-20的磷酸盐洗涤液。
7、 如权利要求4所述的衽糾目关血浆蛋白A的检测方法，其特征在于， 按200-250ul/孔加入0.5%小牛血清白蛋白封闭液，室温时封闭2-3小时或37°C 时封闭l-2小时，也可在4'C时封闭过夜，然后弃去孔内封闭液。
8、 如权利要求4所述的妊糾目关血浆蛋白A的检测方法，其特征在于， 加抗ProMBP酶标抗体时，按50-100ul/孔加入新鲜配制的酶标抗体，室温或37 。C下孵育1小时。
9、 如权利要求4所述的妊糾目关血浆蛋白A的检测方法，其特征在于， 加底物液显色后，加入石克酸终止液。
10、 如权利要求4所述的妊銜目关血浆蛋白A的检测方法，其特征在于， 使用酶标仪于450nm处测，才艮据标准曲线，计算标本PAPP-A的浓度。
全文摘要
本发明提供一种妊娠相关血浆蛋白A的检测方法，检测标本中妊娠相关血浆蛋白A以PAPP-A/proMBP复合物的形式存在，通过针对不同抗原的两株抗体检测PAPP-A抗原分子，一株为作为捕获抗体的PAPP-A特异性抗体，所述PAPP-A特异性抗体包被固相载，结合标本中的PAPP-A抗原分子；一株为使用抗嗜伊红主要碱性蛋白前体抗体作为检测抗体，用于结合标记物，经底物显色进行定量测定。本发明妊娠相关血浆蛋白A的检测方法，由于与该配对抗体反应的两个抗原位点空间距离较传统方法更远，可以减少空间位阻效应，进而提高检测方法的特异性及灵敏性，也更容易筛选相匹配的两珠抗体。
文档编号G01N33/72GK101231296SQ20071012460
公开日2008年7月30日 申请日期2007年11月16日 优先权日2007年11月16日
发明者欢 何, 刘志强, 曾序春, 牛向兰, 谷学英 申请人:深圳市人口和计划生育科学研究所