专利名称：调节细胞表面受体预防或减少炎症的方法
调节细胞表面受体预防或^4、炎症的方法 相关申请的交叉参考
本申请要求享有2006年1月10日申请的美国临时专利申请系列号 60/757,751的相关木J^，其内容并A^文作为参考。
背景技术：
据认为，哺乳动物口腔软组织显示出最早的炎症迹象。该炎症的总体低水 平，可导致牙龈炎和/或牙周炎。据认为，该炎症通常由，或者至少部分由口腔 细菌所弓(起的。此外，口腔组织炎症也能由夕卜禾存术、局部损伤、创伤、坏死、 不当口腔保健、或者各种系统源而引起。
通常认为，这些疾病和症状所涉及细胞成分包括上皮组织、牙龈成纤维细 胞和循环性白细胞，它们都在宿主对细菌产生病原因子的应答中起作用。这些 口腔感染所涉及的一些细菌病原是已知的，尽管许多的病原仍未知或仍不明确。 虽然某类细菌感染，通常是许多该类口腔疾病的发病原因，但是疾病状态或症 状的病理，却是由宿主应答所介导。使用抗菌剂可减少某口腔菌群，同时也可 使炎症减轻。然而，该方法也有缺点，因为该杀菌并不加以区分(有益口腔菌 和有害口腔菌都被杀灭)，而且该杀菌对剂量和时间敏感。
口腔组织的细菌感染可刺激宿主的免疫应答，并通过上调可导致重要组织 损伤的炎症介质而减缓治愈过程。这些代谢物作为主要介质而在牙龈炎、牙周 炎、骨髓炎、和其它炎症疾病中发生。
据报道炎症机理之一，是通过哺乳动物细胞^t膜受体介导。例如，toll-样 受俠"TLRs")是糖基化的跨膜蛋白，其一旦被配体诱导的寡聚化激活，将可在细 胞内弓l发免疫应答，并最终导致介导炎症状态的细胞因子、白介素和其它分子 的表达。
本领域需要用于这样的炎症效应诊断、治疗和预防的试剂和技术。
附图简述
图1是显示细胞表面与微生物接触的示意图。
图2显示了 toll-样受^(TLR)1,2,3，4,5，6,7和9的信号途径，以及各TLR调节 所产生的各种分子。
发明简述
本发明包括对口腔菌种进行区分，以确定该菌种是否为口腔有害的方法。 该方法包括将一种口腔菌的至少一株细菌或细菌某部位与牙龈细胞接触；然后 检测指示化合物是否存在。指示物质基本上不存在，表示该菌种无害。
本发明范围也包括确定试剂抗炎效果的方法。该方法包括将细胞与试剂在 有害菌或该菌某部位存在情况下进行撤虫，然后检测指示化合物是否存在。指 示物质基本上不存在，表示该试剂是抗炎剂。
发明详述
本发明提供了 (1)区分有害菌和有益口腔菌的方法，禾B (2)确定特定试 齐哳炎效果的方法。本发明也提供了在细胞中用三氯生(triclosan)阻止toll-样受体
调节的方法。
本文所用盼'炎症'是指由组织损伤或破坏所弓i发的局部保护反应，其通常可 破坏、稀释或掩蔽损伤介质和受损组织。在急性症状中，它以疼痛、发热、红 肿和肿胀为特征。在组织学上，炎症涉及一系列复杂事件，包括随着渗透压和 血流的增加，小动脉、毛细管和小静脉膨胀；含血浆蛋白的流体渗出，以及白 细胞至炎症位点迁移。炎症可相应于，促炎细胞介质或诸如抗原抗体相互作用 或抗原与敏化淋巴细胞间作用所释放的物质的水平增加。广而言之，抗炎剂是 与不用试剂处理的同样细胞相比，其可M^这些细胞组织效应的性质和/或程度 的任何试剂。
一方面，本发明提供了评估细菌的特定种或株，以确定该种或株是否为口 腔有害的方法。"有害"，它意味着病原菌，其存在可通过所感染细胞产生炎症 介质。 一些细菌椒种据报道是有害的，包括下文表I所示
表l:据，艮道有害的口腔菌_
戈氏放线菌(A g饥"C—
内氏放线菌l(A "ae血"t&' 内氏方文线菌2(A "a&y/w2(iz7 2)
小韦荣球菌(PT戸簡/fl)_
驗链球斷幽)_
P腔链球斷.omfo)_
牙龈二氧4七碳嗜纤维菌(C. g&g/wfo)_
，二氧化碳噬纤维菌(C. ^^&朋《_
具核;1^杆菌具核亚禾中(^^ "MC/o/ft/附M "Mcfe"似附)
具核梭杆菌多型亚禾中(F做c/e^謂&y ; o/，o一扁) 牙周梭杆菌(F pm'(%/o"ft-a^)
中间普雷 夭菌(P /wte，g(i/a)_
连翘坦纳菌(7:/，—_
口颊纤毛菌(丄.^cc"fo)_
粘膜奈瑟氏菌(A^ ,cora)
痤疫丙酸杆斷"譜)_
产黑色素普雷沃菌(户膨/朋/"ogewzca)
有毒月单胞菌(S"CTC—_
本方法包括将待测口腔菌种或菌株的至少一个细菌，与至少一个牙龈细胞 接触。可选地，将牙龈细胞与细菌某部位，细胞膜，胞浆物，细菌代谢物、终 产物或副产物，和/或毒力因子接触。
该步骤可体外进行，例如，维持培养细菌或细菌某组成部位及牙龈细胞， 然后将该培养物予以组合。可选地，将细菌培养物以合适递送载体施用于口腔， 从而将该接触在体内进行。
在该接触之后，检测一种或多种指示剂物质。这样的指示剂包括常规宿主 免疫应答过程所产生的已知或待发现的任何物质，其包括涉及在细胞产生细胞 因子和其它促炎介质过程中的中间化合物，酶，蛋白，RNAs， DNAs，和其它
分子。，地，指示剂是由任何toll-样受体(例如如图2所示)，诸如包括TLRs 2,3， 4， 5,7,和9调节所产生的那些指示剂物质；NFk-B途径的好，细胞因子， 白介素(例如1,6,8,12)，肿瘤坏死因子(TNF)，肽酶，以及白介素或TNF亚 单位和/或白介素、趋化因子(例如CCL5,CCL4,CCL3，和CC10)及基质金属蛋 白酶的编码mRNAs。
所选指示物质的检测，可用本领域己知或待发展的任何方式进行，并且该 检测可以是相对或者绝对的测量。检测可通过直接定量检测所选指示物质进行。 可iMk，检测可用其它检测系统间接检测完成，例如使用方謝性和/或荧光fei己， 抗体，特异性基因基因表iizK平的改变，mRNA分析，微阵列分析，禾口/或抗氧 化状态的改变。例如，如果该指示剂是一种酶，那么就可将该样品置于合适的 底物，然后检测该酶催化反应的终产物以确定该酶指示剂是否存在。在本发明 情况下，所选指示物质基本上不存在，意,该菌种/菌株无害，即其不以引发 任何促炎介质产生的方式影响细胞。
本发明也包括评估特定试剂抗炎能力或效果的方法，即，该试剂减少或消 除暴露于病原菌的组织中的炎症的能力。该方飽括对待观赋剂进行筛选。这 样的试剂可以是蛋白，肽，有机^T，无机^ ，或任何所述好的复合物。
在某些情况下，期望所选待测试剂在口腔环境中不显示显著的杀菌效应。 例如，该试剂可/AM示最小抑制浓度(MIC)为0，少于约5%，少于约10%，少 于约20%，以及少于约30%的物质中选取。
MC研究通常包括在合适的凝忡制备活性试剂溶液，以及溶液活性试剂 的后续系列稀释。将所选细菌的标准悬液(这可能是某个细菌范围，每种细菌 都有其特定生长和处理方案)，加至各浓度的稀释活性试剂中。细菌和活性试剂 在37。C和适宜^[牛下温育，典型地，温育48小时后检测细菌的生长。
MC研究对照，包括在任何所加溶剂或赋形剂缺乏情况下，监测细菌生长 的生长对照。其它对照，可监测实验所用介质的无菌状态。用于将活性试剂溶 解的溶剂对细菌的效应，是在该研究中包括的最后系列对照。
温育后，将培养皿置于微皿光谱光度计610nm处读数。以抑制细菌生长的 最低活性试齐嗨度，读取结果。在高话性浓度下，细菌将不会生长(显示出低 光密度读数)，在低活性浓度下，细菌则会扩增(显示出高光密度读数)。阻止 细菌生长的最低活性浓度，定义为MIC。对照应该为如下结果无菌介质无细菌生长
所监测细菌的生长一培养基显示出繁密的生长
用于溶解活性试齐啲输1J，不应抑制细菌(因为它们必须本质上无害)。 评估特定试剂抗炎能力或效果的方法，包括将细胞与病原菌或有害菌进4亍
接触的步骤。待接触细胞可以在体外或体内，可以是原核的或真核的，也可获
自细胞培养系或临床样品。
用于本方法的合适病原菌或有害菌，可包括以引发免疫应答的方式，影响
所选细胞的任何本领域已知或待发现的细菌。这样的细菌可以包括，例如上文
表I所示的那些。
评价特定试剂抗炎能力或效果的方法，也包括检测一种或多种指示化合物 是否存在的步骤。指示化合物及检测方法和体系，可以是任意上文所述的那些。
本发明也包括含有通过上文实验发现显示抗炎效应的试剂的口腔制齐IJ，以 及通过将口腔组织细胞与三氯生接触，阻止该口腔组织细胞上toll-样受体调节 的方法。
本发明也包括通过给组织以次-MC浓衝据次-MC浓度，施用化合物例如 三氯生，来M^、或预防口腔组织炎症的方法。
权利要求
1.区分口腔菌种的方法，该方法包括(a)将一种口腔菌的至少一种细菌或某细菌部位，与牙龈细胞接触；以及(b)检测指示化合物是否存在其中，指示剂基本上不存在表示该菌种无害。
2、 权利要求1的方法，其中牙龈细胞是在体外。
3、 权利要求l的方法，其中牙龈细胞是在哺乳动物的口腔原位。
4、 权利要求l的方法，其中指示剂选自toll-样受体调节所产生^^组成的组。
5、 权利要求1的方法，指示剂选自TLR2,TLR3和TLR4调节所产生^)^ 组成的组。
6、 权利要求l的方法，指示剂选自TLR5,TLR7和TLR9调节所产生舒组成的组。
7、 权利要求l的方法，其中指示剂选自NF-KB途径舒组成的组。
8、 权利要求l的方法，其中指示剂选自细胞因子和白介素组成的组。
9、 权利要求l的方法，其中指示剂选自IL-l,IL-6,IL-8,IL-12和TNF-a组成的组。
10、 权利要求l的方法，其中指示剂MJ:接检测。
11、 权利要求l的方法，其中指示剂被间接检测。
12、 权利要求l的方法，其中至少一种细菌获自临床样品。
13、 鉴定试剂抗炎效果的方法，该方法包括将细胞与i式剂在有害菌或该菌 某部位存在瞎况下进行接触，然后检测指示剂化合物是否存在，其中，指示剂基本上不存在表示该试剂是抗炎剂。
14、 权利要求13的方法，其中细胞是真核细胞。
15、 权利要求13的方法，其中细胞是原核细胞。
16、 权利要求13的方法，其中指示剂选自toll-样受体调节所产生^T组成的组。
17、 权利要求13的方法，其中指示剂选自TLR2,TLR3,TLR4,TLR5,TLR7和TLR9调节所产生分子组成的组。
18、 权利要求13的方法，其中指示剂选自NF-KB途径舒组成的组。
19、 权利要求13的方法，其中指示剂选自细胞因子和白介素组成的组。
20、 权利要求13的方法，其中指示剂选自IL-l, IL-6, IL-8， IL-12和TNF-a组成的组。
21、 权利要求13的方法，其中指示剂^T!tt:接检测。
22、 权利要求13的方法，其中所述试剂选自MIC约少于20X的试剂。
23、 aih哺乳动物口腔细胞中toll-样受体调节的方法，该方^括将受体 与三氯生接触。
24、 权利要求23的方法，其中所述细胞是牙龈细胞。
25、 权利要求23的方法，其中toll-样受体选自TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR7和TLR9。
26、 减少或预防口腔组织炎症的方法，该方&^括以一定浓度给口腔组织 施用含三氯生的组合物，以使对组织施用的三氯生达到次-MIC水平。
全文摘要
本发明包括区分口腔菌种，以确定该菌种是否口腔有害的方法。该方法包括将一种口腔菌的至少一株细菌或细菌某部位与牙龈细胞接触；然后检测指示化合物是否存在。指示物质基本上不存在，表示该菌种无害。本发明也包括鉴定试剂抗炎效果的方法。该方法包括将细胞与试剂在有害菌或该菌某部位存在情况下进行接触，然后检测指示化合物是否存在。指示物质基本上不存在，表示该试剂是抗炎剂。
文档编号G01N33/569GK101371141SQ200780002191
公开日2009年2月18日 申请日期2007年1月8日 优先权日2006年1月10日
发明者P·斯里尼瓦桑 申请人:高露洁-棕榄公司